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Monitorización de los cambios en las células endoteliales de la vena umbilical humana tras la infección viral mediante el análisis celular en tiempo real basado en la impedancia

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DOI:

10.3791/64887

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5 de mayo de 2023

 ,  ,  , 
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

En este artículo

Resumen

El presente estudio describe un protocolo para monitorizar los cambios en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) durante la infección viral utilizando un sistema de análisis celular en tiempo real (RTCA).

Resumen

Las células endoteliales recubren la superficie interna de todos los vasos sanguíneos y linfáticos, creando una barrera semipermeable que regula el intercambio de líquidos y solutos entre la sangre o la linfa y sus tejidos circundantes. La capacidad de un virus para cruzar la barrera endotelial es un mecanismo importante que facilita la diseminación del virus en el cuerpo humano. Se ha informado que muchos virus alteran la permeabilidad endotelial y/o causan la ruptura de la barrera de las células endoteliales durante la infección, lo que puede causar fugas vasculares. El estudio actual describe un protocolo de análisis celular en tiempo real (RTCA, por sus siglas en inglés), que utiliza un analizador celular comercial en tiempo real para monitorear la integridad endotelial y los cambios en la permeabilidad durante la infección por el virus del Zika (ZIKV, por sus siglas en inglés) de las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC, por sus siglas en inglés). Las señales de impedancia registradas antes y después de la infección por ZIKV se tradujeron a valores de índice celular (IC) y se analizaron. El protocolo RTCA permite la detección de efectos transitorios en forma de cambios morfológicos celulares durante una infección viral. Este ensayo también podría ser útil para estudiar los cambios en la integridad vascular de los HUVEC en otras configuraciones experimentales.

Introducción

Las células endoteliales (CE) recubren la superficie interna de todos los vasos sanguíneos y linfáticos. Están conectados por uniones adherentes y estrechas, creando una barrera semipermeable entre la sangre o la linfa y los tejidos circundantes 1,2. Las uniones endoteliales intactas célula-célula son fundamentales para regular el transporte de macromoléculas, solutos y fluidos, cruciales para las actividades fisiológicas de los tejidos y órganos correspondientes3. La barrera endotelial es dinámica y modulada por estímulos específicos4. La alteración o pérdida de la función de la barrera endotelial es un sello distintivo de la fisiopatología de la enfermedad en la inflamación aguda y crónica en la patogénesis de muchas enfermedades 5,6,7, incluida la infección viral 8,9,10,11. En el caso de los flavivirus, se encontró que la proteína no estructural NS1 puede alterar la permeabilidad endotelial, por ejemplo, a través de la interrupción de la capa endotelial similar al glicocálix como resultado del aumento de la expresión y activación de catepsina L, sialidasas y endoglicosidasa heparinasa9. En el estado de enfermedad, la integridad de la monocapa endotelial se ve afectada y las uniones célula-célula se interrumpen, lo que puede conducir a lesiones y disfunciones endoteliales12 y, finalmente, a manifestaciones patológicas generalizadas en múltiples sistemas de órganos13,14. La infección viral de las CE da lugar a cambios en las vías de señalización celular y en el perfil de expresión génica celular, lo que puede afectar a las funciones de barrera de líquidos, causar alteraciones de las CE e inducir fugas vasculares10,15. Se ha descubierto que la infección por el virus del Zika (ZIKV) en las CE altera la integridad de la unión, lo que provoca cambios en la permeabilidad vascular y conduce a una disfunción de la barrera endotelial, lo que resulta en fugas vasculares10,15. Los estudios han demostrado que el ZIKV está relacionado con defectos congénitos graves; Sin embargo, no se sabe mucho sobre el mecanismo exacto por el cual esto ocurre16,17. Por lo tanto, comprender los cambios en la barrera endotelial durante una infección es fundamental para comprender el mecanismo de la enfermedad.

En la actualidad, las CE se utilizan como un importante sistema experimental modelo vascular in vitro para diversos procesos fisiológicos y patológicos 18,19,20,21. Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se han utilizado ampliamente como un sistema celular primario no inmortalizado para estudiar el endotelio vascular y la biología vascular in vitro 22,23,24,25. Los HUVEC se aislaron por primera vez para cultivo in vitro a principios de la década de 1970 de la vena umbilical del cordón umbilical humano26. Los HUVEC tienen una morfología similar a la de un adoquín que se hace proliferar fácilmente en el laboratorio. Debido al esfuerzo cortante después de mantenerse durante largos períodos en estado confluente, se observa un alargamiento de la forma de la célula. Los HUVEC pueden caracterizarse por la presencia de cuerpos de Weibel y Palade (WPB), vesículas pinocíticas, pequeñas cantidades de fibrillas ubicadas cerca del núcleo, mitocondrias con formas tubulares que rara vez muestran ramificaciones, un núcleo elipsoide con un patrón granular fino de cromatina condensada y de uno a tres nucléolos presentes en cada núcleo27. Aunque los HUVEC muestran numerosas características morfológicas, la identificación de los HUVEC no puede lograrse únicamente mediante un examen óptico. Los ensayos, como la tinción por inmunofluorescencia de la cadherina endotelial vascular (EV), se utilizan comúnmente para la monitorización de la integridad vascular en los HUVEC 28,29,30,31.

Este estudio describe el protocolo de análisis celular en tiempo real (RTCA) de la infección de HUVECs. El sistema RTCA utiliza placas especializadas recubiertas de oro que contienen microelectrodos que proporcionan una superficie conductora para la unión de la celda. Cuando las células se adhieren a la superficie del microelectrodo, se forma una barrera que impide el flujo de electrones a través de los microelectrodos. La medición de la impedancia generada por los microelectrodos se puede utilizar para obtener información sobre algunos procesos celulares, incluidas las uniones celulares, la proliferación y la migración32. El ensayo reportado es un ensayo celular basado en impedancia que, junto con un analizador celular en tiempo real, proporciona una medición continua de la proliferación de células vivas, los cambios morfológicos (como el encogimiento celular) y la calidad de la unión celular de una manera no invasiva y sin etiquetas. En este estudio, el analizador celular en tiempo real se utiliza para monitorizar la integridad endotelial y los cambios morfológicos de los HUVEC durante la infección por ZIKV. Brevemente, el instrumento mide el flujo de electrones transmitido en placas especializadas de microtitulación recubiertas de microelectrodos de oro en presencia de un medio de cultivo (solución conductora de electricidad). La adherencia celular o los cambios en el número y la morfología de las células perturban el flujo de electrones y causan variaciones de impedancia que pueden ser capturadas por el instrumento (Figura suplementaria 1). La diferencia entre el crecimiento, la proliferación y la adherencia de HUVEC antes y después de la infección por ZIKV se registra en tiempo real mediante una señal de impedancia eléctrica y luego se traduce en el valor del índice celular (IC). El valor de IC de la preinfección se utiliza como referencia para la normalización del valor de IC. Los cambios en los valores de IC reflejan cambios morfológicos celulares o pérdida de adherencia celular tras la infección33. Los resultados del estudio muestran que el protocolo RTCA permite la detección de efectos transitorios o cambios morfológicos celulares durante la infección viral en comparación con un ensayo de punto final, como la tinción por inmunofluorescencia de VE-cadherina. El método RTCA podría ser útil para analizar los cambios en la integridad vascular de HUVEC tras la infección por otros virus.

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Protocolo

1. Preparación celular

  1. Preparación de HUVECs
    1. Cultivar 7,5 x 105 células HUVEC/ml en un matraz de cultivo celular de 75cm2 (recubierto con 20 μg/ml de colágeno tipo 1) que contenga 12 ml de medio de células endoteliales (MEC) suplementado con un 10 % de suero fetal bovino (FBS), un suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS) al 0,01 % que contenga factores de crecimiento, hormonas y proteínas necesarias para el cultivo de HUVEC, y 0,01% de penicilina-estreptomicina (P/S). Incubar las células en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2 (Figura 1).

2. Configuración del experimento RTCA

  1. Ejecución de verificación de resistencias en RTCA
    1. Haga doble clic en el icono del software RTCA en el escritorio para iniciar la aplicación. Aparecerá una ventana de inicio de sesión, escriba el nombre de usuario y la contraseña para iniciar sesión.
    2. Coloque una placa de resistencia RTCA de 96 pocillos con el pocillo A1 hacia adentro en la estación RTCA ubicada en la incubadora de cultivos celulares.
    3. En la pestaña Notas de experiencia del software RTCA, escriba el nombre del experimento, el número de serie del dispositivo y el tipo de dispositivo (placa de control de calidad).
    4. En la pestaña Diseño en la pestaña Celda del software RTCA, resalte todos los pozos y haga clic con el botón derecho en los pozos resaltados para asegurarse de que todos los pozos estén encendidos (atenuados).
    5. En la pestaña Programación del software RTCA, haga clic en Step_1. Introduzca Barridos: 10 e Intervalo: 30 s. Haga clic en Aplicar. Haga clic en Iniciar/Continuar en la esquina superior izquierda del software para iniciar la ejecución de verificación.
      NOTA: Asegúrese de que la conexión de los pozos a la estación RTCA sea correcta observando "Placa escaneada. Conexiones OK" en la parte inferior de la página.
  2. Ejecución de verificación de resistencias para el análisis de datos
    1. En la pestaña Índice de celda , compruebe los datos al finalizar la ejecución. Todos los valores de IC deben ser inferiores a 0,063.
    2. En la parte inferior de la pestaña Índice de celda , compruebe los datos de escaneo sin procesar. Los datos de escaneo sin procesar deben mostrar patrones de valores repetidos de 40,0 ± 2,0 (filas A y H), 67,5 ± 2,5 (filas B y G), 93,6 ± 2,9 (filas C y F) y 117,6 ± 3,2 (filas D y E).
    3. Para detener la ejecución de la verificación, haga clic en Placa > Placa de liberación. La placa de resistencia RTCA de 96 pocillos ya está lista para ser retirada de la estación RTCA.
  3. Obtención de lectura de antecedentes en RTCA
    1. Lave la placa de microelectrodo de oro especializada recubierta de colágeno tipo 1 (recubierta con 20 μg/ml de colágeno tipo 1) con 60 μl/pocillo de solución salina equilibrada de Hank (HBSS; con bicarbonato de sodio, sin cloruro de calcio ni sulfato de magnesio) 2 veces.
    2. Deseche el HBSS restante y agregue 50 μL/pocillo de ECM. Coloque la placa de microelectrodo de oro especializada que contiene ECM con el pocillo A1 hacia adentro en la estación RTCA ubicada en la incubadora de cultivos celulares.
    3. En la pestaña Exp Notes del software RTCA, escriba el nombre del experimento, el número de serie del dispositivo y el tipo de dispositivo (formato de 96 pocillos).
    4. En la pestaña Diseño en la pestaña Celda del software RTCA, resalte los pozos que se utilizarán y haga clic con el botón derecho en los pozos resaltados para asegurarse de que todos los pozos estén encendidos (atenuados).
    5. En la pestaña Programación del software RTCA, haga clic en Step_1 y haga clic en Inicio/Continuar en la esquina superior izquierda del software para obtener una lectura de fondo.
      NOTA: Asegúrese de que la conexión de los pocillos sea correcta observando "Placa escaneada. Conexiones OK" en la parte inferior de la página.
    6. Una vez que se obtiene la lectura de fondo, la placa de microelectrodo de oro especializada ahora está lista para la siembra celular y lista para ser retirada de la estación RTCA.
  4. Preparación de HUVEC en la placa especializada de microelectrodos de oro
    1. Siembre los HUVEC en la placa de microelectrodos de oro especializada con 50 μL/pocillo de medio acondicionado, 1 x 104 células/pocillo (medio acondicionado: ECM suplementado con 10% de FBS, 0,01% de ECGS y 0,01% de P/S). Vuelva a colocar la placa en la estación RTCA con el pocillo A1 hacia adentro para la incubación nocturna en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2.
      NOTA: Se realizó un recuento celular en la suspensión celular con un factor de dilución de dos utilizando un hemocitómetro.
    2. En la pestaña Programación , haga clic en Agregar un paso en la esquina superior izquierda. Haga clic en Step_2 y cambie los Barridos: 601 e Intervalo: 2 min. Haga clic en Aplicar. Haga clic en Step_2 y haga clic en Inicio/Continuar en la esquina superior izquierda del software.
    3. Después de 20 h de incubación y cuando los valores de IC en la pestaña Gráfico de pocillos muestran una meseta, la placa está lista para la infección. En la pestaña Programación del software RTCA, haga clic en Abortar paso.
    4. La placa de microelectrodo de oro especializada ahora está lista para ser retirada de la estación RTCA para los pasos posteriores.

3. Infección viral en HUVECs

  1. Dilución de virus
    1. El cultivo de la madre ZIKV se mantiene a -80 °C. Para este estudio, se debe retirar el stock de virus guardado en los viales criogénicos y diluir el stock de ZIKV con MEC sin suero en tubos de centrífuga de 1,5 ml para lograr una multiplicidad de infecciones (MOI) de 0,1 y 1.
      NOTA: El stock de ZIKV se preparó previamente realizando la propagación en células Vero y cosechando el sobrenadante34 del ZIKV.
  2. Infección de la monocapa celular
    1. Retire y deseche el medio acondicionado (ECM suplementado con 10% de FBS, 0.01% de ECG y 0.01% de P/S) de cada pocillo. Enjuague cada pocillo con 60 μL de HBSS 2x. Inserte el HBSS con la ayuda del costado del pozo; No dispare la monocapa de la célula.
    2. Trabajando de la dilución más alta a la más baja, agregue 40 μL de cada muestra de virus diluida en ECM sin suero en el pocillo. Triplicar el pocillo para cada dilución y mantener seis pocillos sin infección (control negativo y trombina control positivo). No dispare a la monocapa de la célula; En su lugar, agregue el virus diluido con la ayuda del costado del pocillo. Utilice una punta de pipeta nueva para cada inserción.
      NOTA: Se eligió la trombina como control positivo, ya que puede aumentar rápidamente la permeabilidad endotelial de los HUVEC.
    3. Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2 para permitir la adsorción del virus. Agite la placa 5 veces cada 15 minutos para permitir la adsorción del virus en toda la monocapa celular.
  3. Adición del medio de cultivo celular superpuesto
    1. Después de 1 h de incubación, retire y deseche la suspensión del virus desde la concentración más baja hasta la más alta.
    2. Lavar las células infectadas con 60 μL de HBSS 2x. Cubra el pocillo con ECM suplementado con un 2% de FBS. Para los pocillos de control positivo, diluir la trombina a 20 U/ml con MEC suplementada con FBS al 2% y recubrir los pocillos con medio de MEC que contenga trombina. No dispare a la monocapa de la célula; En su lugar, agregue medios superpuestos con la ayuda del lado del pozo.
  4. Colocación de la placa de microelectrodo de oro especializada infectada de nuevo en la estación RTCA
    1. En la pestaña Programación , haga clic en Agregar un paso en la esquina superior izquierda. Haga clic en Step_3 y cambie los Barridos: 3.601 y el Intervalo: 2 min. Haga clic en Aplicar.
    2. Haga clic en Aceptar en la ventana emergente que aparece. Coloque la placa de microelectrodo de oro especializada infectada con el pocillo A1 hacia adentro en la estación RTCA ubicada en la incubadora de cultivo celular.
    3. Haga clic en Step_3 y haga clic en Inicio/Continuar en la esquina superior izquierda del software.

4. Análisis de datos y exportación de datos

  1. Adición de información experimental de cada pozo
    1. En la pestaña Diseño , haga clic en la pestaña Celda (Figura 2A). Para ingresar la información de la celda de destino y determinar el tipo de pocillo para cada pozo, resalte el pocillo y escriba el nombre, el número y el color de la celda de destino en la parte inferior del software. Haga clic en Aplicar (Figura 2B).
    2. Para seleccionar y determinar el tipo de pozo para cada pozo en la pestaña Celda , resalte el pozo, seleccione el tipo de pozo (muestra, control positivo o control negativo) y haga clic en Establecer.
    3. En la pestaña Diseño , haga clic en la pestaña Tratamiento (Figura 2C). Para ingresar la información del tratamiento, resalte el pocillo y escriba el nombre del tratamiento, la concentración del tratamiento, la unidad y el color. Haga clic en Aplicar (Figura 2D).
    4. Para seleccionar y determinar el tipo de pocillo para cada pocillo en la pestaña Tratamiento , resalte el pozo, seleccione el tipo de pocillo (muestra, control positivo o control negativo) y haga clic en Establecer.
      NOTA: Para cada selección, se pueden resaltar varios pozos al mismo tiempo.
  2. Normalización del valor de IC
    1. Haga clic con el botón derecho a la derecha de la pestaña Análisis de datos y seleccione Índice de celda normalizado en el cuadro desplegable Eje Y (Figura 3A). En la sección Eje X en la parte inferior, seleccione el tiempo normalizado como el último punto de tiempo medido donde se retiró la placa de microelectrodo de oro especializada para la infección (Figura 3B).
      NOTA: El proceso de normalización llevado a cabo por el software elimina la mayor parte de la variabilidad debida a las diferencias en la siembra y adhesión de los pozos, siempre y cuando el punto de normalización elegido sea anterior a la adición del virus y/o al tratamiento. Por lo tanto, el punto de tiempo óptimo de normalización debe ser el último punto de tiempo antes de la adición del virus y/o del tratamiento. El punto de tiempo para normalizar se puede comprobar en la pestaña Programación en Step_2. El tiempo total indicado es el punto de tiempo para normalizar (Figura 3C).
  3. Representación gráfica de los datos obtenidos mediante el software RTCA
    1. En la pestaña Análisis de datos , seleccione los pozos que se agregarán al gráfico resaltando los pozos y haciendo clic en << Agregar. El índice de celda normalizado con respecto al gráfico de tiempo ya está listo para copiarse y exportarse. Asegúrese de marcar la casilla de verificación Promedio .
  4. Exportación de datos con el software RTCA
    1. En la esquina superior izquierda del software RTCA, haga clic en Placa > Exportar información del experimento.... Marque la casilla para seleccionar los datos que se van a exportar. Haga clic en Aceptar.
      NOTA: Los datos sin procesar (valores de CI sin procesar) se pueden exportar cuando la opción Índice de celda > Todo está marcada.
    2. Seleccione la carpeta para guardar el archivo de exportación. Haga clic en GUARDAR. Aparecerá una ventana emergente que indica la exportación de la información experimental. Una vez finalizada la exportación, aparecerá otra ventana que indica que la información del experimento exportado está lista para ser vista.

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Resultados

Antes de la infección por ZIKV, el IC registrado para la monocapa de HUVEC cultivada en una placa de microtitulación especializada recubierta de microelectrodos de oro estaba por encima de 8, lo que sugiere fuertes propiedades de adherencia. Las placas o pocillos con un índice de IC inferior a 8 deben desecharse. A continuación, los HUVEC se infectaron con ZIKV a un MOI de 0,1 y 1, y se registró la impedancia celular durante 7 días. El valor de IC de los HUVEC infectados con ZIKV P6-740 a un MOI de 0,1 (línea azul claro)...

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Discusión

La infección viral citocida en células permisivas suele asociarse a cambios sustanciales en la morfología celular y la biosíntesis36. Los cambios morfológicos celulares inducidos por el virus, como el encogimiento celular, el agrandamiento celular y/o la formación de sincitios, también se conocen como efectos citopáticos (CPE), característicos de ciertas infecciones virales37. En los CE, el CPE se describió como la destrucción de las células y la ruptura de las uniones estr...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Esta investigación recibió el apoyo del Ministerio de Educación Superior de Malasia en el marco del programa del Centro de Excelencia de Instituciones Superiores (HICoE) (MO002-2019) y la financiación en el marco del Programa de Becas de Investigación a Largo Plazo (LRGS MRUN Fase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLNest615601
37 ° Incubadora C con 5% CO2SanyoMCO-18AIC
75 cm2 matraz de cultivo de tejidos Corning430725U
Solución antibiótica penicilina-estreptomicina (P/S)Sciencell0503
Cabina de seguridad biológica, Clase IIHoltenHB2448
Colágeno tipo 1SIgma-AldrichC3867
Suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS)Sciencell1052
Medio de células endoteliales (ECM)Sciencell1001
E-plate 96Agilent Technologies, Inc.
Suero fetal bovino (FBS)Sciencell0025
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)Sigma-AldrichH9394
HemocitómetroLaboroptik LTDNeubauer células
(HUVECs)Sciencell8000
Microscopio invertidoZEISSTELAVAL 31
Latitude 3520 PortátilDell -
Micropipeta multicanal (10 - 100 y micro; L)Micropipeta multicanal Eppendorf3125000036
(30 - 300 y micro; L)Eppendorf3125000052
Reactivo reservadorTarsonsT38-524090
RTCA placa de resistencia 96Agilent Technologies, Inc.
RTCA Software Pro (versión 2.6.1)Agilent Technologies, Inc.
Pipetas monocanal (10 - 100 y micro; L)Eppendorf3123000047
pipetas monocanal (100 - 1000 y micro; L)Eppendorf3123000063
Pipetas monocanal (20 - 200 y micro; L)Eppendorf3123000055
xCELLigence Analizador de células en tiempo real SP (Modelo: W380)Agilent Technologies, Inc.00380601030https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232
05232368001 endoteliales de vena umbilical humana mejoradas 052323500015454433001

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