Disección de tejido pancreático para aislar células individuales viables

El adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC) es uno de^{los tipos de} cáncer más agresivos. La evidencia clínica apoya la idea de que el PDAC se desarrolla a partir de células del sistema exocrino, incluidas las células acinares, a lo largo de muchos años, impulsadas por mutaciones en el protooncogén KRAS².

Los tumores de páncreas incluyen muchos tipos de células diferentes, y se ha demostrado que las células malignas representan solo el 20%-50% de^{la masa} tumoral. Los diferentes tipos de células interactúan con las células epiteliales, apoyan su transformación y mejoran la formación y el crecimiento de tumores. Los eventos tempranos causan metaplasia acinar, que da lugar a lesiones microscópicas llamadas neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN), que en algunos casos pueden convertirse en PDAC⁴.

Existe una necesidad crítica de investigar estas interacciones y apuntar a las señales fundamentales. La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) es un método potente que revela la expresión génica con una resolución de una sola célula, rastreando así los cambios que experimentan las células epiteliales, lo que permite explorar el desarrollo del cáncer de páncreas.

La disección de tejidos y la digestión de células individuales es la primera etapa de un experimento scRNA-seq. Varios factores hacen que la digestión del tejido pancreático sea especialmente difícil: i) las células acinares representan más del 90% del páncreas y las células acinares contienen grandes cantidades de enzimas digestivas, incluidas proteasas y RNasas que reducen la calidad de las bibliotecas basadas en ARN; ii) las células acinares son muy sensibles y pueden lisarse si se utilizan protocolos normalizados; (iii) las células acinares expresan un pequeño número de genes a niveles muy altos. Por lo tanto, si estas células se lisan durante el experimento, esto puede contaminar el perfil de expresión génica observado de otras células; (iv) El tejido pancreático recuperado de los tumores es desmoplásico, lo que dificulta su disección sin dañar las células. Por lo tanto, aunque se requiere mantener una alta viabilidad de todos los tipos de células, el gran número y la sensibilidad de las células acinares añaden complejidad adicional. Estos factores imponen dificultades para lograr una suspensión unicelular que sea viable en más del 80% y no tenga grumos, como se requiere para los experimentos de scRNA-seq.

En este caso, desarrollamos un protocolo con tripsina C y colagenasa P, junto con una monitorización frecuente de los tejidos. Esto apoya la disociación a células individuales al tiempo que conserva una alta viabilidad para respaldar el éxito de los experimentos de scRNA-seq ^5,6.

El comité conjunto de ética (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales) de la Universidad Hebrea (Jerusalén, Israel) y el Centro Médico Hadassah (Jerusalén, Israel) aprobó el protocolo del estudio para el bienestar animal (MD-18-15417-5 "Dinámica tisular en el cáncer de páncreas en ratones"), y el protocolo presentado aquí cumplió con todas las regulaciones éticas relevantes para la experimentación e investigación con animales. La Universidad Hebrea es un instituto acreditado por la Asociación Internacional para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio.

NOTA: La cepa de ratón #007908, la cepa #019378 y la cepa #008179 se obtuvieron del laboratorio de Jackson. PRT (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-Cre^ER; Rosa26^LSL-tdTomato) se crearon cruzando las cepas anteriores. Para el estudio se utilizaron ratones de ambos sexos, entre 6 semanas y 15 meses de edad. El tamoxifeno se preparaba disolviendo el polvo en aceite de maíz. Ratones adultos (6-8 semanas de edad, hembras y machos) fueron inyectados con tamoxifeno por vía subcutánea en los días 0 y 2 a una dosis de 400 mg/kg y examinados dos veces por semana después de la inyección. No fue posible medir los tumores ya que estaban localizados internamente; Por lo tanto, se practicó la eutanasia si se observaban signos clínicos anormales según el protocolo ético. Los ratones fueron sacrificados en diferentes momentos después de la inducción con tamoxifeno, utilizando isoflurano y luxación cervical.

1. Disección pancreática

NOTA: Para obtener un rendimiento óptimo durante la extracción y para garantizar una buena viabilidad celular, es fundamental una disección rápida. Para acortar el tiempo requerido para el aislamiento del páncreas, todos los instrumentos y equipos deben estar listos en hielo antes de sacrificar al ratón.

1. Aplicar la eutanasia al ratón mediante asfixia con CO₂ y verificar mediante luxación cervical. A partir de este paso, todos los procedimientos deben realizarse con instrumentos de disección estériles.
2. Fije el ratón y rocíe el abdomen con etanol al 70%. Realice una incisión en forma de V de 2,5 cm en la zona genital con tijeras y fórceps y proceda hacia arriba para abrir completamente la cavidad abdominal.
3. Localiza el estómago en el lado izquierdo del ratón. Localiza el páncreas, que está cerca del bazo. Separe el páncreas del estómago y el duodeno con dos pinzas (sin desgarrar). Continúe y separe el páncreas del intestino delgado, el yeyuno y el íleon.
4. Mueva el páncreas hacia el lado derecho del ratón. Separe las conexiones restantes entre el páncreas y la cavidad torácica con pinzas para separar completamente el páncreas y el bazo adherido.
5. Retire el páncreas y extiéndalo para examinarlo en una placa de Petri con hielo.
   NOTA: Se debe tener cuidado durante este paso de extirpar solo el páncreas, y no eliminar el tejido graso mesentérico u otro tejido adyacente junto con el páncreas, para evitar la contaminación celular.

2. Disociación enzimática y mecánica del páncreas

1. Prepare los siguientes búferes con anticipación.
   1. Tampón de disociación 1: 4 mL de tripsina C + 6 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (ver Tabla 1) para cada muestra.
   2. Tampón de disociación 2: 9 mL de solución salina balanceada de Hanks (HBSS) 1x; albúmina sérica bovina (BSA) al 4%; 1 mL de colagenasa P (10 mg/mL); 200 μL de inhibidor de tripsina (10 mg/mL); y 200 μL de DNasa I (10 mg/mL) (ver Tabla 1).
   3. Tampón de lavado: 50 ml de HBSS 1x; 2 g de BSA; 1 mL de inhibidor de tripsina (10 mg/mL); y 1 mL de DNasa 1 (10 mg/mL).
   4. Solución de parada de actividad enzimática: HBSS 1x que contiene un 5% de suero fetal bovino (FBS) y 150 g de DNasa I (0,2 mg/mL).
2. Coloque el páncreas en un tubo de 50 ml sobre hielo. Enjuague el páncreas en FBS al 10% en HBSS 1x. El tejido graso flotará y el páncreas se hundirá. Esta es una manera fácil de visualizar y eliminar rápidamente el tejido adiposo blanco contaminante que aún está adherido al páncreas.
3. Transfiera el tejido pancreático del ratón a una placa de Petri estéril que contenga 5 ml de HBSS 1x en hielo. Cortar el páncreas en trozos pequeños de 1 a 3^mm3 con unas tijeras Noyes y un bisturí (Figura 2A). En caso de más de una muestra, las muestras deben mantenerse en hielo al 10% de FBS/HBSS 1x.
4. Transfiera los tejidos a un tubo centrífugo. Centrifugar a 350 x g a 4 °C durante 5 min. Aspire y deseche el sobrenadante para eliminar los fragmentos celulares y las células sanguíneas.
5. Resuspender las piezas en tampón de disociación 1 que contiene tripsina C-0,05% EDTA al 0,02% durante 10 min a 37 °C con agitación (180 rpm). Lavar inmediatamente con un 10% de medio de Eagle modificado de FBS/Dulbecco (DMEM). Centrifugar durante 5 min a 350 g a 4 °C.
6. Lavar de nuevo resuspendiendo el pellet en 10 ml de tampón de lavado y centrifugando a 350 x g durante 5 min a 4 °C antes del siguiente paso de disociación.
7. Incubar el páncreas en tampón de disociación 2 durante 15 min a 37 °C con agitación (180 rpm).
8. Después de 15 minutos, realice la disociación mecánica pipeteando vigorosamente los fragmentos pancreáticos hacia arriba y hacia abajo en pipetas estériles de tamaño decreciente (pipetas serológicas de 25, 10 y 5 ml) 10 veces y vuelva a llevar a 37 °C.
   1. Después de 5 minutos adicionales, repita la disociación mecánica y use microscopía óptica para monitorear la disociación de acuerdo con la cantidad de suspensión de una sola célula. Por lo general, si en esta etapa, menos del 90% de la suspensión consiste en células individuales aisladas, se necesita un tiempo de incubación más largo. Use azul de tripano para monitorear la viabilidad celular.
   2. Continuar con la incubación y tomar muestras para detectar la disociación cada 5 min.
      NOTA: El tiempo total de incubación depende del tejido y puede variar entre muestras. La incubación y la disociación tisular deben terminar cuando el 90% de las células se separan en células individuales o cuando se detecta una reducción de la viabilidad.
9. Después de que el tejido pancreático esté bien disociado (lo que corresponde a la desaparición de los fragmentos pancreáticos y al aumento de la turbidez de la solución) (Figura 2), detener la reacción enzimática lavando dos veces con la solución de parada de actividad enzimática durante 5 min a 4 °C. A partir de este paso, mantenga la suspensión celular en hielo.
10. Pase la suspensión celular a través de una malla de nailon de 70 μm y verifique la viabilidad celular bajo el microscopio. Los tamaños más pequeños de malla de nailon pueden reducir la viabilidad celular.
11. Vuelva a suspender y lave el gránulo con 5-10 ml de solución de lavado tamponada helada. Cuenta las celdas.
12. Si se observan varios glóbulos rojos, trátelos con un tampón de lisis de glóbulos rojos durante 2 minutos a temperatura ambiente. En los casos en que se observen grumos, la muestra debe tratarse de nuevo con tripsina, como se describe en el paso 2.5. La viabilidad se detecta con azul de tripano bajo el microscopio, y si la viabilidad es inferior al 80%, las células vivas deben aislarse utilizando el kit de eliminación de células muertas de clasificación celular activada magnéticamente (MACS) con columnas MACS MS (ver Tabla 1).

En un trabajo publicado recientemente5, aplicamos el protocolo descrito anteriormente para explorar las primeras etapas del desarrollo de PDAC utilizando un modelo de ratón. El ratón fue modificado genéticamente para incluir los casetes Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7, que permiten la expresión de KRAS constitutivamente activo en células acinares después de la inyección de tamoxifeno.

Después de la luxación cervical (según el protocolo ético del ratón), se resecó el páncreas y se aplicó el protocolo descrito anteriormente (ver Figura 1 y Protocolo).

Para optimizar el protocolo de disociación, la disociación se realizó con o sin preincubación del tejido con tripsina C. Se encontró que la preincubación con tripsina C aceleró la disociación sin afectar la viabilidad. Además, se probaron diferentes colagenasas, incluyendo colagenasa D, colagenasa 1a y colagenasa P, (ver Tabla 1). Se encontró que el uso de colagenasa D resultó en muerte celular masiva y, de hecho, en otros estudios que utilizaron esta colagenasa, la fracción de células acinares fue muy pequeña8. El uso de colagenasa 1a tampoco proporcionó los resultados esperados, ya que incluso después de una incubación de 90 min con colagenasa 1a, el tejido no se disoció. Solo la colagenasa P nos permitió disociar el tejido y mantener una alta viabilidad de todos los tipos celulares.

Estos experimentos se repitieron en siete momentos diferentes después de la inyección de tamoxifeno. Simultáneamente con la metaplasia acinar-ductal y la formación de lesiones PanIN, hubo una acumulación de células estromales e inmunitarias, incluidos fibroblastos, y el tejido se volvió desmoplásico y rígido. Los diferentes momentos posteriores a la inyección de tamoxifeno nos permitieron examinar el protocolo en varios estados tisulares diferentes y medir la recuperación de las células epiteliales, estromales e inmunitarias.

En la Figura 2A se muestra una foto de un ratón y en la Figura 2C se muestra el páncreas aislado, un tejido esponjoso. El color rojo del tejido es el resultado de la expresión de tdTomato en las células acinares. El protocolo se utilizó con éxito con todos los estados tisulares y con muestras humanas. Sin embargo, los tiempos de incubación con tripsina y colagenasa pueden variar. Por lo tanto, es importante monitorear la muestra y observar la disociación del tejido y la viabilidad celular cada pocos minutos bajo el microscopio. En una etapa temprana del protocolo de disociación, había un bajo número de células aisladas y un gran número de grupos (Figura 2D, izquierda). Nuestro objetivo era conseguir células viables aisladas, como se muestra en la Figura 2D, en el centro, y evitar una reducción en el número de células viables (Figura 2D, derecha).

Es importante tener en cuenta que los tiempos de incubación más largos redujeron la viabilidad de las células. A partir de un tejido de 0,5 x 10cm3 de tamaño, recuperamos un total de 5 x 106 células, de las cuales 5 x 105 eran células tdTomato positivas. De acuerdo con el análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en la Figura 3, nuestro protocolo de disociación del páncreas apoya la recuperación de múltiples tipos de células, incluidas las células acinares, las células ductales, las células endoteliales, los fibroblastos, las células inmunitarias y los pericitos con alta viabilidad. Sin embargo, la relación real entre el número de células de cada tipo en el tejido antes de la disociación puede ser diferente, lo que se infiere de las imágenes de fluorescencia de las secciones congeladas pancreáticas que incluyen células positivas para tdTomato (Figura 2E). La alta viabilidad lograda con el protocolo detallado anteriormente se muestra mediante el análisis FACS (Figura 3) y el recuento de células vivas/células muertas realizado con un hemocitómetro (Figura 3H).

Para cada muestra, realizamos scRNA-seq y, de acuerdo con el análisis FACS, confirmamos la detección de todos los tipos celulares mencionados anteriormente (Figura 4A,B), en cada uno de los tejidos resecados de todos los puntos temporales posteriores a la inyección de tamoxifeno. También examinamos la expresión de la carboxipeptidasa 1 (Cpa1), que codifica la carboxipeptidasa1. La expresión de Cpa1 en las células acinares es extremadamente alta y puede indicar hasta qué punto las células acinares fueron lisadas durante la disociación, así como el grado en que han contaminado el transcriptoma de otros tipos celulares. Se detectó una contaminación mínima, como se puede ver en la Figura 4C,D. La disociación suave también da como resultado una alta viabilidad que nos permite hacer un seguimiento con la clasificación celular de los tipos celulares deseados para experimentos adicionales (Figura 3).

En conjunto, la calidad del protocolo de disociación es compatible con diferentes experimentos de seguimiento, incluida la secuenciación de scRNA.

Figura 1: Esquema del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Aislamiento de células pancreáticas. (A) Una foto que muestre el páncreas (en rojo), el hígado y el bazo del ratón después de abrir completamente la cavidad abdominal. (B) El mismo ratón que en (A) después de la extirpación del páncreas. (C) La disección del páncreas. El páncreas después de la extracción del animal (izquierda). El páncreas después de dividirse en pedazos pequeños (centro). Separación de fases después de la centrifugación (derecha). (D) Monitoreo de las células bajo el microscopio para examinar la viabilidad de una sola célula. Aislamiento total de células pancreáticas primarias (20x). Grupos de células después de 15 minutos de reacción enzimática (izquierda). Suspensión unicelular después de 25 min de reacción enzimática (medio). Reducción de la viabilidad celular después de una larga incubación (derecha). (E) Imágenes de fluorescencia de una sección pancreática congelada. Las células acinares son tdTomato positivas; Tinción DAPI en azul (foto a 40x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis FACS de la suspensión unicelular del cáncer de páncreas . (A) Células positivas y negativas de tdTomato . (B) Citometría de flujo de células acinares no clasificadas (rojas) versus clasificadas (azules). (C,F) Células no teñidas, APC y PB450. (D) Análisis de FACS después de la tinción con Anti-CD31, un marcador de células endoteliales. (E) Análisis de FACS después de la tinción con Anti-CD140b, un marcador de pericitos. (G) Análisis de FACS después de la tinción con Anti-CD11c, un marcador de células dendríticas y macrófagos. (H) Proporción de células vivas y células muertas en cuatro aislamientos diferentes de células del páncreas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis de los datos de scRNA-seq que se produjeron utilizando el protocolo que describimos en el presente artículo. (A) UMAP que muestra scRNA-seq de un páncreas de ratón en diferentes puntos de tiempo después de la inyección de tamoxifeno, como se indica en el lado derecho del panel. (B) Los tipos de células se determinaron en función de marcadores conocidos. (C,D) Las células se colorean de acuerdo con el nivel de expresión de Cpa1 (en C) o el nivel de tdTomato (en D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.