Disección de tejido pancreático para aislar células individuales viables

Resumen

Las células metaplásicas pancreáticas son precursoras de células malignas que dan lugar a tumores pancreáticos. Sin embargo, aislar células pancreáticas viables intactas es un desafío. Aquí, presentamos un método eficiente para la disociación del tejido pancreático. A continuación, las células pueden utilizarse para la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) o para el cocultivo bidimensional o tridimensional.

Resumen

El páncreas incluye dos sistemas principales: el sistema endocrino, que produce y secreta hormonas, y el sistema exocrino, que representa aproximadamente el 90% del páncreas e incluye células que producen y secretan enzimas digestivas. Las enzimas digestivas se producen en las células acinares pancreáticas, se almacenan en vesículas llamadas zimógenos y luego se liberan en el duodeno a través del conducto pancreático para iniciar los procesos metabólicos. Las enzimas producidas por las células acinares pueden matar células o degradar el ARN libre de células. Además, las células acinares son frágiles, y los protocolos de disociación comunes dan como resultado un gran número de células muertas y proteasas y RNasas libres de células. Por lo tanto, uno de los mayores desafíos en la digestión del tejido pancreático es recuperar las células intactas y viables, especialmente las células acinares. El protocolo presentado en este artículo muestra un método de dos pasos que desarrollamos para satisfacer esta necesidad. El protocolo se puede utilizar para digerir el páncreas normal, el páncreas que incluye lesiones premalignas o los tumores pancreáticos que incluyen un gran número de células estromales e inmunitarias.

Introducción

El adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC) es uno de^{los tipos de} cáncer más agresivos. La evidencia clínica apoya la idea de que el PDAC se desarrolla a partir de células del sistema exocrino, incluidas las células acinares, a lo largo de muchos años, impulsadas por mutaciones en el protooncogén KRAS².

Los tumores de páncreas incluyen muchos tipos de células diferentes, y se ha demostrado que las células malignas representan solo el 20%-50% de^{la masa} tumoral. Los diferentes tipos de células interactúan con las células epiteliales, apoyan su transformación y mejoran la formación y el crecimiento de tumores. Los eventos tempranos causan metaplasia acinar, que da lugar a lesiones microscópicas llamadas neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN), que en algunos casos pueden convertirse en PDAC⁴.

Existe una necesidad crítica de investigar estas interacciones y apuntar a las señales fundamentales. La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) es un método potente que revela la expresión génica con una resolución de una sola célula, rastreando así los cambios que experimentan las células epiteliales, lo que permite explorar el desarrollo del cáncer de páncreas.

La disección de tejidos y la digestión de células individuales es la primera etapa de un experimento scRNA-seq. Varios factores hacen que la digestión del tejido pancreático sea especialmente difícil: i) las células acinares representan más del 90% del páncreas y las células acinares contienen grandes cantidades de enzimas digestivas, incluidas proteasas y RNasas que reducen la calidad de las bibliotecas basadas en ARN; ii) las células acinares son muy sensibles y pueden lisarse si se utilizan protocolos normalizados; (iii) las células acinares expresan un pequeño número de genes a niveles muy altos. Por lo tanto, si estas células se lisan durante el experimento, esto puede contaminar el perfil de expresión génica observado de otras células; (iv) El tejido pancreático recuperado de los tumores es desmoplásico, lo que dificulta su disección sin dañar las células. Por lo tanto, aunque se requiere mantener una alta viabilidad de todos los tipos de células, el gran número y la sensibilidad de las células acinares añaden complejidad adicional. Estos factores imponen dificultades para lograr una suspensión unicelular que sea viable en más del 80% y no tenga grumos, como se requiere para los experimentos de scRNA-seq.

En este caso, desarrollamos un protocolo con tripsina C y colagenasa P, junto con una monitorización frecuente de los tejidos. Esto apoya la disociación a células individuales al tiempo que conserva una alta viabilidad para respaldar el éxito de los experimentos de scRNA-seq ^5,6.

Protocolo

El comité conjunto de ética (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales) de la Universidad Hebrea (Jerusalén, Israel) y el Centro Médico Hadassah (Jerusalén, Israel) aprobó el protocolo del estudio para el bienestar animal (MD-18-15417-5 "Dinámica tisular en el cáncer de páncreas en ratones"), y el protocolo presentado aquí cumplió con todas las regulaciones éticas relevantes para la experimentación e investigación con animales. La Universidad Hebrea es un instituto acreditado por la Asociación Internacional para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio.

NOTA: La cepa de ratón #007908, la cepa #019378 y la cepa #008179 se obtuvieron del laboratorio de Jackson. PRT (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-Cre^ER; Rosa26^LSL-tdTomato) se crearon cruzando las cepas anteriores. Para el estudio se utilizaron ratones de ambos sexos, entre 6 semanas y 15 meses de edad. El tamoxifeno se preparaba disolviendo el polvo en aceite de maíz. Ratones adultos (6-8 semanas de edad, hembras y machos) fueron inyectados con tamoxifeno por vía subcutánea en los días 0 y 2 a una dosis de 400 mg/kg y examinados dos veces por semana después de la inyección. No fue posible medir los tumores ya que estaban localizados internamente; Por lo tanto, se practicó la eutanasia si se observaban signos clínicos anormales según el protocolo ético. Los ratones fueron sacrificados en diferentes momentos después de la inducción con tamoxifeno, utilizando isoflurano y luxación cervical.

1. Disección pancreática

NOTA: Para obtener un rendimiento óptimo durante la extracción y para garantizar una buena viabilidad celular, es fundamental una disección rápida. Para acortar el tiempo requerido para el aislamiento del páncreas, todos los instrumentos y equipos deben estar listos en hielo antes de sacrificar al ratón.

1. Aplicar la eutanasia al ratón mediante asfixia con CO₂ y verificar mediante luxación cervical. A partir de este paso, todos los procedimientos deben realizarse con instrumentos de disección estériles.
2. Fije el ratón y rocíe el abdomen con etanol al 70%. Realice una incisión en forma de V de 2,5 cm en la zona genital con tijeras y fórceps y proceda hacia arriba para abrir completamente la cavidad abdominal.
3. Localiza el estómago en el lado izquierdo del ratón. Localiza el páncreas, que está cerca del bazo. Separe el páncreas del estómago y el duodeno con dos pinzas (sin desgarrar). Continúe y separe el páncreas del intestino delgado, el yeyuno y el íleon.
4. Mueva el páncreas hacia el lado derecho del ratón. Separe las conexiones restantes entre el páncreas y la cavidad torácica con pinzas para separar completamente el páncreas y el bazo adherido.
5. Retire el páncreas y extiéndalo para examinarlo en una placa de Petri con hielo.
   NOTA: Se debe tener cuidado durante este paso de extirpar solo el páncreas, y no eliminar el tejido graso mesentérico u otro tejido adyacente junto con el páncreas, para evitar la contaminación celular.

2. Disociación enzimática y mecánica del páncreas

1. Prepare los siguientes búferes con anticipación.
   1. Tampón de disociación 1: 4 mL de tripsina C + 6 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (ver Tabla 1) para cada muestra.
   2. Tampón de disociación 2: 9 mL de solución salina balanceada de Hanks (HBSS) 1x; albúmina sérica bovina (BSA) al 4%; 1 mL de colagenasa P (10 mg/mL); 200 μL de inhibidor de tripsina (10 mg/mL); y 200 μL de DNasa I (10 mg/mL) (ver Tabla 1).
   3. Tampón de lavado: 50 ml de HBSS 1x; 2 g de BSA; 1 mL de inhibidor de tripsina (10 mg/mL); y 1 mL de DNasa 1 (10 mg/mL).
   4. Solución de parada de actividad enzimática: HBSS 1x que contiene un 5% de suero fetal bovino (FBS) y 150 g de DNasa I (0,2 mg/mL).
2. Coloque el páncreas en un tubo de 50 ml sobre hielo. Enjuague el páncreas en FBS al 10% en HBSS 1x. El tejido graso flotará y el páncreas se hundirá. Esta es una manera fácil de visualizar y eliminar rápidamente el tejido adiposo blanco contaminante que aún está adherido al páncreas.
3. Transfiera el tejido pancreático del ratón a una placa de Petri estéril que contenga 5 ml de HBSS 1x en hielo. Cortar el páncreas en trozos pequeños de 1 a 3^mm3 con unas tijeras Noyes y un bisturí (Figura 2A). En caso de más de una muestra, las muestras deben mantenerse en hielo al 10% de FBS/HBSS 1x.
4. Transfiera los tejidos a un tubo centrífugo. Centrifugar a 350 x g a 4 °C durante 5 min. Aspire y deseche el sobrenadante para eliminar los fragmentos celulares y las células sanguíneas.
5. Resuspender las piezas en tampón de disociación 1 que contiene tripsina C-0,05% EDTA al 0,02% durante 10 min a 37 °C con agitación (180 rpm). Lavar inmediatamente con un 10% de medio de Eagle modificado de FBS/Dulbecco (DMEM). Centrifugar durante 5 min a 350 g a 4 °C.
6. Lavar de nuevo resuspendiendo el pellet en 10 ml de tampón de lavado y centrifugando a 350 x g durante 5 min a 4 °C antes del siguiente paso de disociación.
7. Incubar el páncreas en tampón de disociación 2 durante 15 min a 37 °C con agitación (180 rpm).
8. Después de 15 minutos, realice la disociación mecánica pipeteando vigorosamente los fragmentos pancreáticos hacia arriba y hacia abajo en pipetas estériles de tamaño decreciente (pipetas serológicas de 25, 10 y 5 ml) 10 veces y vuelva a llevar a 37 °C.
   1. Después de 5 minutos adicionales, repita la disociación mecánica y use microscopía óptica para monitorear la disociación de acuerdo con la cantidad de suspensión de una sola célula. Por lo general, si en esta etapa, menos del 90% de la suspensión consiste en células individuales aisladas, se necesita un tiempo de incubación más largo. Use azul de tripano para monitorear la viabilidad celular.
   2. Continuar con la incubación y tomar muestras para detectar la disociación cada 5 min.
      NOTA: El tiempo total de incubación depende del tejido y puede variar entre muestras. La incubación y la disociación tisular deben terminar cuando el 90% de las células se separan en células individuales o cuando se detecta una reducción de la viabilidad.
9. Después de que el tejido pancreático esté bien disociado (lo que corresponde a la desaparición de los fragmentos pancreáticos y al aumento de la turbidez de la solución) (Figura 2), detener la reacción enzimática lavando dos veces con la solución de parada de actividad enzimática durante 5 min a 4 °C. A partir de este paso, mantenga la suspensión celular en hielo.
10. Pase la suspensión celular a través de una malla de nailon de 70 μm y verifique la viabilidad celular bajo el microscopio. Los tamaños más pequeños de malla de nailon pueden reducir la viabilidad celular.
11. Vuelva a suspender y lave el gránulo con 5-10 ml de solución de lavado tamponada helada. Cuenta las celdas.
12. Si se observan varios glóbulos rojos, trátelos con un tampón de lisis de glóbulos rojos durante 2 minutos a temperatura ambiente. En los casos en que se observen grumos, la muestra debe tratarse de nuevo con tripsina, como se describe en el paso 2.5. La viabilidad se detecta con azul de tripano bajo el microscopio, y si la viabilidad es inferior al 80%, las células vivas deben aislarse utilizando el kit de eliminación de células muertas de clasificación celular activada magnéticamente (MACS) con columnas MACS MS (ver Tabla 1).

Resultados

En un trabajo publicado recientemente⁵, aplicamos el protocolo descrito anteriormente para explorar las primeras etapas del desarrollo de PDAC utilizando un modelo de ratón. El ratón fue modificado genéticamente para incluir los casetes Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato⁷, que permiten la expresión de KRAS constitutivamente activo en células acinares después de la inyección de tamoxifeno.

Después...

Discusión

En este artículo, presentamos un protocolo para la disociación del tejido pancreático. El protocolo es simple, fácil de usar y proporciona una herramienta para aislar células individuales viables del tejido pancreático en diferentes etapas durante el proceso de malignidad, incluidos los tumores sólidos. En estudios previos, se utilizaron diferentes tipos de colagenasas para digerir el páncreas ^8,9. El uso de una colagenasa muy potente, como la colagenasa D, da co...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo o Recurso
70 µ m malla de nylon	Gato Corning	##431751
Gato BSA	Sigma Aldrich	# A7906
Colagenasa P	Gato Roche	# 11213857001
Ensayo
DAPI	Sigma Aldrich	gato#MBD0015
Gato Dnase I	Roche	# 10104159001
Modelos Experimentales: Organismos/ Cepas
Suero fetal bovino ThermoFisher sudamericano	Cat	#10270106
Solución salina equilibrada de Hanks	Industrias biológicas	cat#02-018-1A
KRASLSL-G12D ratones	Jackson Laboratory	JAX008179
MACS kit de eliminación de células muertas	Milteny Biotec	cat#130-090-101
PBS	Industrias biológicas	cat#02-023-1A
Ptf1a-CreER ratones	Laboratorio Jackson	JAX019378
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomate ratones	Laboratorio Jackson	JAX007908
Tripsina C-EDTA 0.05%	Industrias biológicas	cat# 03-053-1A Tripsina
inhibidor	Roche	gato#T6522