Determinación de la inmunogenicidad de la vacuna utilizando células dendríticas derivadas de monocitos bovinos

Resumen

La metodología describe la generación de células dendríticas derivadas de monocitos bovinos (MoDC) y su aplicación para la evaluación in vitro de candidatos antigénicos durante el desarrollo de posibles vacunas veterinarias en bovinos.

Resumen

Las células dendríticas (DC) son las células presentadoras de antígeno (APC) más potentes dentro del sistema inmunitario. Patrullan el organismo en busca de patógenos y desempeñan un papel único dentro del sistema inmune al vincular las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Estas células pueden fagocitar y luego presentar antígenos capturados a las células inmunes efectoras, desencadenando una amplia gama de respuestas inmunes. Este documento demuestra un método estandarizado para la generación in vitro de células dendríticas derivadas de monocitos bovinos (MoDC) aisladas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de ganado y su aplicación en la evaluación de la inmunogenicidad de la vacuna.

Se utilizó la clasificación celular magnética para aislar monocitos CD14+ de PBMC, y se utilizó la suplementación de medio de cultivo completo con interleucina (IL)-4 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) para inducir la diferenciación de monocitos CD14⁺ en MoDC naïve. La generación de MoDC inmaduros se confirmó mediante la detección de la expresión de marcadores de superficie celular del complejo mayor de histocompatibilidad II (MHC II), CD86 y CD40. Se utilizó una vacuna contra la rabia disponible comercialmente para pulsar los MoDC inmaduros, que posteriormente se cocultivaron con linfocitos naïve.

El análisis de citometría de flujo de las MoDC pulsadas por antígeno y el cocultivo de linfocitos reveló la estimulación de la proliferación de linfocitos T a través de la expresión de marcadores Ki-67, CD25, CD4 y CD8. El análisis de la expresión de ARNm de IFN-γ y Ki-67, utilizando PCR cuantitativa, mostró que los MoDCs podrían inducir el cebado específico de antígeno de linfocitos en este sistema de cocultivo in vitro . Además, la secreción de IFN-γ evaluada mediante ELISA mostró un título significativamente mayor (**p < 0,01) en el cocultivo de linfocitos MoDC pulsado por la vacuna antirrábica que en el cocultivo de linfocitos MoDC sin antígeno. Estos resultados muestran la validez de este ensayo in vitro MoDC para medir la inmunogenicidad de la vacuna, lo que significa que este ensayo se puede utilizar para identificar posibles candidatos a vacunas para el ganado antes de proceder con ensayos in vivo , así como en evaluaciones de inmunogenicidad de vacunas comerciales.

Introducción

La vacunación veterinaria representa un aspecto crucial de la cría y la salud de los animales, ya que contribuye a mejorar la seguridad alimentaria y el bienestar animal al conferir protección contra las enfermedades que afectan al sector ganadero a nivel mundial¹. Un método in vitro eficaz para evaluar la inmunogenicidad de posibles vacunas candidatas ayudaría a acelerar el proceso de desarrollo y producción de vacunas. Por lo tanto, es necesario ampliar el campo de los ensayos inmunes con metodologías innovadoras basadas en estudios in vitro , ya que esto ayudaría a revelar la complejidad de los procesos inmunes relacionados....

Protocolo

La extracción de sangre es realizada por un servicio veterinario certificado de acuerdo con las directrices éticas de la Agencia Austriaca de Salud y Seguridad Alimentaria (AGES) y de conformidad con las normas aceptadas de bienestar animal³². El estudio recibió la aprobación ética del Ministerio de Agricultura de Austria. El diseño experimental para la generación de MoDCs y su posterior aplicación se ilustra en la Figura 1.

1. Producción de modCD ingenuos

NOTA: Se obtuvieron muestras de sangre entera de un solo ternero libre de patógenos median....

Resultados

Esta metodología describe la generación in vitro de MoDCs de ganado para la evaluación de antígenos vacunales candidatos antes de realizar estudios in vivo. La Figura 1 ilustra el esquema experimental de generación de MoDC bovino y la aplicación de los MoDC para el ensayo in vitro. Utilizando la técnica de clasificación celular de base magnética, fue posible recolectar aproximadamente 26 millones de miocitos CD14 ⁺ de las PBMC recolectadas, que previamen.......

Discusión

Este estudio demuestra un método in vitro estandarizado para generar y fenotipificar MoCD bovinos y su posterior uso en la medición de la inmunogenicidad de la vacuna de una vacuna comercial (por ejemplo, RV). Los MoDC bovinos se pueden utilizar como una herramienta para detectar posibles antígenos de vacunas contra enfermedades del ganado y predecir su posible impacto clínico en función de las respuestas inmunes antes de proceder a ensayos in vivo en animales. Los MoDCs generados fueron identificados e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tampón de lisado ACK	Gibco, Thermo Fisher	A1049201	tampón de amonio-cloruro y potasio para la lisis de glóbulos rojos residuales en PBMC cosechados Fracción
BD Vacutainer Tubos de heparina	Becton, Dickinson (BD) and Company	366480	10 mL, aditivo heparina sódica 158 unidades USP, tubo de vidrio, tamaño 16 x 100 mm
Kit de crecimiento de células dendríticas bovinas	Bio-Rad, Reino Unido	PBP015KZZ	Cóctel de citoquinas compuesto por IL-4 bovino recombinante y GM-CSF
IFN-&gamma bovino; Kit ELISA	Bio-Rad	MCA5638KZZ	Kit para medir la expresión de IFN-y gamma; en el sobrenadante de cultivo
Anticuerpo CD14	Bio-Rad MCA2678F		Anticuerpo monoclonal antibovino CD14 de ratón, clon CC-G33, isotipo IgG1
Anticuerpo CD25	Bio-Rad	MCA2430PE	Anticuerpo monoclonal CD25 antibovino de ratón, clon IL-A11, isotipo IgG1
Anticuerpo CD4	Bio-Rad	MCA1653A647	Anticuerpo monoclonal CD4 antibovino de ratón, clon CC8, isotipo IgG2a
Anticuerpo CD40	Bio-Rad	MCA2431F	Anticuerpo monoclonal CD40 antibovino de ratón, clon IL-A156, isotipo IgG1
Anticuerpo CD8	Bio-Rad MCA837F		Anticuerpo monoclonal CD8 antibovino de ratón, clon CC63, isotipo IgG2a
Anticuerpo CD86	Bio-Rad	MCA2437PE	Anticuerpo monoclonal CD86 antibovino de ratón, clon IL-A190, isotipo IgG1
CFX96 Touch Sistema de detección de PCR en tiempo real	Bio-Rad-Termociclador Máquina de PCR
Tubo de centrífuga Corning	Falcon Corning	352096 & 352070	15 mL y 50 mL, fondo cónico de poypropileno de alta claridad, graduado, estéril, tapón de rosca de sellado, tubo de halcón
Cytofix/Cytoperm Plus	BD Bio Sciences		555028 Kit de fijación/permeabilización con BD golgiPlug, uso para la tinción de células con citómetro de flujo
Etanol	Sigma Aldrich	1009832500	Absolute para análisis EMSURE  ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco, Thermo Fisher	10500064	calificada, inactivada por calor
PLUS	GE Health care Life Sciences, EE. UU.	341691	Medio de aislamiento de linfocitos
FlowClean Agente de limpieza	Beckman Coulter, Ciencias de la Vida	A64669	500
mL FlowJo	FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, EE. UU	.	Citómetro de flujo Software de histograma
FlowTubes/ FACS  (Clasificación de una sola célula activada por fluorescencia) Tubo	Falcon Corning	352235	5 mL, estéril, tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo con tapón a presión de filtro de células, uso en análisis de citometría de flujo
Fluoresceinisotiocynat-Dextran	Sigma Aldrich, Alemania	60842-46-8	FITC-dextrano MW
Citómetro de flujo Gallios	Beckman Coulter-Máquina		citómetro de flujo
Hard-Shell 96-Well Placas de PCR Bio-Rad		HSP9601	96 pocillos, de perfil bajo, de pared delgada, con faldón, blanco/transparente
Microperlas humanas CD14	Miltenyi Bioteck, Alemania	130-050-201	Microperlas de 2 mL conjugadas con el isotipo IgG2a del anticuerpo CD14 humano monoclonal, utilizado para la selección de monocitos bovinos de PBMC
Kaluza	Beckman Coulter,	Alemania-Citómetro	flujo software de análisis de datos multicolor
MACS Column	Miltenyi Bioteck, Alemania	130-042-401	Clasificación de células activadas magnéticamente o columna de separación de células magenticas inmunitarias para la separación de varias poblaciones de células CD14 basadas en antígenos de superficie celular
MHC Clase II DQ DR Anticuerpo polimórfico	Bio-Rad	MCA2228F	ratón anti-ovejas MHC Clase II DQ DR Polimórfico:FITC, clon 49.1, isotipo IgG2a, reactivo cruzado con bovino
Tubo de microcentrífuga	Sigma Aldrich	HS4325	1,5 mL, fondo cónico, graduado, tubo estéril
Microsoft Power Point		Microsoft-Las	ilustraciones gráficas del diseño experimental
Ratón IgG1 Control negativo:FITC para CD14, CD40 Anticuerpo	Bio-Rad	MCA928F	Control de isotipo CD14 y CD40 anticuerpo monoclonal
Control negativo de IgG1 en ratón:PE para el anticuerpo CD86	Bio-Rad	MCA928PE	control de isotipo anticuerpo monoclonal CD86
Control negativo de IgG1 en ratón: RPE para el anticuerpo CD25	Bio-Rad	MCA928PE	control de isotipo anticuerpo monoclonal CD25
Control negativo de IgG2a en ratones:FITC para el anticuerpo MHC de clase II	Bio-Rad	MCA929F	control del isotipo para el anticuerpo monoclonal de clase II del MHC
Nobivac Rabia	MSD Salud Animal, UK-1		y micro; L/mL de vacuna inactivada cultivada con células que contiene > cepa del virus de la rabia de 2 UI/ml
Sellos ópticos	Bi0-Rad	TCS0803	tubo plano de PCR de 0,2 mL Tiras de 8 tapones, óptico, ultratransparente, compatible con máquina de qPCR
Penicilina-estreptomicina	Gibco, Thermo Fisher	15140122	100 mL
tampón de fosfato solución salina (PBS)	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7,4, concentración
1xPrisma - Software GraphPad 5	Dotmatics-Software		estadístico
Anticuerpo antihumano Ki-67 purificado	Biolegend, EE. UU.	350501	Anticuerpo monoclonal, reactivo cruzado con vaca, clon Ki-67
Ratón purificado IgG1 k Isotipo Ctrl Anticuerpo	Biolegend	400101	Control de isotipo para el anticuerpo monoclonal Ki-67
READIDROP Yoduro de propidio	BD Bio Sciences	1351101	Marcador de células vivas/muertas utilizado para citometría de flujo, colorante reactivo a aminas
Proteína IL-2 humana recombinante	R& Sistema D, EE. UU.	202-IL-010/CF	Interleucina-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	Kit uso para la extracción de ARN total; Tampón RLT = tampón de lisis; Tampón RW1 = tampón de lavado estricto que contiene guanidina; Tampón RDD = Tampón DNasa; Tampón RPE = tampón de lavado suave; RNaseOUT = Inhibidor de la RNasa.
RPMI 1640 Medium	Sigma Aldrich	R8758	Medios de cultivo celular con L-glutamina y bicarbonato de sodio
SMART-servier medical art	Les Laboratories Servier-Licensed		under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5270	2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymeras, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, colorantes de normalización ROX.
Sistema de síntesis de primera cadena SuperScript III	Invitrogen, Thermo		Fisher 18080051 Kit para síntesis de ADNc
Placa de prueba de cultivo de tejidos 24	TPP, Suiza	92024	Placa de 24 pocillos, esterilizada por radiación, crecimiento mejorado, tratado, volumen 3,18 mL
Solución de azul de tripano	Gibco, Thermo Fisher	15250061	0,4%, 100 mL, colorante para evaluar la viabilidad celular
Invitrogen de agua destilada ultrapura sin DNasa/RNasa	, Thermo Fisher	10977023	0.1 y micro; m agua destilada filtrada por membrana
VACUETTE Tubos de extracción de sangre con heparina Los tubos de extracción de sangre con heparina	Thermo Fisher Scientific	15206067	VACUETTE tienen una parte superior verde y contienen heparina de litio, sodio o amonio secada por pulverización en las paredes internas y se utilizan en química clínica, inmunología y serología. El anticoagulante heparina activa la antitrombina, que bloquea la cascada de coagulación y, por lo tanto, produce una muestra de sangre o plasma completo.
Water	Sigma Aldrich	W3500-1L	Filtrado estéril, bioreactivo apto para el cultivo celular