Se presenta un protocolo para medir la cinética del tejido adiposo in vivo en humanos utilizando el método de marcaje con deuterio (2H).
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Artículo de método
Se presenta un protocolo para medir la cinética del tejido adiposo in vivo en humanos utilizando el método de marcaje con deuterio (2H).
El tejido adiposo blanco es un órgano altamente plástico que es necesario para mantener la homeostasis energética de todo el cuerpo. La masa de tejido adiposo y los cambios en la masa o distribución de la grasa están regulados por cambios en la síntesis y descomposición (es decir, recambio) de las células adiposas y los triacilgliceroles. La evidencia sugiere que la forma y la magnitud de la expansión del tejido adiposo subcutáneo (es decir, hipertrofia frente a hiperplasia) y el recambio pueden influir en la salud metabólica, ya que la adipogénesis se ha implicado en la patogénesis de la obesidad y las enfermedades relacionadas. A pesar del papel potencial del recambio adiposo en la salud humana, existe una falta de conocimiento sobre la cinética in vivo de las células adiposas. Esto se debe, en parte, a la lenta tasa de renovación de las células en el tejido adiposo y a la complejidad práctica de etiquetar directamente sus precursores metabólicos in vivo. En este artículo, describimos métodos para medir la cinética adiposa in vivo y las tasas de recambio en humanos a través del consumo de agua marcada con deuterio (2H). La incorporación de 2H en los restos de desoxirribonucleótidos del ADN en preadipocitos y adipocitos proporciona una medida precisa de la formación y muerte celular (recambio adiposo). En general, se trata de un enfoque innovador para medir la cinética adiposa in vivo y representa un cambio sustancial con respecto a otras evaluaciones in vitro .
La obesidad es una enfermedad caracterizada por un exceso de tejido adiposo blanco (TA) y es un factor de riesgo importante para el desarrollo de diabetes tipo II y enfermedad cardiovascular1. El AT blanco es un órgano altamente plástico que almacena energía en forma de triacilgliceroles (TG) y es esencial para la homeostasis metabólica2. La AT blanca conserva la capacidad de expandirse, reducirse y remodelarse durante la edad adulta3, y la masa de AT está determinada por cambios dinámicos en el volumen de los adipocitos (a través de la síntesis y descomp....
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La Junta de Revisión Institucional (IRB, por sus siglas en inglés) del Centro de Investigación Biomédica Pennington aprobó todos los procedimientos (#10039-PBRC) y todos los sujetos humanos dieron su consentimiento informado por escrito.
1. Período de etiquetado O de ocho semanas 2H2
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El protocolode etiquetado 2 H2O (sección 1) mantiene un enriquecimiento de 2H cercano a la meseta en el agua corporal dentro del rango de 1,0%-2,5% durante la duración del período de etiquetado de 8 semanas10, como se muestra en la Figura 2. Un estudio previo utilizó el protocolo de marcaje 2H2O para evaluar la cinética adiposa a través de la incorporación de 2H en el ADN de las células adiposa.......
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Las evaluaciones in vivo son necesarias para proporcionar nuevos conocimientos sobre la dinámica del recambio de TA blanco y su papel en la obesidad y las enfermedades metabólicas relacionadas, ya que las evaluaciones in vitro no abarcan el entorno natural del TA. Aunque el uso de la datación radiocarbónica retrospectiva para evaluar la dinámica adiposa ha sido informativo 7,25, este enfoque no es adecuado para .......
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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Los autores agradecen al Núcleo de Espectrometría de Masas del Centro de Investigación Biomédica Pennington.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1-metilimidazol | MilliporeSigma | 336092 | |
| 2H2O | Sigma Aldrich | ||
| Anhídrido acético Tampón de lisado Aldridge | 539996 | ||
| ACK (tampón de lisis de eritrocitos) | Quality Biological Inc (VWR) | 10128-802 | |
| Agilent 6890/5973 GC/MS | Agilent | ||
| Anti-humano CD31 (PECAM-1) Biotina | Invitrogen | 13-0319-82 | |
| Anti-humano CD34 Biotin | Invitrogen | 13-0349-82 | |
| Anti-humano CD45 | BioLegend | 304004 | |
| Solución Antibiótica Antimicótica | MilliporeSigma | A5955 | |
| Colagenasa tipo 1 | Worthington Biochemical Corporación | LS004196 | |
| Desoxirribosa (2-desoxi d-ribosa) | MilliporeSigma | 31170 | |
| Óxido de deuterio | MilliporeSigma | 756822 | |
| DB-225 columna (30 m, 0,25 mm, 0,25 um) | J& W Scientific | 122-2232 | |
| Diclorometano (DCM) | MilliporeSigma | 34856 | |
| Estándar de ADN (ADN de timo de ternera) | MilliporeSigma | D4764 | |
| Dneasy Blood and Tissue Kit (kit de extracción de ADN) | Qiagen | 69504 | |
| Easy Sep Kit de biotina humana | Stem Cell Technologies | 17663 | |
| EasySep Human CD14 Positive Selection Cocktail | Stem Cell Technologies | 18058C | |
| Acetato de etilo | Fisher | EX0241-1 | |
| Falcon 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo | VWR | 60819-295 | |
| Ficoll-Paque Plus | MilliporeSigma | GE17-1440-02 | |
| viales GC (2 mL) | Fisher | C-4011-1W | |
| Insertos para viales GC | Fisher | C-4011-631; C-4012-530 | |
| Ácido acético glacial | Fisher | AC14893-0010 | |
| Tubos de vidrio (para hidrólisis) | Tampón Fisher | 14-959-35AA | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | |
| Hyclone Water, grado de biología molecular | Thomas Scientific | SH30538.02 | |
| MEM alfa | Fisher Scientific | 32561-037 | |
| PFBHA (o-(2, 3, 4, 5, 6)-penatclorhidrato de fluorobencilhidroxilamina) | MilliporeSigma | 194484 | |
| tiras indicadoras de pH | Fisher | 987618 | |
| Ácido fosfatasa | Calbiochem (VWR) | 80602-592 | |
| Nucleasa S1 (de Aspergillus oryzae) | MilliporeSigma | N5661 | |
| Sulfato de sodio | MilliporeSigma | 23913 |
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