Artículo de método

Determinación de la inmunogenicidad de la vacuna utilizando células dendríticas derivadas de monocitos bovinos

DOI:

10.3791/64874

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19 de mayo de 2023

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1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

En este artículo

Resumen

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La metodología describe la generación de células dendríticas derivadas de monocitos bovinos (MoDC) y su aplicación para la evaluación in vitro de candidatos antigénicos durante el desarrollo de posibles vacunas veterinarias en bovinos.

Resumen

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Las células dendríticas (DC) son las células presentadoras de antígeno (APC) más potentes dentro del sistema inmunitario. Patrullan el organismo en busca de patógenos y desempeñan un papel único dentro del sistema inmune al vincular las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Estas células pueden fagocitar y luego presentar antígenos capturados a las células inmunes efectoras, desencadenando una amplia gama de respuestas inmunes. Este documento demuestra un método estandarizado para la generación in vitro de células dendríticas derivadas de monocitos bovinos (MoDC) aisladas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de ganado y su aplicación en la evaluación de la inmunogenicidad de la vacuna.

Se utilizó la clasificación celular magnética para aislar monocitos CD14+ de PBMC, y se utilizó la suplementación de medio de cultivo completo con interleucina (IL)-4 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) para inducir la diferenciación de monocitos CD14+ en MoDC naïve. La generación de MoDC inmaduros se confirmó mediante la detección de la expresión de marcadores de superficie celular del complejo mayor de histocompatibilidad II (MHC II), CD86 y CD40. Se utilizó una vacuna contra la rabia disponible comercialmente para pulsar los MoDC inmaduros, que posteriormente se cocultivaron con linfocitos naïve.

El análisis de citometría de flujo de las MoDC pulsadas por antígeno y el cocultivo de linfocitos reveló la estimulación de la proliferación de linfocitos T a través de la expresión de marcadores Ki-67, CD25, CD4 y CD8. El análisis de la expresión de ARNm de IFN-γ y Ki-67, utilizando PCR cuantitativa, mostró que los MoDCs podrían inducir el cebado específico de antígeno de linfocitos en este sistema de cocultivo in vitro . Además, la secreción de IFN-γ evaluada mediante ELISA mostró un título significativamente mayor (**p < 0,01) en el cocultivo de linfocitos MoDC pulsado por la vacuna antirrábica que en el cocultivo de linfocitos MoDC sin antígeno. Estos resultados muestran la validez de este ensayo in vitro MoDC para medir la inmunogenicidad de la vacuna, lo que significa que este ensayo se puede utilizar para identificar posibles candidatos a vacunas para el ganado antes de proceder con ensayos in vivo , así como en evaluaciones de inmunogenicidad de vacunas comerciales.

Introducción

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La vacunación veterinaria representa un aspecto crucial de la cría y la salud de los animales, ya que contribuye a mejorar la seguridad alimentaria y el bienestar animal al conferir protección contra las enfermedades que afectan al sector ganadero a nivel mundial1. Un método in vitro eficaz para evaluar la inmunogenicidad de posibles vacunas candidatas ayudaría a acelerar el proceso de desarrollo y producción de vacunas. Por lo tanto, es necesario ampliar el campo de los ensayos inmunes con metodologías innovadoras basadas en estudios in vitro , ya que esto ayudaría a revelar la complejidad de los procesos inmunes relacionados con la inmunización y la infección por patógenos. Actualmente, la inmunización animal in vivo y los estudios de provocación, que requieren muestreos periódicos (por ejemplo, sangre y bazo), se utilizan para medir la inmunogenicidad de las vacunas candidatas y los adyuvantes. Estos ensayos son costosos, requieren mucho tiempo y tienen implicaciones éticas, porque en la mayoría de los casos, la eutanasia animal se lleva a cabo al final de los ensayos.

Como alternativa a los ensayos in vivo, se han utilizado células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para evaluar las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna in vitro2. Las PBMC son una población heterogénea de células compuestas por 70%-90% de linfocitos, 10%-20% de monocitos y un número limitado de células dendríticas (DC, 1%-2%)3. Las PBMC albergan células presentadoras de antígeno (APC) como células B, monocitos y DC, que patrullan constantemente el organismo en busca de signos de infección o daño tisular. Las quimiocinas secretadas localmente facilitan el reclutamiento y la activación de APC en estos sitios al unirse a los receptores de la superficie celular. En el caso de los monocitos, las quimiocinas dirigen su destino para diferenciarse en CD o macrófagos4. Tan pronto como las CD encuentran y capturan un patógeno, migran a órganos linfoides secundarios, donde pueden presentar los antígenos peptídicos patógenos procesados utilizando proteínas de superficie de clase I o clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) a las células T CD8+ o a las células T CD4+, respectivamente, desencadenando así una respuesta inmune 5,6.

El papel clave desempeñado por las CD en la orquestación de una respuesta inmune protectora contra diversos patógenos las convierte en un objetivo de investigación interesante para comprender los mecanismos inmunes intracelulares, especialmente cuando se diseñan vacunas y adyuvantes contra agentes infecciosos7. Dado que la fracción de CD que se puede obtener de PBMC es bastante pequeña (1% -2%), los monocitos se han utilizado para generar DC in vitro8. Estas CD derivadas de monocitos (MoDC) se desarrollaron inicialmente como una posible estrategia de tratamiento en la inmunoterapia contra el cáncer9. Más recientemente, los MoDC se han utilizado para la investigación de vacunas 10,11,12, y los monocitos clásicos son el subtipo predominante (89%) para la producción de MoDC 13. La producción de MoDCs in vitro se ha logrado previamente mediante la adición de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) administrado en combinación con otras citocinas como la interleucina-4 (IL-4), el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) o IL-1314,15,16.

El éxito de un ensayo in vitro de MoDC depende de la capacidad de los MoDC maduros estimulados por antígeno para modular el alcance y el tipo de respuesta inmune específica para el tipo de antígeno detectado17. El tipo de patógeno reconocido y presentado por los MoDC determina la diferenciación de las células CD4+ T auxiliares (Th) en células efectoras Th1, Th2 o Th17 y se caracteriza por un perfil de citoquinas secretoras específicas del patógeno. Se provoca una respuesta Th1 contra patógenos intracelulares y da como resultado la secreción de interferón-gamma (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral beta (TNF-β), que modula la protección dependiente fagocítica. Una respuesta Th2 se desencadena contra organismos parásitos y se caracteriza por la secreción de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, que inicia la protección humoral independiente fagocítica. Th17 ofrece protección dependiente de neutrófilos contra infecciones bacterianas y fúngicas extracelulares mediadas por la secreción de IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 y TNF-α 18,19,20,21. Sobre la base de estudios previos, se ha observado que no todos los patógenos caen dentro del perfil de citoquinas esperado. Por ejemplo, las MoDC dérmicas, en respuesta a la infección parasitaria por Leishmania, estimulan la secreción de IFN-γ de las células T CD4+ y las células T CD8+, induciendo así una respuesta Th1 proinflamatoriaprotectora 22.

También se ha demostrado que, en pollos MoDCs preparados con lipopolisacárido de Salmonella (LPS), pueden inducir una respuesta variable contra Salmonella typhimurium activando las respuestas Th1 y Th2, mientras que Salmonella gallinarum induce una respuesta Th2 sola, lo que podría explicar la mayor resistencia de este último hacia el aclaramiento de MoDC23. La activación de MoDCs contra Brucella canis (B. canis) también ha sido reportada tanto en MoDCs caninos como humanos, lo que significa que esto podría representar un mecanismo de infección zoonótica24. Las MoDC humanas preparadas con B. canis inducen una fuerte respuesta Th1 que confiere resistencia a la infección grave, mientras que las MoDC caninas inducen una respuesta Th17 dominante con una respuesta Th1 reducida, lo que posteriormente conduce al establecimiento de una infección crónica25. Los MoCD bovinos muestran una mayor afinidad por el virus de la fiebre aftosa (FMDV) conjugado con inmunoglobulina G (IgG) en comparación con el FMDV no conjugado solo, ya que los MoDC forman un complejo de anticuerpos virales en respuesta a los10 primeros. Tomados en conjunto, estos estudios muestran cómo se han utilizado los MoDC para analizar la complejidad de las respuestas inmunes durante la infección por patógenos. Las respuestas inmunes adaptativas pueden evaluarse mediante la cuantificación de marcadores específicos asociados con la proliferación de linfocitos. Ki-67, una proteína intracelular detectada sólo en células en división, es considerada como un marcador confiable para estudios de proliferación26, y de manera similar, CD25 expresado en la superficie de las células T durante la fase tardía de activación corresponde a la proliferación de linfocitos27,28.

Este estudio demuestra un método estandarizado para la generación in vitro de MoCD de ganado vacuno seguido de su aplicación en un ensayo inmune in vitro utilizado para probar la inmunogenicidad de las vacunas. Se utilizó una vacuna antirrábica (VD) disponible comercialmente para validar la eficacia de este ensayo. La activación y proliferación de linfocitos T se midió mediante citometría de flujo, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) mediante el análisis de marcadores de activación celular bien establecidos como Ki-67 y CD25 y la secreción de IFN-γ 28,29,30,31. No se realizan ensayos experimentales en animales o humanos durante el ensayo del MoDC.

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Protocolo

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La extracción de sangre es realizada por un servicio veterinario certificado de acuerdo con las directrices éticas de la Agencia Austriaca de Salud y Seguridad Alimentaria (AGES) y de conformidad con las normas aceptadas de bienestar animal32. El estudio recibió la aprobación ética del Ministerio de Agricultura de Austria. El diseño experimental para la generación de MoDCs y su posterior aplicación se ilustra en la Figura 1.

1. Producción de modCD ingenuos

NOTA: Se obtuvieron muestras de sangre entera de un solo ternero libre de patógenos mediante punción de vena yugular con vacutainers heparinizados (se utilizaron ocho tubos de sangre de 9 ml para este estudio). Transporta la sangre en una nevera. Almacenar las muestras a 2-4 °C para su uso posterior, o procesarlas inmediatamente. Mantenga la sangre girando para evitar la coagulación de la sangre. Esterilizar los vacutainers con etanol al 70%. Todos los siguientes experimentos se realizaron con una muestra biológica y seis réplicas técnicas.

  1. Centrifugación por gradiente de densidad para aislar las PBMC de la sangre heparinizada
    1. Mezclar bien la sangre invirtiéndola 10x.
    2. Con una pipeta de 10 ml, transfiera 20 ml de sangre heparinizada a un tubo estéril de 50 ml y dilúyalo con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    3. Pipetear 15 ml de medio de aislamiento de linfocitos a un tubo estéril de 50 ml.
      NOTA: Permita que el medio aislante de linfocitos alcance la temperatura ambiente antes del pipeteo.
    4. Incline el tubo de 50 ml que contiene el medio de aislamiento de linfocitos a una posición de 45°. Apunte la punta de una pipeta de 25 ml perpendicularmente y coloque cuidadosamente los 30 ml de PBS en sangre sobre el medio de aislamiento de linfocitos, sin mezclar los dos. Muy lentamente, vuelva a colocar el tubo de 50 ml en posición vertical.
    5. Centrífuga a 800 × g durante 35 min a 20 °C con aceleración máxima y sin frenado (función de deceleración desactivada).
    6. Utilice una pipeta Pasteur para recoger la capa de PBMC (la capa blanca delgada justo después de la primera capa de plasma) y transfiérala a un nuevo tubo de 50 ml.
      NOTA: La centrifugación por gradiente de densidad separa la sangre entera en diferentes capas. Como resultado, los eritrocitos se asientan en la parte inferior como un gránulo, las células mononucleares (PBMC) se asientan en la capa de interfaz y el plasma forma la capa superior. Los granulocitos se encuentran entre el pellet y la capa de PBMC.
    7. Lave las PBMC cosechadas 2 veces agregando PBS hasta un volumen de 40 ml y mezclando bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 7 min con aceleración máxima y desaceleración máxima.
    8. Deseche el sobrenadante por decantación, resuspenda el pellet en 15 ml de 1x tampón de cloruro de amonio-potasio (ACK) e incube a temperatura ambiente durante 10-15 min.
      NOTA: No incubar por más de 15 min. El tampón ACK disponible comercialmente se utiliza para garantizar la lisis de los glóbulos rojos residuales (RBC) presentes en la fracción PBMC.
    9. Añadir PBS hasta un volumen de 40 ml y, a continuación, centrifugar a 500 × g y 4 °C durante 7 min con aceleración y desaceleración máximas.
    10. Desechar el sobrenadante por decantación y repetir el paso 1.1.9.
    11. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 ml de medio de cultivo completo (a temperatura ambiente).
      NOTA: El medio de cultivo completo está compuesto por medio de cultivo celular RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina.
  2. Separación magnética de las células CD14+/− de la población PBMC utilizando perlas magnéticas conjugadas CD14
    1. Contar las células con un contador celular hemocitómetro limpio utilizando 10 μL de suspensión celular mezclada con 10 μL de solución de azul de tripano (0,4%).
      NOTA: El colorante azul de tripano es un químico tóxico y potencialmente carcinógeno. Debe manipularse mientras se usa equipo de protección personal (EPP) para evitar el contacto, y los desechos deben desecharse en un contenedor hermético especializado en desechos tóxicos. Las células muertas aparecerán azules, mientras que las células vivas aparecerán claras bajo el microscopio.
    2. Centrifugar durante 7 min a 500 × g.
    3. Desechar el sobrenadante con una pipeta y resuspender el pellet en tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) utilizando un volumen de 40 μL por cada 1 × 107 células. Mezclar bien con una pipeta.
      NOTA: El tampón FACS está compuesto por 2% de FBS y 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) disuelto en PBS.
    4. Añadir 5 μL de tampón de microperlas CD14 por 1 × 107 células, y mezclar bien con una pipeta.
    5. Incubar durante 30 min a 4-8 °C para la selección positiva de monocitos bovinos CD14+ 33. Vórtice cada 15 min durante el período de incubación.
    6. Paso opcional (para análisis de citometría de flujo): Añadir 10 μL de anticuerpo de tinción CD14-FITC (isotiocianato de fluoresceína) con posterior incubación durante 15 min a 4-8 °C. Consulte el análisis de citometría de flujo en el paso 5 para obtener más detalles.
    7. Añadir 1 ml de tampón FACS y centrifugar durante 7 min a 500 × g.
    8. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μL de tampón FACS por 1 × 108 células.
    9. Inserte la columna de separación de células inmunomagnéticas en el separador (soporte de columna magnética) y coloque un tubo de recolección de 15 ml debajo de la salida de la columna para recoger el flujo.
    10. Lave la columna con 1 ml de tampón FACS desgasificado. Después del enjuague, reemplace el tubo usado de 15 ml por uno nuevo.
    11. Dejar pasar la suspensión celular (a partir del paso 1.2.8) a través de la columna pipeteando 1 × 108 celdas en 500 μL de tampón a la vez.
      NOTA: Preste atención a no generar burbujas de aire mientras mezcla las celdas antes de permitirlas pasar por la columna.
    12. Enjuague la columna 3 veces con 3 ml de tampón FACS desgasificado cada vez.
    13. Recoja el flujo y etiquete esta primera fracción eluyida como la fracción de células CD14− (PBMC menos monocitos CD14+ ); Esto también se denomina fracción de linfocitos naïve.
      NOTA: Las células CD14− se mantienen en un medio de cultivo completo hasta que se producen las MoDC pulsadas por antígeno.
    14. Retire la columna del separador.
    15. Coloque un nuevo tubo estéril de 15 ml debajo de la columna para la recolección del efluente.
    16. Pipetear 5 ml de tampón FACS en la columna e inmediatamente empujarlo a través de un émbolo.
    17. Recoja el flujo y etiquete esta segunda fracción eluyida como la fracción de células CD14+ ; Esto también se llama fracción de monocitos ingenua.
    18. Agregue un medio de cultivo completo a los monocitos CD14+ cosechados para alcanzar 1 × 106 células/ml.
      NOTA: Cuente las células vivas en la fracción de células CD14+ eluyidas para estimar el volumen de medio de cultivo completo requerido para alcanzar el recuento de células deseado.
    19. Tome una placa estéril de 24 pocillos y agregue 1 ml de la suspensión celular (1 × 106 células/ml) a cada pocillo.
  3. Diferenciación de los monocitos naïve CD14+ en MoDCs naïve mediante la adición de un cóctel de citoquinas p/v al 3% (GM-CSF + IL-4) con un total de 5 días de incubación
    1. Complemente cada pocillo que contenga monocitos CD14+ con 40 μL (3% p/v) del cóctel de citoquinas proporcionado en el kit.
    2. Incubar la placa en una incubadora humidificada con 5% deCO2 y a 37 °C durante 48 h.
    3. El día 2, transferir la mitad del contenido de cada pocillo (500 μL) utilizando una pipeta a tubos individuales de 1,5 ml, y centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 7 min.
    4. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μL de medio de cultivo fresco completo.
    5. Transfiera 500 μL de esta suspensión celular del paso 1.3.4 a cada pocillo designado de modo que el volumen final sea de 1 ml.
    6. Enriquecer cada pocillo con 20 μL de cóctel de citoquinas.
    7. Incubar el cultivo durante 72 h en una incubadora humidificada con 5% deCO2 y a 37 °C.
    8. Después de la incubación el día 5, retire la placa de la incubadora.
      NOTA: Cada pocillo contendrá 1 ml de una suspensión celular de MoDC ingenuos. El número de MoDCs será un porcentaje (~20%) de los monocitos originales plateados (1 × 106/mL).

2. Ensayo de actividad endocítica MoDC

NOTA: El ensayo de captación de antígenos o el ensayo de actividad endocítica mide la capacidad de los MoDC ingenuos para internalizar material extraño. Realizar el ensayo utilizando MoDCs naïve cultivadas con cóctel de citoquinas al 3% p/v y con 5 días de incubación, como se describió anteriormente34.

  1. Recolecte la suspensión de células MoDC ingenua de la placa de 24 pocillos y transfiérala a un tubo de 15 ml; también recoja las células residuales enjuagando los pocillos con PBS.
  2. Centrífuga durante 500 × g durante 7 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo suplementado con FBS al 1%.
  3. Contar las células MoDC vivas para estimar el volumen de medio requerido para alcanzar el recuento de células deseado (2 × 105 células/ml).
  4. Cultivar las MoDC naïve en 100 μL de medio de cultivo completo en una placa de 24 pocillos con una concentración celular final de 2 × 105 células/ml.
  5. Complementar cada pocillo con 1 mg/ml de dextrano conjugado con FITC (sonda fluorescente utilizada como marcador de endocitosis).
    NOTA: El FITC-dextrano actúa como una sonda fluorescente y se utiliza como un trazador de endocitosis.
  6. Cubrir el plato e incubar en la oscuridad al 5% deCO2 y 37 °C durante 60 min.
    NOTA: Para el control de fondo, incubar las células MoDC adicionales (2 × 105 células/ml) con 1 mg/ml de FITC-dextrano en hielo, ya que este tipo de incubación impide la entrada de la molécula trazadora (FITC-dextrano) en las células.
  7. Después de la incubación, transfiera inmediatamente la placa de 24 pocillos en hielo para detener la endocitosis de FITC-dextrano.
  8. Lave las celdas con tampón FACS helado.
  9. Cosechar, centrifugar y resuspender el pellet en 500 μL de tampón FACS.
  10. Analizar la intensidad de fluorescencia del FITC-dextrano dentro de las células mediante citometría de flujo. Consulte el análisis por citometría de flujo en el paso 5.2 para obtener más información.

3. Generación de MoDCs pulsados por antígeno

NOTA: Una vacuna comercialmente disponible y clínicamente aprobada contra el virus de la rabia (VD) puede inducir la diferenciación de las MoDC naïve en MoDC portadoras de antígenos maduros. Use 0.1% (~ 1 μL) de una dosis única de vacunación contra el VD para generar MoDC pulsados por antígeno. Además, se prefiere producir MoDC pulsados por RV en la misma placa de cultivo utilizada (en el paso 1.3.8) para generar MoDC ingenuos porque la transferencia de los MoDC ingenuos a una nueva placa de 24 pocillos los afectará negativamente.

  1. A partir del paso 1.3.8) Añadir 1 μL/ml de suspensión del VD a 1 ml de cultivo de MoDC naïve en la placa de 24 pocillos e incubar durante 48 h al 5% deCO2 y 37 °C.
    NOTA: Los MoDC ingenuos cultivados sin estimulación del VD se utilizan como control de fondo (y como estimulación no específica para el cocultivo con linfocitos en los siguientes pasos).
  2. Después de la incubación, el día 7, mantenga la placa de 24 pocillos que contiene los MoDC pulsados por antígeno en hielo durante 10 minutos.
  3. Agregue 1 ml de PBS helado por pocillo. Mezclar bien cada pocillo mediante pipeteo y transferir la suspensión a un tubo de 15 ml.
  4. Lave los pocillos con 2 ml de PBS helado para recoger las células residuales que quedan dentro de cada pocillo.
  5. Transfiera el contenido a sus respectivos tubos y centrifugue la suspensión celular a 500 × g durante 7 min.
  6. Desechar el sobrenadante, resuspender el pellet celular (MoDC pulsadas por antígeno) en medio de cultivo completo y ajustar el volumen a una concentración celular final de 1 × 105 células/ml.
    NOTA: Cuente las células vivas para estimar el volumen de medio requerido para alcanzar el recuento de células deseado. Use MoDC pulsadas por RV desde el día 7 para el sistema de cocultivo de linfocitos MoDC.

4. Cocultivo de linfocitos MoDC

NOTA: El sistema de cocultivo de linfocitos MoDC in vitro determina la capacidad de los MoDC para preparar linfocitos específicos de antígeno. Los diferentes grupos de tratamiento de células después de 16 días de cocultivo incluyen específicos, no específicos y control. El grupo específico se define como linfocitos cocultivados con MoDC pulsados por RV; el grupo no específico se define como linfocitos cocultivados con MoCD no pulsadas por antígeno; y el grupo control se define como linfocitos cultivados sin MoDC.

  1. Añadir medio de cultivo completo a la fracción de linfocitos naïve eluyentes (células CD14− ) para alcanzar una concentración celular de 2 × 106 células/ml.
    NOTA: Cuente las células vivas en el cultivo celular CD14− que se han mantenido en medio de cultivo completo en una placa de 24 pocillos desde su recolección para estimar el volumen de medio requerido para alcanzar el recuento celular deseado.
  2. El día 7, tome una placa estéril de 24 pocillos y siembre los pocillos con 1 ml de suspensión de células linfocitarias naïve (2 × 106 células/ml) más 1 ml de suspensión de MoDC pulsada por antígeno o no pulsada por antígeno (1 × 105 células/ml).
    NOTA: El volumen total en cada pocillo será de 2 ml con una proporción de 1:20 MoDCs a linfocitos por pocillo.
  3. Incubar la placa durante 48 h a 37 °C y 5% deCO2.
  4. Enriquecimiento y reestimulación del cultivo con MoDC pulsados por antígeno
    1. Después de la incubación del cocultivo de linfocitos MoDC pulsados por antígeno, el día 9, complementar cada pocillo con 20 ng/ml de IL-2 recombinante y continuar incubando durante otras 120 h (5 días de incubación).
    2. El día 14, transferir 1 ml del cocultivo a un tubo estéril de 1,5 ml y centrifugar a 500 × g durante 7 min.
    3. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 1 ml de MoDC pulsadas o no pulsadas por antígeno (1 × 105 células/ml). Mezclar suavemente mediante pipeteo y transferir las suspensiones celulares a sus pozos designados.
      NOTA: En este paso, el volumen total en cada pocillo es de 2 ml.
    4. Continuar con la incubación al 5% deCO2 y 37 °C durante 48 h. Después de la incubación el día 16, el cocultivo está listo para el análisis mediante citometría de flujo, qPCR y ELISA.
      NOTA: Por cada 2 ml en cada pocillo del cocultivo de linfocitos MoDC, se tiñe 1 ml de células resuspendidas para citometría de flujo, 1 ml se usa para la extracción de ARN y los sobrenadantes de ambos se usan para ELISA.

5. Análisis citométrico de flujo

NOTA: Tiñe las células con marcadores apropiados/mAb antes de ejecutar las muestras en un citómetro de flujo. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los reactivos (mAb de tinción y controles de isotipo), el kit, el instrumento y el software utilizados para el análisis de citometría de flujo.

  1. Protocolo de tinción del citómetro de flujo
    NOTA: Realice la tinción de la superficie celular para las PBMC y los linfocitos y monocitos naïve utilizando anti-CD14 mAb (paso 1.2.6). Para la tinción de la superficie celular de MoDC ingenuas, use mAb anti-CD86-específico, anti-CD40-específico y anti-MHC II-específico. Para la tinción de la superficie celular de las células del día 16 cocultivos, use anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 mAbs; para la tinción intracelular, use anti-Ki-67 mAb. Además, tiñe las células con control de isotipo negativo mAb o sin mAb (FMO: fluorescente menos uno). La principal diferencia al teñir los marcadores superficiales e intracelulares es que para los marcadores de superficie celular, las células deben teñirse con mAb de superficie específica antes de la tinción viva / muerta (L / D) o cualquier otro proceso. Sin embargo, la tinción intracelular se realiza después de la tinción L / D y requiere un paso de fijación más permeabilización para permitir la penetración intracelular.
    1. Transfiera 1 ml de suspensión celular a un tubo estéril de 1,5 ml con una pipeta y centrifugar durante 10 minutos a 500 × g.
      NOTA: Después de la centrifugación, al procesar las células del cocultivo de linfocitos MoDC, guarde el sobrenadante para el análisis ELISA.
    2. Resuspender el pellet en 1 ml de PBS y transferirlo a un tubo de 15 ml. Recoja las células residuales usando 1 ml de PBS y combínelo con el pellet resuspendido.
    3. Añadir 10 ml de PBS al tubo de 15 ml que contiene las células, mezclar por pipeteo y centrifugar durante 7 min a 850 x g.
    4. Deseche el sobrenadante y repita el paso 5.1.3.
    5. Desechar el sobrenadante y resuspender cuidadosamente el pellet celular con la suspensión residual (aproximadamente 180 μL) que queda después de decantar el sobrenadante.
    6. Transfiera la suspensión celular a una placa de 96 pocillos con fondo en V y selle los pozos para evitar derrames.
    7. Centrifugar la placa a 1.400 × g durante 5 min. Después de la centrifugación, mueva la placa sobre un contenedor de residuos para vaciar los pocillos de líquido y golpee la placa con papel absorbente para garantizar la eliminación del exceso de líquido.
    8. Añadir 25 μL de mezcla maestra de tinción superficial por pocillo y mezclar suavemente con una pipeta, seguida de incubación a 4 °C durante 30 min.
      NOTA: Para preparar la mezcla maestra de tinción superficial para un solo pocillo, agregue 2,5 μL de mAb superficial a 20 μL de tampón FACS.
    9. Añadir 200 μL de tampón FACS por pocillo y centrifugar a 1.400 × g durante 5 min. Después de la centrifugación, vacíe los pocillos de líquido por decantación y golpee la placa con papel absorbente para eliminar el exceso de líquido.
    10. Añadir 100 μL de solución de tinción L/D por pocillo. Mezclar bien con una pipeta, seguida de la incubación a 4 °C durante 15 minutos en la oscuridad.
      NOTA: Para un solo pocillo, disuelva 0,25 μL de colorante L/D en 100 μL de tampón FACS. El tinte L/D ayuda a distinguir entre células vivas y muertas.
    11. Añadir 100 μL de tampón FACS. Cubra los pocillos con la tapa y centrifugue la placa durante 1.400 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa con papel absorbente.
    12. Repita el paso 5.1.11.
    13. Añadir 50 μL de solución de fijación por pocillo (suministrado con el kit) y mezclar con una pipeta antes de incubar la placa a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 min.
    14. Agregue 150 μL del tampón de permeabilización y lavado (PW) 1x provisto con el kit y cubra los pocillos con la tapa.
      NOTA: Para preparar 10 ml de 1x tampón PW, diluir 1 ml de tampón permanente 10x en 10 ml dedH2O.
    15. Centrifugar la placa a 1.400 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa con papel absorbente.
    16. Añadir 200 μL de 1x PW, seguido de centrifugación a 1.400 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa con papel absorbente.
    17. Para la tinción intracelular, agregue 25 μL de mezcla maestra de tinción intracelular (Ki-67 mAb antihumano) por pocillo. Mezclar bien e incubar el plato durante 30 min a 4 °C o en hielo en la oscuridad.
      NOTA: Para preparar la mezcla maestra de tinción intracelular para un solo pocillo, agregue 1 μL de Ki-67 mAb a 24 μL de 1x PW. El marcador de tinción intracelular se utiliza solo cuando se procesan células del cocultivo del día 16. La tinción intracelular no se realiza mientras se procesan PBMC, linfocitos naïve, monocitos y MoDC ingenuos.
    18. Después de la incubación, agregue 200 μL de 1x PW a cada pocillo. Mezclar con una pipeta y centrifugar durante 1.400 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa con papel absorbente.
    19. Añadir 200 μL de tampón FACS, seguido de centrifugación a 1.400 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee el plato sobre papel absorbente.
    20. Resuspender el pellet celular en 200 μL de tampón FACS y transferir el contenido de cada pocillo a tubos de citómetro de flujo estéril separados. Utilice 300 μL de tampón FACS por pocillo para recoger las células residuales. Las células ahora están listas para el análisis de citometría de flujo.
  2. Ejecución de la muestra en un citómetro de flujo
    NOTA: Las muestras se ejecutaron en un citómetro de flujo (utilizando láseres de 488 nm, 638 nm y 405 nm) de acuerdo con el manual del fabricante35. Consulte el manual para obtener más información, solución de problemas y personalización del protocolo.
    1. Realice procedimientos de limpieza de rutina antes y después de leer las muestras.
      NOTA: No se salte una posición mientras carga los tubos en el instrumento.
      1. Para el ciclo de limpieza, utilice un total de cuatro tubos, con el primer tubo que contiene el reactivo de limpieza de flujo y los tres tubos restantes que contienen dH2O; cada tubo tendrá 3 mL. Durante la ejecución de limpieza, adquiera datos con un caudal medio durante aproximadamente 1 minuto capturando 100.000 eventos por tubo por debajo de 330 V para dispersión directa (FSC) contra 265 V para dispersión lateral (SSC).
        NOTA: No se deben reportar residuos o eventos celulares durante la limpieza; Si esto sucede, vuelva a realizar el paso de limpieza. Para ejecutar las muestras, asegúrese de que todas las muestras estén en una suspensión homogénea antes de adquirir los datos, ya que esto garantiza una lectura precisa.
    2. Para conectar y encender el citómetro, haga clic en el botón Aplicación ubicado en la esquina izquierda de la barra de título. En el menú desplegable de la aplicación , seleccione la opción Citometría y haga clic en la opción Encender.
      NOTA: En el menú desplegable de la aplicación , la opción Abrir permite a los usuarios navegar a través de los ensayos preprogramados, mientras que la opción Nuevo protocolo permite a los usuarios crear nuevos protocolos.
    3. Cargue inicialmente la muestra de control negativo en el soporte multitubo. Seleccione Nuevo protocolo y observe la lista de trabajo en el lado izquierdo del espacio de trabajo /pantalla.
    4. En la lista de trabajo, defina la posición de la muestra en el soporte multitubo y asigne un nombre a la muestra y el protocolo para su identificación.
    5. Desde el panel de hardware ubicado en el lado izquierdo del espacio de trabajo, ajuste y seleccione múltiples parámetros, como los detectores (FSC, SSC y 10 rangos de fluorescencia), los voltajes (V ) y las ganancias de los fotomultiplicadores, y el área-altura-ancho (AHW) de la señal.
      NOTA: Los siguientes ajustes para los detectores se seleccionaron en función del experimento y el instrumento utilizado: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. Desde el Panel de control de adquisición de instrumentos situado debajo de la barra de título, ajuste las opciones de caudal (medio), Tiempo (5 min) y Eventos (consulte el paso 5.2.8) que desea detectar. Haga clic en la opción Adquirir Single para permitir que el instrumento dibuje/ejecute la muestra y muestre la vista previa en tiempo real de los eventos detectados.
    7. Desde la vista previa en tiempo real, ajuste el umbral de fluorescencia (voltaje y ganancia) y el tamaño de la celda para eventualmente dibujar puertas alrededor de la población celular deseada mientras excluye cualquier residuo celular.
      NOTA: FSC ayuda a distinguir las células en función del tamaño, lo que permite a los usuarios diferenciar entre las células del sistema inmune, como los monocitos y los linfocitos; los monocitos son más grandes y muestran una mayor intensidad de FSC en comparación con los linfocitos.
    8. Adquirir aproximadamente un total de 5.000 MoDC en vivo, 50.000 linfocitos vivos y 50.000 eventos de monocitos en vivo.
    9. Una vez ajustados todos los parámetros en referencia a la muestra de control negativo, haga clic en Detener y guarde el protocolo.
    10. Ahora cargue todas las muestras en el cargador multitubular. Defina cada muestra en la lista de trabajo y aplique los parámetros ajustados en referencia al control negativo a todas las muestras dentro del experimento. Haga clic en la opción Adquirir para permitir que todas las muestras del experimento se ejecuten consecutivamente.
    11. Una vez adquiridos los datos de todas las muestras, guardar y transformar en datos legibles utilizando un software de análisis de datos adecuado que permita la generación de histogramas biparamétricos y monoparamétricos secuenciales.

6. Análisis de expresión de ARN mensajero (ARNm)

  1. Extracción de ARN
    NOTA: Extraiga el ARN total del cocultivo de linfocitos MoDC pulsados por antígeno (específico), el cocultivo de linfocitos MoDC no pulsados con antígeno (no específico), el cultivo de linfocitos sin MoDC (control) y de linfocitos naïve (células CD14− aisladas antes del cocultivo). Para la extracción de ARN, prepare etanol con agua libre de RNasa. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el kit de extracción y los reactivos.
    1. Transfiera 1 ml de suspensión celular de la placa de cocultivo de linfocitos MoDC (~1 × 106 células/ml) a un tubo estéril estéril de 1,5 ml con una pipeta y centrifugar durante 10 min a 500 × g.
    2. Guarde el sobrenadante para ELISA. Resuspender el pellet celular en 1 ml de PBS y transferirlo a un tubo de 15 ml. Recoja cualquier célula residual usando 1 ml de PBS.
    3. Centrifugar durante 10 min a 500 × g.
      NOTA: Todas las muestras deben manipularse delicadamente como células vivas hasta que la lisis celular se lleve a cabo utilizando el tampón de lisis proporcionado en el kit. La muerte celular libera RNasas que hidrolizan rápidamente las plantillas de ARN necesarias para la cuantificación aguas abajo. El tampón RLT lisa las células en una solución que inhibe las RNasas.
    4. Agregue 350 μL de tampón de lisis a cada pocillo vacío e incube durante 2-3 minutos para lisar las células adherentes que no se cosecharon en los pasos anteriores.
    5. Una vez completada la centrifugación de la etapa 6.1.3, desechar el sobrenadante y combinar el pellet celular con los 350 μL de tampón de lisis añadidos en el paso 6.1.4.
      NOTA: En este punto, es posible almacenar los tubos a -80 °C o proceder con la extracción de ARN (siguiendo los pasos).
    6. Pipetear 350 μL de etanol al 70% al lisado en la etapa 6.1.5. El volumen final por muestra es de 700 μL.
    7. Inserte la columna de extracción dentro de un tubo de recolección de 2 ml (incluido con el kit).
    8. Transfiera los 700 μL de muestra por columna de extracción y centrifuga a 10.000 × g durante 15 s. Deseche el flujo en el tubo de recolección y vuelva a colocarlo en la columna de centrifugado.
    9. En la columna de extracción, agregue 350 μL de tampón de lavado estricto (incluido en el kit) y centrifugar a más de 10,000 × g durante 15 s. Deseche el flujo continuo.
    10. Añadir 80 μL de mezcla de incubación de DNasa I por muestra sobre la membrana de la columna de extracción y dejar reposar durante 15 min a 20-30 °C.
      NOTA: Para preparar la mezcla de incubación de DNasa I por muestra, agregue 10 μL de solución madre de DNasa I a 70 μL de tampón DNasa para un volumen final de 80 μL. Mezcle bien invirtiendo el tubo varias veces, seguido de un breve giro en la centrífuga.
    11. Lavar la columna de extracción con 350 μL de tampón de lavado estricto, seguido de centrifugación a 10.000 × g durante 15 min. Deseche el flujo en el tubo de recolección después de la centrifugación.
    12. Lavar la columna de extracción 2x con 500 μL de tampón de lavado suave cada vez y con centrifugación a 10.000 × g durante 15 s y una segunda vez durante 2 min. Deseche el flujo después de cada centrifugación.
    13. Centrifugar la columna a velocidad máxima durante 1 min para secar la membrana y desechar el tubo de recolección.
    14. Coloque la columna de extracción en un nuevo tubo de recolección de 1,5 ml.
    15. Pipetear 50 μL de agua libre de RNasa sobre la membrana de la columna e incubar durante 3-5 min a temperatura ambiente.
      NOTA: Para concentraciones de ARN inferiores a 100 ng, reducir el volumen de elución a 30 μL y volver a eluyir la membrana de la columna de extracción utilizando el producto de la primera elución para concentrar el producto final.
    16. Centrifugar a 10.000 × g durante 1 min para eluyir el ARN.
    17. Mida la concentración de ARN detectando la absorbancia a 260 nm utilizando 0,5-2 μL de muestra. Ajuste la concentración final de ARN a 0.1-1 μg/μL usando agua libre de RNasa.
    18. Conservar las alícuotas de ARN a −80 °C para su uso posterior.
  2. Síntesis de ADN complementario
    1. Sintetice ADN complementario (ADNc) a partir del ARN plantilla extraído de acuerdo con el protocolo del fabricante proporcionado con el kit (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
      NOTA: En la Tabla 1 y la Tabla 2 se muestra un resumen de los reactivos y los volúmenes utilizados. Un protocolo completo se detalla en el Archivo Suplementario 1.
  3. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real
    1. Para qPCR, ejecute las muestras de ADNc por triplicado. Cuantificar los niveles de transcripción del ARNm bovino para Ki-67 e IFN-γ utilizando conjuntos de cebadores específicos en referencia al gen GAPDH , como se muestra en la Tabla 3.
      NOTA: Un protocolo completo se detalla en el Archivo Suplementario 1.

7. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

  1. Procesar los sobrenadantes de cultivo recolectados ricos en proteínas secretoras para la cuantificación de IFN-γ a través de ELISA.
    NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el uso del kit. Un protocolo completo se detalla en el Archivo Suplementario 1.

8. Análisis estadístico

  1. Analizar los datos y hacer ilustraciones gráficas de diseño experimental utilizando software comercial. Utilice una prueba no paramétrica no pareada para el análisis comparativo. Considere que los valores de p < 0.05 son estadísticamente significativos.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta metodología describe la generación in vitro de MoDCs de ganado para la evaluación de antígenos vacunales candidatos antes de realizar estudios in vivo. La Figura 1 ilustra el esquema experimental de generación de MoDC bovino y la aplicación de los MoDC para el ensayo in vitro. Utilizando la técnica de clasificación celular de base magnética, fue posible recolectar aproximadamente 26 millones de miocitos CD14 + de las PBMC recolectadas, que previamen...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio demuestra un método in vitro estandarizado para generar y fenotipificar MoCD bovinos y su posterior uso en la medición de la inmunogenicidad de la vacuna de una vacuna comercial (por ejemplo, RV). Los MoDC bovinos se pueden utilizar como una herramienta para detectar posibles antígenos de vacunas contra enfermedades del ganado y predecir su posible impacto clínico en función de las respuestas inmunes antes de proceder a ensayos in vivo en animales. Los MoDCs generados fueron identificados e...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eveline Wodak y la Dra. Angelika Loistch (AGES) por su apoyo para determinar el estado de salud de los animales y por proporcionar BTV, al Dr. Bernhard Reinelt por proporcionar sangre bovina, y al Dr. Bharani Settypalli y al Dr. William Dundon del OIEA por su útil asesoramiento sobre los experimentos de PCR en tiempo real y la edición del idioma, respectivamente.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tampón de lisado ACKGibco, Thermo FisherA1049201tampón de amonio-cloruro y potasio para la lisis de glóbulos rojos residuales en PBMC cosechados Fracción
BD Vacutainer Tubos de heparinaBecton, Dickinson (BD) and Company36648010 mL, aditivo heparina sódica 158 unidades USP, tubo de vidrio, tamaño 16 x 100 mm
Kit de crecimiento de células dendríticas bovinasBio-Rad, Reino UnidoPBP015KZZCóctel de citoquinas compuesto por IL-4 bovino recombinante y GM-CSF
IFN-&gamma bovino; Kit ELISABio-RadMCA5638KZZKit para medir la expresión de IFN-y gamma; en el sobrenadante de cultivo
Anticuerpo CD14Bio-Rad MCA2678FAnticuerpo monoclonal antibovino CD14 de ratón, clon CC-G33, isotipo IgG1
Anticuerpo CD25Bio-RadMCA2430PEAnticuerpo monoclonal CD25 antibovino de ratón, clon IL-A11, isotipo IgG1
Anticuerpo CD4Bio-RadMCA1653A647Anticuerpo monoclonal CD4 antibovino de ratón, clon CC8, isotipo IgG2a
Anticuerpo CD40Bio-RadMCA2431FAnticuerpo monoclonal CD40 antibovino de ratón, clon IL-A156, isotipo IgG1
Anticuerpo CD8Bio-Rad MCA837FAnticuerpo monoclonal CD8 antibovino de ratón, clon CC63, isotipo IgG2a
Anticuerpo CD86Bio-RadMCA2437PEAnticuerpo monoclonal CD86 antibovino de ratón, clon IL-A190, isotipo IgG1
CFX96 Touch Sistema de detección de PCR en tiempo realBio-Rad-Termociclador Máquina de PCR
Tubo de centrífuga CorningFalcon Corning 352096 & 35207015 mL y 50 mL, fondo cónico de poypropileno de alta claridad, graduado, estéril, tapón de rosca de sellado, tubo de halcón
Cytofix/Cytoperm PlusBD Bio Sciences555028 Kit de fijación/permeabilización con BD golgiPlug, uso para la tinción de células con citómetro de flujo
EtanolSigma Aldrich1009832500Absolute para análisis EMSURE  ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Suero fetal bovino (FBS)Gibco, Thermo Fisher10500064calificada, inactivada por calor
PLUSGE Health care Life Sciences, EE. UU.341691Medio de aislamiento de linfocitos
FlowClean Agente de limpiezaBeckman Coulter, Ciencias de la VidaA64669500
mL FlowJoFlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, EE. UU.Citómetro de flujo Software de histograma
FlowTubes/ FACS  (Clasificación de una sola célula activada por fluorescencia) TuboFalcon Corning 3522355 mL, estéril, tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo con tapón a presión de filtro de células, uso en análisis de citometría de flujo
Fluoresceinisotiocynat-DextranSigma Aldrich, Alemania60842-46-8FITC-dextrano MW
Citómetro de flujo GalliosBeckman Coulter-Máquinacitómetro de flujo
Hard-Shell 96-Well Placas de PCR Bio-RadHSP960196 pocillos, de perfil bajo, de pared delgada, con faldón, blanco/transparente
Microperlas humanas CD14Miltenyi Bioteck, Alemania130-050-201Microperlas de 2 mL conjugadas con el isotipo IgG2a del anticuerpo CD14 humano monoclonal, utilizado para la selección de monocitos bovinos de PBMC
KaluzaBeckman Coulter,Alemania-Citómetroflujo software de análisis de datos multicolor
MACS ColumnMiltenyi Bioteck, Alemania130-042-401Clasificación de células activadas magnéticamente o columna de separación de células magenticas inmunitarias para la separación de varias poblaciones de células CD14 basadas en antígenos de superficie celular
MHC Clase II DQ DR Anticuerpo polimórficoBio-RadMCA2228Fratón anti-ovejas MHC Clase II DQ DR Polimórfico:FITC, clon 49.1, isotipo IgG2a, reactivo cruzado con bovino
Tubo de microcentrífugaSigma AldrichHS43251,5 mL, fondo cónico, graduado, tubo estéril
Microsoft Power PointMicrosoft-Lasilustraciones gráficas del diseño experimental
Ratón IgG1 Control negativo:FITC para CD14, CD40 AnticuerpoBio-RadMCA928FControl de isotipo CD14 y CD40 anticuerpo monoclonal  
Control negativo de IgG1 en ratón:PE para el anticuerpo CD86Bio-RadMCA928PEcontrol de isotipo anticuerpo monoclonal CD86 
Control negativo de IgG1 en ratón: RPE para el anticuerpo CD25Bio-RadMCA928PEcontrol de isotipo anticuerpo monoclonal CD25  
Control negativo de IgG2a en ratones:FITC para el anticuerpo MHC de clase IIBio-RadMCA929Fcontrol del isotipo para el anticuerpo monoclonal de clase II del MHC 
Nobivac RabiaMSD Salud Animal, UK-1y micro; L/mL de vacuna inactivada cultivada con células que contiene > cepa del virus de la rabia de 2 UI/ml
Sellos ópticosBi0-RadTCS0803tubo plano de PCR de 0,2 mL Tiras de 8 tapones, óptico, ultratransparente, compatible con máquina de qPCR
Penicilina-estreptomicinaGibco, Thermo Fisher15140122100 mL
tampón de fosfato solución salina (PBS)Gibco, Thermo Fisher10010023pH 7,4, concentración
1xPrisma - Software GraphPad 5 Dotmatics-Softwareestadístico
Anticuerpo antihumano Ki-67 purificadoBiolegend, EE. UU.350501Anticuerpo monoclonal, reactivo cruzado con vaca, clon Ki-67
Ratón purificado IgG1 k Isotipo Ctrl AnticuerpoBiolegend400101Control de isotipo para el anticuerpo monoclonal Ki-67
READIDROP Yoduro de propidioBD Bio Sciences1351101Marcador de células vivas/muertas utilizado para citometría de flujo, colorante reactivo a aminas
Proteína IL-2 humana recombinanteR& Sistema D, EE. UU.202-IL-010/CFInterleucina-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini KitQiagen74106Kit uso para la extracción de ARN total; Tampón RLT = tampón de lisis; Tampón RW1 = tampón de lavado estricto que contiene guanidina; Tampón RDD = Tampón DNasa; Tampón RPE = tampón de lavado suave; RNaseOUT = Inhibidor de la RNasa.
RPMI 1640 MediumSigma AldrichR8758Medios de cultivo celular con L-glutamina y bicarbonato de sodio
SMART-servier medical art Les Laboratories Servier-Licensedunder a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-52702x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymeras, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, colorantes de normalización ROX.
Sistema de síntesis de primera cadena SuperScript IIIInvitrogen, ThermoFisher 18080051 Kit para síntesis de ADNc
Placa de prueba de cultivo de tejidos 24TPP, Suiza92024Placa de 24 pocillos, esterilizada por radiación, crecimiento mejorado, tratado, volumen 3,18 mL
Solución de azul de tripanoGibco, Thermo Fisher152500610,4%, 100 mL, colorante para evaluar la viabilidad celular
Invitrogen de agua destilada ultrapura sin DNasa/RNasa, Thermo Fisher109770230.1 y micro; m agua destilada filtrada por membrana
VACUETTE Tubos de extracción de sangre con heparina Los tubos de extracción de sangre con heparinaThermo Fisher Scientific15206067VACUETTE tienen una parte superior verde y contienen heparina de litio, sodio o amonio secada por pulverización en las paredes internas y se utilizan en química clínica, inmunología y serología. El anticoagulante heparina activa la antitrombina, que bloquea la cascada de coagulación y, por lo tanto, produce una muestra de sangre o plasma completo.
WaterSigma AldrichW3500-1LFiltrado estéril, bioreactivo apto para el cultivo celular
Bio-Rad-Termociclador Placa Ficoll de de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502(2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424(2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214(2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72(2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215(2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112(2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
  36. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  37. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132(2020).
  38. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  39. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  40. Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369(2013).
  41. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  42. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  43. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  44. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  45. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  46. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  47. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  48. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  49. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252(2011).
  50. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092(2020).

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