Este protocolo presenta ensayos de citotoxicidad de uso común (ensayos Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red y MTT) adaptados para la evaluación de la citotoxicidad en líneas celulares de embrión de pez cebra (ZEM2S) e hígado (ZFL) en placas de 96 pocillos.
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Artículo de método
Ensayos de citotoxicidad con líneas celulares de pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
Las líneas celulares de peces se han utilizado cada vez más en estudios de ecotoxicidad, y los ensayos de citotoxicidad se han propuesto como métodos para predecir la toxicidad aguda de los peces. Por lo tanto, este protocolo presenta ensayos de citotoxicidad modificados para evaluar la viabilidad celular en líneas celulares de embrión de pez cebra (Danio rerio) (ZEM2S) e hígado (ZFL) en placas de 96 pocillos. Los criterios de valoración de citotoxicidad evaluados son la integridad mitocondrial (ensayos Alamar Blue [AB] y MTT), la integridad de la membrana a través de la actividad de la esterasa (ensayo CFDA-AM) y la integridad de la membrana lisosomal (ensayo Neutral Red [NR]). Después de la exposición de las sustancias de ensayo en una placa de 96 pocillos, se realizan los ensayos de citotoxicidad; aquí, AB y CFDA-AM se llevan a cabo simultáneamente, seguidos de NR en la misma placa, mientras que el ensayo MTT se realiza en una placa separada. Las lecturas para estos ensayos se toman por fluorescencia para AB y CFDA-AM, y absorbancia para MTT y NR. Los ensayos de citotoxicidad realizados con estas líneas celulares de peces se pueden utilizar para estudiar la toxicidad aguda de sustancias químicas en peces.
Introducción
Las sustancias químicas deben ser probadas en cuanto a su seguridad para la salud humana y el medio ambiente. Los biomarcadores moleculares y celulares se han considerado cada vez más en las evaluaciones de seguridad para predecir los efectos en los organismos vivos por parte de las agencias reguladoras y/o legislaciones (por ejemplo, REACH, OCDE, US EPA)1,2, ya que pueden preceder al resultado adverso in vivo (por ejemplo, alteración endocrina, respuesta inmunológica, toxicidad aguda, fototoxicidad)3,4,5,6,7
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Protocolo
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener la lista de materiales utilizados en este protocolo y la Tabla 1 para la composición de soluciones y medios utilizados en este protocolo.
1. Preparación de células ZFL y ZEM2S
- Comenzar con un matraz T75 de células ZFL o ZEM2S con 80% de confluencia, cultivadas en el medio completo respectivo a 28 °C sinCO2.
- Retirar el medio de cultivo del matraz y lavar las células añadiendo 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (0,01 M). Añadir 3 ml de tripsina 1x (0,05% v/v; 0,5 mM tripsina-EDTA) a los matrace....
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Resultados
La figura 3 muestra las placas de los ensayos AB, CFDA-AM, NR y MTT. Para el ensayo AB (Figura 3A), los pocillos en blanco y los pocillos sin células viables o con un número reducido de ellas muestran color azul y baja fluorescencia, mientras que los pocillos con un alto número de células viables son rosados y presentan altos valores de fluorescencia debido a la transformación de resazurina (AB) en resorufina (sustancia rosada) por las células viables. Para el e.......
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Discusión
Los ensayos de citotoxicidad son ampliamente utilizados para la evaluación de toxicidad in vitro, y este artículo del protocolo presenta cuatro ensayos de citotoxicidad comúnmente utilizados modificados para ser realizados en líneas celulares de pez cebra (es decir, densidad celular para placa de 96 pocillos, tiempo de incubación en el ensayo MTT, agotamiento de FBS durante la condición de exposición química y concentración máxima aceptable para el SC). Como estos ensayos cuantifican la citotoxicidad por diferen.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
En memoria del Dr. Márcio Lorencini, coautor de este trabajo, excelente investigador en el campo de la cosmética y dedicado a promover la investigación cosmética en Brasil. Los autores agradecen al Laboratorio Multiusuario del Departamento de Fisiología (UFPR) por la disponibilidad de equipos y por el apoyo financiero de la Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Enseñanza Superior (CAPES, Brasil) (Código de Finanzas 001) y del Grupo Boticario.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5-CFDA, AM (diacetato de 5-carboxifluoresceína, éster de acetoximetilo) | Invitrogen | C1345 | |
| Placa de cultivo celular, placa de 96 pocillos | Sarstedt | 83.3924 | Superficie: Estándar, base plana |
| DMEM | Gibco | 12800-017 | Polvo, alto contenido de glucosa, piruvato |
| FBS - Suero fetal bovino, calificado, regiones aprobadas por el USDA | Gibco | 12657-029 | |
| Mezcla de nutrientes F-12 de jamón, polvo | Gibco | 21700026 | Polvo |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Leibovitz's L-15 Medio | Gibco | 41300021 | Polvo |
| Neutro rojo | Sigma-Aldrich | N4638 | Polvo, Biorreactivo, apto para cultivo celular |
| Agitador orbital | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm de diámetro de rotación |
| Dulbeccos PBS (10X) con calcio y magnesio | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Resazurina sal sódica | Sigma-Aldrich | R7017 | Polvo, Biorreactivo, apto para cultivo celular |
| RPMI 1640 Medio | Gibco | 31800-014 | Polvo |
| Bicarbonato de sodio | Sigma-Aldrich | S5761 | Polvo, biorreactivo para biología molecular |
| Azul de tiazolilo Bromuro de tetrazolio 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Tinción azul de tripán (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Tripsina-EDTA (0,5%), rojo sin fenol | Línea celular Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S | ATCC | CRL-2147 | Esta línea celular fue amablemente donada por el Profesor Dr. Michael J. Carvan (Universidad de Wisconsin, Milwaukee, EE. UU.) |
| Línea celular ZFL | BCRJ | 256 |
Referencias
- ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
- Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from:
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Reimpresiones y permisos
