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Durante la última década, hay un aumento del interés en la aplicación de microscopía Raman coherente (CRM) a las imágenes celulares y tisulares 1,2. CRM es una poderosa técnica de imagen química con dos variantes populares: microscopía coherente de dispersión Raman anti-Stokes (CARS) y microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS). El SRS es cada vez más popular en comparación con el CARS porque se ve menos afectado por la interferencia de fondo no Raman y tiene una dependencia lineal de la concentración3. CRM adquiere información de vibración molecular similar a la espectroscopia Raman, pero ofrece una velocidad de adquisición significativamente mejorada4. Esto se logra mediante una excitación vibratoria coherente a través de un par de láseres pulsados con alta intensidad máxima. Debido a que CRM proporciona mapeo químico resuelto espacialmente a alta resolución espacial y temporal, ha encontrado aplicaciones importantes en el diagnóstico del cáncer, el metabolismo de los lípidos, el metabolismo celular, el transporte de fármacos y muchos otros 5,6,7,8. Sin embargo, un cuello de botella importante que dificulta la adopción generalizada de la técnica es su complejidad técnica y la falta de protocolos estandarizados. Aunque ya existen láseres y microscopios comerciales, casi todos los sistemas que se utilizan actualmente en el campo implican varios niveles de personalización de láseres, ópticas, microscopios y detectores, lo que crea una barrera importante para los investigadores interesados en ingresar al campo o adoptar esta tecnología. La falta de acceso dificulta aún más las aplicaciones biológicas. El objetivo de esta recopilación de métodos es proporcionar ejemplos detallados y orientación sobre instrumentación, nuevos enfoques de imagen y aplicaciones de imágenes celulares o tisulares in vitro/in vivo. Incluimos siete publicaciones de expertos en el campo que se resumen aquí.
Clark et al. presentan una comparación lado a lado de SRS hiperespectral y CARS en términos de sensibilidad, resolución espacial y resolución espectral9. Ambas técnicas se implementan con el enfoque espectral de los láseres de femtosegundo, un enfoque comúnmente empleado que utiliza los láseres de femtosegundo de banda ancha con chirridos espectrales para lograr una resolución Raman de banda estrecha. Una comparación directa permite evaluar las diferencias de detección y seleccionar de forma óptima la modalidad para diferentes aplicaciones de imagen química.
De la Cadena et al. publican un nuevo método de SIE múltiplex que puede adquirir rápidamente imágenes del SIE de banda ancha10. La técnica se basa en una detección de amplificador de bloqueo multicanal diferencial personalizado, que permite la detección de hasta 32 canales simultáneamente. Además, se muestra una caracterización detallada del ruido y se demuestra un método de detección equilibrado para eliminar el ruido del láser. Este protocolo proporciona orientaciones prácticas para los usuarios interesados en construir sistemas del SIE múltiplex.
Shi et al. demuestran el uso de colorantes Raman altamente multiplexados en imágenes SRS11. Con la mejora de la prerresonancia, demuestran que la SRS podría proporcionar una sensibilidad comparable a la inmunofluorescencia estándar. Este método elude el límite de los canales espectralmente resolubles en la inmunofluorescencia convencional y permite monitorizar muchas proteínas simultáneamente y estudiar sus interacciones. Se proporciona una guía detallada sobre el procesamiento de muestras y la tinción con tinción de colorante Raman para facilitar la adopción de este poderoso método.
Miao et al. presentan imágenes vibracionales de tejido hinchado y análisis (VISTA), una técnica de imagen de superresolución que combina SRS con microscopía de expansión12. VISTA evita los obstáculos asociados con las imágenes fluorescentes y logra imágenes volumétricas de superresolución sin etiquetas en muestras biológicas con una resolución espacial de hasta 78 nm. Además, explotan un algoritmo de aprendizaje profundo para lograr la segmentación de múltiples componentes, incluidos los agregados de proteínas en las células y los tejidos cerebrales.
Espinoza et al. presentan el uso de imágenes SRS bicolor en tiempo real de proteínas y lípidos para aplicaciones de diagnóstico tisular13. Las imágenes SRS de dos colores pueden generar imágenes equivalentes a H&E para aplicaciones de patología. Este protocolo describe los detalles de la implementación de una técnica de modulación ortogonal y enfoque espectral para imágenes simultáneas del SRS en dos colores. La conversión de imágenes SRS de dos colores en imágenes pseudo-H&E también se demuestra con tejido cerebral de ratón para ilustrar las aplicaciones de diagnóstico tisular.
Yuan et al. publican un sistema de cámara flexible para imágenes SRS a largo plazo de células vivas14. La mayoría de las cámaras de observación de células vivas existentes están diseñadas para imágenes de campo claro y fluorescencia. Son incompatibles con la detección de SRS debido al requisito de un objetivo y un condensador de alta NA. Los autores demuestran imágenes SRS de lapso de tiempo de 24 horas con la cámara flexible, que mantuvo constantes la temperatura, el CO2 y la humedad.
Por último, Wu et al. demuestran la fluorescencia de dos fotones (TPEF) in vivo simultánea y las imágenes SRS15. Se combinan dos sistemas láser separados para lograr una sensibilidad óptima para ambas modalidades de imágenes para proporcionar información complementaria. In vivo Las imágenes SRS del tejido tienen desafíos únicos debido a la necesidad de detección epi-despectiva de luz despolarizada y retrodispersada. Este protocolo analiza los detalles de la configuración óptima de un microscopio TPEF-SRS y cómo se puede utilizar para obtener imágenes in vivo de la médula espinal del ratón.
Esta colección de publicaciones representa el estado actual del arte en instrumentación CRM y avances técnicos. Los investigadores interesados tanto en el desarrollo de métodos como en las aplicaciones encontrarán esta colección útil para comparar configuraciones y establecer puntos de referencia (sensibilidad, resolución, etc.) para construir u optimizar sus propios sistemas. Las directrices y las mejores prácticas proporcionadas en estos protocolos informarán las aplicaciones in vitro e in vivo existentes y futuras. La adopción a gran escala de la tecnología CRM aún espera aplicaciones clave e innovadoras y la comercialización de soluciones completas de CRM. No obstante, la estandarización de los enfoques de imágenes y los puntos de referencia es esencial para garantizar la reproducibilidad y la confiabilidad y facilitar una implementación más amplia de CRM16.
El campo de CRM está creciendo a gran velocidad. Los desarrollos técnicos que superan el límite de sensibilidad, especificidad y resolución continúan impulsando la tecnología a nuevos territorios. Por ejemplo, la resolución espacial del SIE está empezando a superar el límite de difracción17,18. La sensibilidad de la SRS de prerresonancia electrónica se acerca ahora a la de la fluorescencia19. En comparación con la fluorescencia, CRM tiene claras ventajas. Por ejemplo, el uso del trazado de deuterio permitió por primera vez el estudio in vivo de la dinámica metabólica de moléculas pequeñas a una resolución subcelular20. Con etiquetas pequeñas, es posible realizar una detección Raman altamente multiplexada de 24 o más objetivos etiquetados21. Los avances en inteligencia artificial permiten nuevas capacidades para CRM al aprovechar su alto contenido de información y características moleculares específicas para segmentar y clasificar objetos con sutiles diferencias de características espaciales y espectrales22. Juntos, estos avances técnicos en CRM están preparados para acelerar y ampliar las aplicaciones en imágenes biológicas y biomédicas.