Seguimiento de umbral eléctrico de circuito cerrado en tiempo real de código abierto para la investigación traslacional del dolor

Summary

APTrack es un complemento de software desarrollado para la plataforma Open Ephys que permite la visualización de datos en tiempo real y el seguimiento de umbral eléctrico de bucle cerrado de potenciales de acción neuronal. Hemos utilizado con éxito esto en microneurografía para nociceptores de fibra C humana y nociceptores de fibra C y fibra Aδ de ratón.

Abstract

Los nociceptores son una clase de neuronas aferentes primarias que señalan estímulos nocivos potencialmente dañinos. Un aumento en la excitabilidad del nociceptor ocurre en condiciones de dolor agudo y crónico. Esto produce una actividad continua anormal o umbrales de activación reducidos a estímulos nocivos. La identificación de la causa de este aumento de la excitabilidad es necesaria para el desarrollo y la validación de tratamientos basados en mecanismos. El seguimiento del umbral eléctrico de una sola neurona puede cuantificar la excitabilidad del nociceptor. Por ello, hemos desarrollado una aplicación para permitir este tipo de mediciones y demostrar su uso en humanos y roedores. APTrack proporciona visualización de datos en tiempo real e identificación de potencial de acción utilizando un diagrama ráster temporal. Los algoritmos detectan potenciales de acción cruzando el umbral y monitorean su latencia después de la estimulación eléctrica. Luego, el complemento modula la amplitud de la estimulación eléctrica utilizando un método arriba-abajo para estimar el umbral eléctrico de los nociceptores. El software fue construido sobre el sistema Open Ephys (V0.54) y codificado en C ++ utilizando el marco JUCE. Se ejecuta en los sistemas operativos Windows, Linux y Mac. El código abierto está disponible (https://github.com/ Microneurography/APTrack). Los registros electrofisiológicos se tomaron de nociceptores tanto en una preparación piel-nervio de ratón utilizando el método de fibra provocada en el nervio safeno como en voluntarios humanos sanos utilizando microneurografía en el nervio peroneo superficial. Los nociceptores se clasificaron por su respuesta a estímulos térmicos y mecánicos, así como por el monitoreo de la desaceleración dependiente de la actividad de la velocidad de conducción. El software facilitó el experimento al simplificar la identificación del potencial de acción a través del diagrama ráster temporal. Demostramos el seguimiento del umbral eléctrico de circuito cerrado en tiempo real de los potenciales de acción de una sola neurona durante la microneurografía humana in vivo, por primera vez, y durante los registros electrofisiológicos ex vivo de las fibras C y las fibras Aδ en ratones. Establecemos la prueba de principio al mostrar que el umbral eléctrico de un nociceptor de fibra C sensible al calor humano se reduce al calentar el campo receptivo. Este complemento permite el seguimiento del umbral eléctrico de los potenciales de acción de una sola neurona y permite la cuantificación de los cambios en la excitabilidad de los nociceptores.

Introduction

Los nociceptores son neuronas aferentes primarias en el sistema nervioso periférico que se activan por eventos que dañan el tejido abierta o potencialmente y desempeñan un papel protector crítico en el dolor agudo¹. Los registros electrofisiológicos de los nociceptores de fibra C y fibra Aδ en modelos animales, voluntarios humanos sanos y pacientes han revelado sensibilización y actividad espontánea anormal en una amplia gama de condiciones de dolor 2,3,4,5,6,7. La comprensión de los mecanismos que subyacen a estos cambios en la excitabilidad de los nociceptores en los pacientes podría permitir intervenciones terapéuticas dirigidas⁸. Sin embargo, hay pocas herramientas para evaluar directamente la excitabilidad de los nociceptores, particularmente en pacientes⁹, pero el potencial para la utilidad de tales herramientas es bien reconocido^10,11.

El seguimiento del umbral eléctrico de todo el nervio se puede utilizar para examinar la excitabilidad axonal en humanos¹². Sin embargo, como las neuronas periféricas grandes, mielinizadas, contribuyen desproporcionadamente a la amplitud del potencial de acción del compuesto sensorial, el seguimiento del umbral eléctrico de todo el nervio no permite la evaluación de la función de la fibra C^11,13. De hecho, en un estudio previo, el seguimiento del umbral eléctrico de todo el nervio en cohortes de dolor neuropático crónico con neuropatía diabética y polineuropatía inducida por quimioterapia no mostró diferencias en la excitabilidad axonal¹¹.

En un estudio anterior, el seguimiento del umbral eléctrico a nivel de una sola neurona se utilizó para examinar la excitabilidad de los nociceptores de fibra C durante los registros de fibra burlada en una preparación ex vivo de piel y nervio de rata¹⁴. Los autores demostraron que un aumento de la concentración de potasio, las condiciones ácidas y la bradiquinina aumentaron la excitabilidad del nociceptor de fibra C, como se refleja en un umbral eléctrico reducido para la generación de potencial de acción. Además, el calentamiento del campo receptivo de los nociceptores sensibles al calor redujo su umbral eléctrico, mientras que los nociceptores insensibles al calor mostraron un aumento en su umbral eléctrico¹⁴. Esto proporciona una prueba importante de que el seguimiento del umbral eléctrico de una sola neurona es posible y puede ser útil, pero actualmente no hay soluciones de software y / o hardware disponibles para permitir tales investigaciones, particularmente para estudios en humanos.

En humanos, la microneurografía es el único método disponible para evaluar directamente las propiedades electrofisiológicas de las fibras C¹⁵. Este abordaje ha sido utilizado para demostrar disfunción de los nociceptores en pacientes con dolor crónico 2,3,4,5,6,7. La microneurografía puede detectar potenciales de acción de una sola neurona; sin embargo, debido a las bajas relaciones señal-ruido, los investigadores utilizan la técnica de marcado para caracterizar la actividad de la fibra C¹⁶. En la técnica de marcado, la estimulación eléctrica supraumbral se aplica a los campos receptivos de fibra C en la piel. Esta estimulación eléctrica genera un potencial de acción que ocurre a una latencia constante, que está determinada por la velocidad de conducción de la fibra C. Las fibras C exhiben una desaceleración dependiente de la actividad, por lo que su velocidad de conducción se reduce y, por lo tanto, su latencia de conducción aumenta durante los períodos de descarga potencial de acción¹⁷. En condiciones basales, las fibras C normalmente no generan potenciales de acción en ausencia de estímulos nocivos y, por lo tanto, su latencia de conducción en respuesta a la estimulación eléctrica de baja frecuencia es constante. Los estímulos mecánicos, térmicos o farmacológicos, que evocan el disparo, inducen una desaceleración dependiente de la actividad, lo que aumenta la latencia de los potenciales de acción evocados por la estimulación eléctrica de baja frecuencia concomitante. Esto permite la identificación objetiva de las respuestas a los estímulos no eléctricos aplicados en el contexto de una baja relación señal-ruido. Por lo tanto, la desaceleración dependiente de la actividad puede ser utilizada para caracterizar funcionalmente las fibras C¹⁶. De hecho, diferentes clases funcionales de fibras C exhiben patrones distintivos de desaceleración dependiente de la actividad en paradigmas de estimulación eléctrica que implican variar la frecuencia de estimulación^18,19. Esta variabilidad en la latencia de los potenciales de acción de la fibra C presenta un desafío para los algoritmos diseñados para monitorizarlos.

La actividad continua en un nociceptor conduce a una mayor variabilidad en su latencia durante la estimulación eléctrica de baja frecuencia, y esto se debe nuevamente a la desaceleración dependiente de la actividad. Este aumento de la variabilidad, o jitter, es una medida indirecta cuantificable de la excitabilidad². Otras causas de variabilidad en la latencia del potencial de acción incluyen flip-flop, donde se estimulan ramas terminales alternativas de una sola neurona, lo que hace que el potencial de acción evocado tenga dos (o más) latencias de referencia que son mutuamente excluyentes²⁰. Finalmente, los cambios en la temperatura de las ramas terminales de una neurona periférica también causan cambios de latencia de potencial de acción de manera termodinámica, con el calentamiento aumentando la velocidad de conducción y el enfriamiento disminuyendo la velocidad de conducción¹⁹. Por lo tanto, cualquier software que busque realizar un seguimiento de umbral eléctrico de bucle cerrado de fibras C nociceptivas debe permitir cambios en la latencia en los potenciales de acción evocados eléctricamente.

Para lograr nuestro objetivo de seguimiento de umbral eléctrico entre especies de nociceptores de fibra C, desarrollamos APTrack, un complemento de software de código abierto para la plataforma Open Ephys²¹, para permitir el seguimiento de umbral eléctrico en tiempo real, de circuito cerrado, y el seguimiento de latencia. Proporcionamos datos de prueba de concepto que demuestran que es posible el seguimiento del umbral eléctrico del nociceptor de fibra C durante la microneurografía humana. Además, demostramos que esta herramienta se puede utilizar en electrofisiología de fibra burlada ex vivo de roedores, lo que permite estudios traslacionales entre humanos y roedores. Aquí, describiremos en detalle cómo los investigadores pueden implementar y usar esta herramienta para ayudar a su estudio de la función y excitabilidad de los nociceptores.

Protocol

Los experimentos de microneurografía humana fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación de la Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad de Bristol (número de referencia: 51882). Todos los participantes del estudio dieron su consentimiento informado por escrito. Los experimentos con animales se realizaron en la Universidad de Bristol de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986 después de la aprobación de la Junta de Bienestar Animal y Revisión Ética de la Universidad de Bristol y estaban cubiertos por una Licencia de Proyecto.

1. Instalación de Open Ephys GUI y APTrack

1. Consulte la documentación del software para encontrar la versión más reciente de la interfaz gráfica de usuario (GUI) de Open Ephys compatible (https://github.com/Microneurography/APTrack#readme) y, a continuación, descargue e instale la GUI.
2. Instale una versión compatible de la GUI desde la siguiente URL: https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases.
3. Descargue la última versión de GitHub: https://github.com/Microneurography/APTrack/releases. Para una computadora con Windows, copie el archivo .dll en la carpeta de complementos, que generalmente se encuentra en C: \ Archivos de programa \ Open Ephys \ plugins. Para un ordenador MacOS, copie el archivo .bundle en la carpeta Contents/PlugIns del paquete.

2. Montaje del aparato de registro y estimulación

1. Conecte la placa de adquisición al ordenador mediante el cable suministrado por el fabricante y enciéndalo.
   NOTA: Para la microneurografía humana, se utilizó un aislador USB 3.0 para aislar eléctricamente al participante de la computadora, y la placa de adquisición fue alimentada por una batería portátil en lugar de la fuente de alimentación de voltaje de red utilizada para estudios con roedores. Todas las conexiones USB, excluyendo la placa de control del motor paso a paso, se pasaron a través del aislador USB durante los estudios en humanos.
2. Conecte la placa de E/S al puerto de entrada analógico de la placa de adquisición. Conecte un cabezal de grabación Intan RHD a la placa de adquisición mediante un cable de interfaz serie-periférica (SPI).
   NOTA: Aquí se utilizó el cabecera bipolar Intan de 16 canales, pero se pueden usar otras cabeceras monopolares de la serie RHD2000.
3. Conecte el PulsePal al ordenador²². Para el montaje con un estimulador analógico controlado por voltaje (por ejemplo, un DS4) utilizando un PulsePal, como con las grabaciones de fibra provocada del ratón, siga los pasos 2.5.1-2.5.3; para el montaje con un estimulador basado en un codificador rotativo (por ejemplo, un DS7) utilizando un motor paso a paso, como con los registros de microneurografía humana, siga los pasos 2.6.1-2.6.8 (Figura 1).
4. Cree la cadena de señal en la GUI como se describe a continuación.
   1. Inserte el complemento Rhythm FPGA en la cadena de señal haciendo clic izquierdo y arrastrándolo a la cadena de señal; esto conecta la GUI a la placa de adquisición. Asegúrese de que se ha hecho clic en el botón ADC para iniciar la grabación de los canales ADC desde la placa de E/S. El botón ADC se iluminará de color naranja cuando esté encendido.
      NOTA: Si desea reproducir datos experimentales previamente grabados, el complemento File Reader se puede utilizar al principio en lugar de Rhythm FPGA. El uso de esto en combinación con APTrack permitirá la visualización y el seguimiento de la latencia de los potenciales de acción en experimentos anteriores.
   2. Inserte un filtro de paso de banda en la cadena de señal; la configuración predeterminada de 300-6.000 Hz es adecuada tanto para grabaciones humanas como de ratón. Además, inserte un divisor después de él.
   3. Inserte el complemento APTrack en la cadena de señal en un lado del divisor y LFP Viewer en el otro lado. LFP Viewer proporciona una vista tradicional de trazas de voltaje similar a un osciloscopio, que es útil durante los experimentos.
   4. Inserte un nodo de registro después del complemento. En el menú desplegable, cambie el formato de guardado de datos de binario a Open Ephys. Esto completa una cadena de señal simple que funciona bien (Figura 2); Sin embargo, se pueden agregar componentes adicionales según lo determinen los requisitos experimentales.
      NOTA: Si el nodo de registro se coloca antes del complemento en la cadena de señal, la información de seguimiento potencial de acción no se guardará.
   5. En la parte superior derecha de la GUI, haga clic en el botón de reproducción para comenzar a transmitir datos desde la placa de adquisición y visualizarlos. Para comenzar a grabar, haga clic en el botón circular de grabación junto al botón de reproducción.
      NOTA: Es fácil olvidarse de hacer clic en el registro; Registramos datos desde el momento en que comenzamos a adquirir para evitar que esto suceda.
5. Para el montaje con un estimulador analógico controlado por voltaje, siga los pasos que se describen a continuación.
   1. Encienda un estimulador de corriente constante que tiene su amplitud de estimulación controlada por una entrada de voltaje analógica. En este caso se utilizó un DS4 (Figura 1).
   2. El canal de salida 1 de PulsePal es para el comando de voltaje analógico. Divida esta señal utilizando un divisor BNC en T y, a continuación, conéctela a la entrada del estimulador de corriente constante y a la placa de E/S para que se registre el voltaje del comando.
   3. El canal de salida 2 de PulsePal es para el marcador de evento TTL de estimulación eléctrica. Conecte esto a la placa de E/S para que los marcadores de eventos TTL de estimulación se registren para que el complemento los use y para el análisis post hoc.
6. Para el montaje con un estimulador analógico controlado por voltaje, siga los pasos que se describen a continuación.
   1. Encienda un estimulador de corriente constante que tiene su amplitud de estimulación controlada por un dial de codificación giratorio. En este caso se utilizó un DS7 (Figura 1).
   2. Conecte la placa de control del motor paso a paso al motor paso a paso utilizando el cable y el soporte magnético suministrados por el fabricante.
   3. Conecte la placa de control al ordenador directamente mediante cualquier cable USB A a USB micro-B estándar. No conecte la placa de control en el lado participante del aislador USB, ya que también está conectada a una fuente de alimentación de 12 V.
   4. Si es la primera vez que usa el tablero de control, cargue el script del motor paso a paso desde GitHub al tablero de control; Esto solo debe hacerse una vez, o si se lanzan actualizaciones de software para el script del motor paso a paso.
   5. Ajuste el dial de amplitud de estimulación del estimulador de corriente constante a 0 mA. Utilice un soporte de montaje personalizado para interconectar el motor paso a paso y el dial de amplitud de estimulación. Estos pueden imprimirse en 3D, lo que permite soluciones de montaje baratas, rápidas y personalizables. Consulte GitHub para ver si ya se ha diseñado una montura para el estimulador de elección.
   6. Utilice un adaptador de barril personalizado para conectar el barril del motor paso a paso al dial de control de amplitud de estimulación. Estos adaptadores deben estar construidos de metal por razones de resistencia y durabilidad; sin embargo, las piezas impresas en 3D también serían adecuadas, aunque es posible que deban reemplazarse regularmente. Consulte GitHub para ver si ya se ha diseñado un adaptador de barril para el estimulador de su elección.
   7. Fije libremente el tablero de control/aparato del motor paso a paso al dial de control del estimulador mediante un montaje personalizado y un adaptador de barril.
      NOTA: El adaptador de montaje y barril se apretará más adelante una vez que se haya iniciado el software y el motor paso a paso, automáticamente, se ajuste a la posición cero.
   8. Conecte el PulsePal como se describe en los pasos del protocolo 2.5.2-2.5.3 (menos la conexión del canal de salida 1 a un estimulador), ya que la generación de marcadores de eventos TTL sigue siendo necesaria para el análisis y para que el complemento funcione. Además, conecte el canal de salida 2 al estimulador DS7 para activarlo.
7. Prepare la preparación del nervio de la piel del ratón como se describe a continuación.
   1. Proporcionar alimentos y agua ad libitum a ratones C57BL/6J (Charles River Laboratories, Reino Unido, Reino Unido) de 2-4 meses de edad y de ambos sexos.
   2. Después del sacrificio por sobredosis anestésica mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (≥200 mg/kg) y confirmando el cese de la circulación, diseccionar la piel desde la cara dorsal de la pata trasera del ratón y el nervio safeno, que inerva esta área, utilizando los métodos descritos por Zimmermann et ^al.23.
   3. Mantener la preparación piel-nervio en líquido intersticial sintético carbogenado (Tabla 1) a 30-32 °C en la mitad de un baño acrílico de doble cámara hecho a medida (velocidad de perfusión de 15 mL/min, volumen de 30 mL). Enhebra el nervio a través de un pequeño orificio en la cámara llena de aceite mineral y selle con vaselina. El aceite proporciona un entorno de grabación aislado.
   4. Retire dos filamentos finos del tronco del nervio con pinzas súper finas y cuelgue uno a cada lado de un electrodo de grabación bipolar de plata / cloruro de plata.
   5. Digitalice y amplifique la señal neuronal utilizando un panel de cabeza bipolar RHD2216 de 16 canales y procese con la placa de adquisición. Muestree la señal a 30 kHz, con un filtro de paso de banda de 300-6.000 Hz, y visualícela usando la GUI.
   6. Con una varilla de vidrio romo, acaricia la piel de la preparación. Use la actividad de masa de baja amplitud para confirmar que la preparación está viva.
8. Realice microneurografía de fibra C humana como se describe a continuación.
   1. Realizar microneurografía con participantes que hayan dado su consentimiento informado por escrito, como se describió anteriormente²⁴.
   2. Con el participante sentado cómodamente reclinado en una cama y apoyado con almohadas, identifique el nervio peroneo superficial con un escáner de ultrasonido y marque un área objetivo aproximadamente 5-10 cm proximal al maléolo lateral, alrededor del nivel medio de la espinilla.
   3. Esterilice la piel alrededor del área objetivo con una toallita con clorhexidina al 2% en alcohol al 70% e inserte un electrodo de referencia estéril por vía subcutánea cerca del sitio de grabación previsto a nivel de la espinilla media.
   4. Inserte un electrodo de registro estéril en el nervio peroneo superficial bajo guía de ultrasonido dentro del área objetivo.
   5. Digitalice y amplifique la señal neuronal utilizando un panel de cabeza bipolar RHD2216 de 16 canales y procese con la placa de adquisición. Muestree la señal a 30 kHz, con un filtro de paso de banda de 300-6.000 Hz, y visualícela usando la GUI.
      NOTA: El equipo de adquisición se aisló eléctricamente de la computadora portátil mediante un aislador USB 3.0 con aislamiento RMS de 5 kV y se alimentó a través de una fuente de alimentación de batería de 12 V hecha a medida.
   6. Confirme el posicionamiento intraneural exitoso acariciando suavemente la piel para revelar la actividad masiva provocada mecánicamente. Además, los participantes generalmente informan parestesia en la cara dorsolateral del pie tras una posición intraneural exitosa.

3. Configuración del software e identificación y fenotipado de neuronas periféricas

1. Configure el software como se describe a continuación.
   1. Abra la GUI (Figura 3). Si la placa de control del motor paso a paso está conectada a su PC, se detectará y se establecerá en la posición cero. Apriete el soporte personalizado y el adaptador de barril descritos en los pasos 2.6.5-2.6.7, ya que el dial de amplitud de estimulación del estimulador y el motor paso a paso están ajustados a cero.
      NOTA: Si el motor paso a paso y el dial de amplitud de estimulación no están "puestos a cero", esto puede provocar que el motor paso a paso intente girar el dial de control fuera de su rango, lo que puede causar daños.
   2. En el menú de opciones, seleccione el Canal de activación. Elija el canal ADC que contiene el marcador TTL de estimulación eléctrica del canal de salida 2 de PulsePal.
   3. En el menú de opciones, seleccione el Canal de datos y elija el canal que contiene los datos electrofisiológicos.
   4. En el panel de control de estimulación, defina las amplitudes de estimulación inicial, mínima y máxima utilizando el control deslizante. Asegúrese de que la estimulación actual se establezca por encima de 0 para que se generen marcadores TTL.
      NOTA: Algunos estimuladores tienen una relación de escala de entrada a salida que no es 1:1; Tenga esto en cuenta al seleccionar una amplitud de estimulación adecuada. Por ejemplo, se puede seleccionar una relación de salida de 1:10 en algunos sistemas de estimulación para lograr una mayor salida del estimulador de corriente constante.
   5. En el panel de control de estimulación, haga clic en F para cargar un archivo que contenga las instrucciones de estimulación. Los protocolos de estimulación eléctrica se almacenan como archivos de valores separados por comas (CSV) compuestos por las frecuencias y la duración de estimulación deseadas, lo que permite a los usuarios crear paradigmas de estimulación complejos para sus experimentos. Una plantilla de ejemplo está disponible aquí: https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv
   6. En el panel de control de estimulación, haga clic en > para comenzar el paradigma de estimulación cargada. De forma predeterminada, APTrack solicita al PulsePal que genere pulsos de onda cuadrada positiva de 0,5 ms de duración de amplitudes variables para controlar la amplitud de estimulación del estimulador de corriente constante.
   7. El gráfico ráster temporal comenzará a actualizarse con la respuesta a la estimulación eléctrica, y cada nueva respuesta de estimulación se mostrará como una nueva columna a la derecha.
2. Visualice e identifique potenciales de acción de una sola neurona.
   1. Para la detección exitosa de potenciales de acción de una sola neurona, es importante tener umbrales de imagen adecuados establecidos. En el panel Gráfico ráster temporal, ajuste los valores de umbral de imagen bajo, de detección y alto.
      1. Seleccione una combinación de colores en el menú de opciones. En el modo WHOT (White Hot) (predeterminado), los voltajes por debajo del umbral de imagen bajo se codifican en negro. Los voltajes entre la imagen baja y los umbrales de detección se codifican en escala de grises. Los voltajes por encima del umbral de detección se codifican en verde y los voltajes por encima del umbral de imagen alto se codifican en rojo.
   2. Las neuronas periféricas exhiben respuestas de latencia constante a bajas frecuencias de estimulación (<0.25 Hz), y estas respuestas están determinadas por su velocidad de conducción y la distancia entre los sitios de estimulación y registro. Con los umbrales de imagen adecuados establecidos, los eventos de cruce de umbral detectados por los algoritmos se codificarán en verde (Figura 4).
   3. Mueva sistemáticamente el electrodo estimulante alrededor del área de la piel inervada por el nervio que se está registrando, permitiendo un mínimo de tres eventos de estimulación en cada sitio. Monitoree el diagrama ráster temporal para detectar eventos de cruce de umbral (marcados en verde) que ocurren en el mismo punto de tiempo después de cada evento de estimulación eléctrica.
      NOTA: En ratones, se utilizó un estímulo de búsqueda de 5 mA. En humanos, la amplitud del estímulo de búsqueda eléctrica transcutánea se tituló a una calificación de dolor verbal tal que nunca excedió 7/10.
   4. Compruebe si hay tres eventos de cruce de umbral (barras verdes) que aparecen en una fila con la misma latencia y en la misma posición de estimulación; Esto indica la identificación de un potencial de acción neuronal periférica.
   5. Optimice la posición del electrodo estimulante identificando el punto más sensible eléctricamente del campo receptivo de la neurona objetivo y, a continuación, fije el electrodo en su posición. En este punto de la microneurografía humana, cambie al uso de agujas de electroacupuntura intradérmica (0,2 mm de diámetro) para la estimulación eléctrica bipolar, en ratones, se utiliza una sonda estimulante transcutánea personalizada para que la posición de estimulación sea constante.
3. Realizar clasificación y fenotipado sensorial de las neuronas periféricas.
   1. Estime el umbral eléctrico del potencial de acción objetivo ajustando la amplitud de la simulación manualmente o utilizando APTrack si lo desea (descrito en los pasos 4.1-4.2).
   2. Estimular el campo receptivo a 2x el umbral eléctrico estimado a una frecuencia de 0,25 Hz a lo largo del protocolo de fenotipado sensorial.
   3. Calcula la velocidad de conducción de la neurona dividiendo la distancia de conducción por la latencia de conducción. Las fibras C se pueden identificar por una velocidad de conducción de ≤2 m/s.
   4. Estimular mecánicamente el campo receptivo utilizando filamentos de von Frey para determinar el umbral mecánico para la activación. La mecanosensación se puede identificar por potenciales de acción evocados visibles en la traza de voltaje y un aumento en la latencia de la neurona, si es una fibra C, con suficiente fuerza.
   5. Caliente el campo receptivo de la neurona, observando nuevamente los potenciales de acción visibles en la traza de voltaje y un aumento en la latencia de la neurona, si es una fibra C, con suficiente aplicación de calor. Las neuronas insensibles al calor exhibirán una disminución en la latencia debido al efecto termodinámico sobre la propagación axonal.
      NOTA: En microneurografía humana, utilice un TSC-II para un control térmico rápido y preciso. En la preparación del ratón, agregue líquido intersticial sintético calentado o enfriado a una cámara de aislamiento de aluminio colocada sobre el campo receptivo para permitir el acceso a los terminales neuronales mientras restringe la rápida disipación de calor en el fluido circundante. Registre la temperatura usando un termopar.
   6. Enfríe el campo receptivo, observando nuevamente los potenciales de acción visibles en la traza de voltaje y un marcado aumento en la latencia de la neurona, si es una fibra C, con suficiente aplicación en frío. Todas las neuronas exhibirán un aumento en la latencia debido al efecto termodinámico sobre la propagación axonal, así que tenga cuidado al etiquetar las neuronas como sensibles al frío basándose solo en un aumento de latencia.

4. Seguimiento de latencia y umbral eléctrico

1. Realice el seguimiento de latencia como se describe a continuación.
   1. Después de identificar los potenciales de acción de una sola neurona en el gráfico ráster temporal, mueva el control deslizante lineal gris en el lado derecho del gráfico ráster temporal para ajustar la posición del cuadro de búsqueda.
   2. Debajo del gráfico ráster temporal, ajuste el control deslizante giratorio de ancho del cuadro de búsqueda a un ancho adecuado. Haga que el ancho del cuadro de búsqueda se reduzca para reducir la posibilidad de picos de ruido transitorios, potenciales de acción de disparo espontáneo u otros potenciales de acción de latencia constante cercanos que se identifiquen erróneamente como el potencial de acción de interés.
   3. Para comenzar a rastrear el potencial de acción objetivo, haga clic en el + debajo de la tabla de seguimiento de unidades múltiples. Se agregará una nueva fila a la tabla que contiene detalles del potencial de acción objetivo, incluida la ubicación de latencia, el porcentaje de disparo sobre 2-10 estímulos (ajustado en el menú de opciones) y la amplitud máxima detectada.
   4. Una vez que se agrega un potencial de acción a la tabla de seguimiento de unidades múltiples, el algoritmo de seguimiento de latencia (Figura 5) se ejecutará automáticamente en él en cada estimulación eléctrica posterior.
   5. Si hay varios potenciales de acción discretos visibles en la gráfica ráster temporal, agréguelos a la tabla de seguimiento de varias unidades como se describió anteriormente. El número máximo teórico de potenciales de acción que se pueden agregar a la tabla para el seguimiento simultáneo de latencia es el valor entero máximo de 32 bits.
   6. Marque la casilla Track Spike en la tabla de seguimiento de varias unidades para mover el cuadro de búsqueda a la posición adecuada para ese potencial de acción en particular, según lo determinado por el algoritmo de seguimiento de latencia. Esto permitirá monitorear el seguimiento de latencia en tiempo real y garantizar que el seguimiento siga el potencial de acción como se esperaba. El seguimiento de latencia de otros picos continuará normalmente en segundo plano.
   7. Elimine los potenciales de acción rastreados de la tabla de seguimiento de varias unidades utilizando el botón de eliminación al final de cada fila.
2. Realice un seguimiento del umbral eléctrico como se describe a continuación.
   1. Ajuste las tasas de incremento y disminución en el panel de control de estimulación entre 0.1 V y 0.5 V. Mantenga estos valores iguales y no los ajuste durante el experimento a menos que esto sea parte del paradigma experimental.
   2. Asegúrese de que la frecuencia de estimulación se establezca en una velocidad adecuada, típicamente 0.25-0.5 Hz, a menos que la modulación de la frecuencia de estimulación sea parte del paradigma experimental. El aumento de las tasas de disparo del nociceptor puede alterar el umbral eléctrico del nociceptor.
   3. Una vez que se esté rastreando correctamente un potencial de acción, marque la casilla Track Threshold en la tabla de seguimiento de varias unidades, que iniciará el algoritmo de seguimiento de umbral eléctrico (Figura 6).
      NOTA: El seguimiento del umbral eléctrico solo se ejecuta en el potencial de acción objetivo; De hecho, las tasas de disparo de otros potenciales de acción en la tabla de seguimiento de unidades múltiples se actualizarán en consecuencia a medida que cambie la amplitud de la estimulación.
   4. Ajustar la amplitud de estimulación manualmente a la estimación del umbral eléctrico; Esto reducirá el tiempo de espera para determinar el umbral eléctrico. El tiempo necesario para establecer un umbral eléctrico fiable depende de la frecuencia de estimulación, las tasas de incremento y decremento, y la diferencia en la amplitud de estimulación desde la estimulación inicial hasta el umbral eléctrico de la neurona.
   5. El software utiliza un método arriba-abajo para la estimación del umbral eléctrico de las neuronas. En la tabla de seguimiento de unidades múltiples, la velocidad de disparo se determina en 2-10 estimulaciones previas (seleccionadas en el menú de opciones). Seleccionar el número de eventos de estimulación a considerar; Un número mayor aumentará la fiabilidad de la estimación del umbral, pero tardará más en alcanzarse.
   6. Durante la microneurografía humana, es importante controlar el dolor de los estímulos eléctricos para evitar molestias excesivas de los participantes; algunas molestias son inevitables durante el estudio de los nociceptores, particularmente de las fibras C silenciosas / dormidas. Solicite regularmente calificaciones de dolor mientras la amplitud de estimulación aumenta durante el seguimiento del umbral eléctrico y permanezca cerca del estimulador de corriente constante para desconectarlo a petición del participante.
      NOTA: Alternativamente, la estimulación eléctrica se puede desconectar a través de la interfaz de usuario haciendo clic en el botón [ ] en el panel de control de estimulación.
   7. Una velocidad de disparo del 50% indica que se ha determinado el umbral eléctrico aproximado.
   8. Durante el seguimiento del umbral eléctrico, aplique una manipulación experimental al campo receptivo, como la temperatura o las manipulaciones de medicamentos. Se rastrearán los efectos de estas manipulaciones en el umbral eléctrico del nociceptor.
      NOTA: Deje tiempo suficiente para identificar un nuevo umbral de nociceptores después de la manipulación experimental.

Results

Un ejemplo representativo del software que trabaja para controlar un experimento se muestra en la Figura 7. Ajusta iterativamente la amplitud de estimulación utilizando un método arriba-abajo para encontrar efectivamente el umbral eléctrico de los nociceptores individuales. Por primera vez, demostramos la viabilidad del seguimiento del umbral eléctrico de una sola neurona en tiempo real en humanos durante la microneurografía (Figura 7A). Además, mostramos el seguimiento del umbral eléctrico en una fibra Aδ de ratón (Figura 7B). La identificación de potenciales de acción mediante el cruce de umbrales, como se usa aquí, es suficiente para rastrear umbrales eléctricos a lo largo del tiempo. Recomendamos a los usuarios que tomen medidas para minimizar el ruido eléctrico durante sus grabaciones, como el uso de una jaula de Faraday y filtros de paso de banda para mejorar la relación señal-ruido.

Para demostrar que el seguimiento del umbral eléctrico se puede utilizar como una medida de los cambios en la excitabilidad de los nociceptores en humanos, se realizó el seguimiento del umbral eléctrico durante un paradigma de calentamiento escalonado (Figura 8). El aumento de la temperatura de los terminales del nociceptor disminuyó la corriente de estimulación eléctrica requerida para provocar un potencial de acción, lo que refleja un aumento en la excitabilidad del nociceptor (Figura 8C). Esto probablemente fue causado por la generación de potenciales receptores por los canales iónicos sensibles al calor expresados en el nociceptor de fibra C¹⁴. En el paso de temperatura más alto, 44 °C, se obtuvieron potenciales de acción evocados térmicamente (Figura 8A, número de estímulo 86-96). Esto provoca un aumento en el umbral eléctrico ya que el nociceptor puede estar en un estado refractario después de una descarga de alta frecuencia. Como era de esperar, la latencia del potencial de acción rastreado disminuyó a medida que aumentaba la temperatura. Se cree que esto ocurre debido a un efecto termodinámico en la maquinaria de conducción, que aumenta la velocidad de conducción de la fibra C. Esta fibra C también puede estar exhibiendo flip-flop (Figura 8B, número de estímulo 47-54), lo que puede resultar en que la siguiente estimulación eléctrica aumente erróneamente en amplitud si el potencial de acción cae fuera de la ventana de búsqueda del algoritmo.

Figura 1: Un esquema de la configuración del equipo y las conexiones de cable requeridas para el seguimiento del umbral eléctrico del nociceptor con APTrack en roedores y humanos. Tenga en cuenta los dos métodos diferentes de controles de amplitud de estimulación: un motor paso a paso para estimuladores ajustados manualmente en nuestra configuración humana, y un PulsePal para estimuladores controlados por voltaje de entrada en nuestra configuración de roedores. (1) Un PC (Windows, Mac o Linux) que ejecute el complemento para la plataforma Open Ephys. (2) Un motor paso a paso que opera el dial de amplitud de estimulación en el DS7. (3) Un estimulador de corriente constante aprobado para su uso en humanos; aquí usamos un DS7. (4) Un optoiaislador USB 3.0, que aísla al participante humano de la PC (opcional, solo se requiere para la investigación humana). (5) Un generador de pulsos PulsePal V2, que genera marcas de tiempo TTL (canal de salida 2) y pasos de voltaje correspondientes a la amplitud de estimulación solicitada (canal de salida 1). (6) Un estimulador de corriente constante para uso en animales; aquí, usamos un DS4. (7) Una fuente de alimentación de CC para el sistema (fuente de alimentación de CC de red utilizada para la configuración de roedores y fuente de alimentación de CC de batería utilizada para la configuración humana). (8) Una junta de adquisiciones. (9) Una placa de E/S para conectar los cables coaxiales BNC que transportan las señales a grabar, como las salidas de termopar y los marcadores TTL. (10) La preparación piel-nervio del ratón sometida a registros electrofisiológicos de nociceptores. (11) Un participante humano sometido a un registro de microneurografía de fibras C en el nervio peroneo superficial. (12) Un cabecera Intan RHD2216 para la adquisición y digitalización de las grabaciones. (13) Una placa adaptadora de electrodos Intan, a la que están conectados los electrodos de grabación y que permite que la señal pase al cabezal RHD2216. (14) Un sistema de estimulación térmica que puede emitir la temperatura a través de una conexión coaxial BNC. (15) Un botón / pedal alimentado por batería de 3.3 V que se utiliza para marcar los eventos de estimulación mecánica y las aplicaciones de medicamentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cadena de señal de plantilla. La flecha roja apunta al botón para habilitar la entrada ADC desde la placa de E/S. La flecha amarilla indica el menú desplegable para seleccionar el formato de archivo Open Ephys. La flecha verde indica los botones Reproducir y Grabar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Interfaz gráfica de usuario. La GUI consta de cuatro componentes principales. (1) Panel Diagrama de trama temporal (verde) para la visualización de datos y los ajustes asociados con el control de la gráfica. Una respuesta de latencia constante que muestra una desaceleración gradual dependiente de la actividad se indica con la flecha verde. (2) Panel de control de estimulación (amarillo) para establecer los parámetros de amplitud de estimulación y cargar los scripts del paradigma de estimulación. (3) Tabla de seguimiento de unidades múltiples (azul) para agregar los potenciales de acción para rastrear y activar la latencia y el seguimiento del umbral eléctrico. (4) Menú de opciones para seleccionar los estilos de color y el canal de entrada para los disparadores de datos y TTL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Facilitación de la identificación de potenciales de acción de latencia constante a través de la visualización de datos en tiempo real en un diagrama ráster temporal utilizando APTrack. Este es un ejemplo de alta relación señal-ruido. Los datos presentados en el diagrama ráster temporal provienen de un registro de fibra C humana del nervio peroneo superficial durante la microneurografía. Voltage Trace es el complemento LFP Viewer similar a un osciloscopio dentro de Open Ephys. La interfaz de usuario de APTrack es la interfaz gráfica de usuario del plugin. El potencial de acción rastreado se indica mediante flechas verdes, y el control deslizante circular en el borde del gráfico ráster temporal es para controlar la posición del cuadro de búsqueda donde los algoritmos buscarán eventos de cruce de umbral. El artefacto de estimulación eléctrica está marcado en azul en la traza de voltaje. La amplitud de estimulación del comando de voltaje analógico se indica en rojo; Tenga en cuenta que esto puede no ser lo mismo que la amplitud de la corriente de estimulación dependiendo del factor de escala establecido en el estimulador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Representación gráfica del algoritmo de seguimiento de latencia. En términos simples, si se detecta un potencial de acción al cruzar el umbral, el cuadro de búsqueda ajustará su posición para centrarse en el momento del voltaje máximo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Representación gráfica del algoritmo de seguimiento del umbral eléctrico. En términos simples, si se detecta un potencial de acción al cruzar el umbral, la amplitud de estimulación disminuirá por la tasa de decremento. Si no se detecta ningún potencial de acción, la amplitud de la estimulación aumentará en la tasa de incremento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Seguimiento automatizado del umbral eléctrico de potenciales de acción de una sola neurona a una frecuencia de estimulación de 0,25 Hz . (A) Trazas secuenciales de una fibra C humana del nervio peroneo superficial durante un experimento de microneurografía. (B) Trazas secuenciales de una fibra Aδ de ratón del nervio safeno durante la preparación del nervio de la piel electrofisiología de la fibra provocada. Las trazas se colorearon de rojo cuando se identificó un potencial de acción, lo que resultó en una disminución en la amplitud del estímulo. El algoritmo de software encuentra efectivamente la amplitud de estímulo requerida para una probabilidad del 50% de disparo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Seguimiento del umbral eléctrico a una frecuencia de estimulación de 0,25 Hz durante la estimulación térmica de un nociceptor de fibra C humano. El eje y codifica el número de estimulación desde el inicio del paradigma. (A) Traza de voltaje durante 4.000 ms después de la estimulación eléctrica, con eventos de cruce de umbral marcados en rojo. (B) Traza de voltaje de A ampliada alrededor del potencial de acción rastreado. Los rastros fueron de color rojo cuando se detectó el potencial de acción rastreado. La línea azul vertical es la latencia de línea base de la unidad rastreada. (C) Corriente de estimulación comandada por APTrack. La línea azul vertical es el umbral eléctrico de referencia. (D) Temperatura de la sonda de estimulación térmica TCS-II del campo receptivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Compuesto	Concentración
NaCl	107,8 mM
NaHCO3	26,2 mM
Kcl	3,5 mM
NaH2PO4	1,67 mM
CaCl2	1,53 mM
MgSO4	0,69 mM
Gluconato de sodio	9,64 mM
Sacarosa	7,6 mM
Glucosa	5,55 mM

Tabla 1: Contenido del líquido intersticial sintético para la preparación piel-nervio del ratón²³.

Discussion

APTrack es un plugin de software para su uso con la plataforma Open Ephys. Hemos elegido esta plataforma porque es de código abierto, flexible y barata de implementar. Sin incluir el costo del estimulador de corriente constante, todo el equipo requerido para comenzar a usar el complemento se puede comprar por alrededor de $ 5,000 USD en el momento de escribir este artículo. Esperamos que esto permita a los investigadores implementar APTrack en sus estudios de electrofisiología de nervios periféricos más fácilmente. Además, los investigadores pueden modificar libremente el software para satisfacer sus necesidades experimentales. Es importante destacar que esta herramienta ha permitido el seguimiento del umbral eléctrico de nociceptores de fibra C individuales, por primera vez, en humanos.

Cuanto mayor sea la relación señal-ruido, mejores podrán los algoritmos identificar los potenciales de acción. La relación señal-ruido durante la microneurografía fue suficiente en la mayoría de nuestras grabaciones, pero los usuarios deben estar alertas al riesgo de degradación de la señal con el tiempo. Esto es particularmente importante para protocolos experimentales más largos, porque si la amplitud del potencial de acción rastreado cae por debajo del umbral de detección, la amplitud de estimulación aumentará erróneamente; Esto puede ser mitigado por experimentadores que monitorean el complemento y luego ajustan la configuración si es necesario. La relación señal-ruido se mejora con el filtrado de paso de banda, pero los transitorios más grandes aún pueden identificarse erróneamente como potenciales de acción si llegan durante la ventana de tiempo del cuadro de búsqueda. El riesgo de identificar erróneamente el ruido transitorio como un potencial de acción se puede reducir reduciendo la ventana de tiempo durante la cual el complemento busca potenciales de acción y optimizando la configuración del umbral. Sin embargo, todavía hay situaciones que uno puede encontrar que impiden el rendimiento del complemento. La actividad espontánea puede causar dificultades si los potenciales de acción de mayor amplitud caen dentro de la ventana del cuadro de búsqueda del algoritmo, ya que se identificarán erróneamente como el potencial de acción objetivo. Además, la actividad espontánea en la neurona de interés puede significar que la estimulación eléctrica cae durante su período refractario, causando la falla en generar un potencial de acción. Las dificultades para usar el software también pueden surgir cuando las neuronas aferentes primarias exhiben flip-flop, por lo que se estimulan ramas terminales alternativas de una sola neurona, lo que hace que el potencial de acción evocado tenga dos (o más) latencias de referencia que son mutuamente excluyentes²⁰. Durante las grabaciones de neuronas que exhibían flip-flop con altas relaciones señal-ruido, realizamos con éxito el seguimiento de latencia y umbral eléctrico aumentando el ancho del cuadro de búsqueda para encapsular todas las velocidades de conducción potenciales que exhibía la neurona. Sin embargo, el umbral eléctrico puede variar dependiendo de la rama terminal de la neurona que se está excitando, lo que probablemente se deba en parte a las diferencias en la distancia desde el sitio de la estimulación eléctrica hasta los terminales de nociceptores alternativos. El trabajo adicional en el proceso de identificación del potencial de acción para incluir, por ejemplo, la coincidencia de plantillas es factible y podría integrarse en este software. Los complementos GUI para la parada de banda o la filtración de ruido adaptativo también podrían usarse aguas arriba de APTrack en la cadena de señal si se desarrollan.

Consideramos que el umbral eléctrico determinado es la corriente requerida para provocar un potencial de acción el 50% del tiempo, sobre un número definido por el usuario de estímulos eléctricos, típicamente 2-10. La morfología de la estimulación eléctrica es de 0,5 ms y pulsos positivos de onda cuadrada. Esto no es lo mismo que determinar la rheobase, una medida comúnmente utilizada de excitabilidad neuronal. El plugin podría adaptarse para determinar la rheobase. Sin embargo, perseguimos una medida más simple, ya que los cambios dinámicos en la excitabilidad, como los que se hipotetizan que ocurren durante el calentamiento, habrían sido más difíciles de cuantificar con cambios en rheobase que nuestra estimación del umbral eléctrico.

Este software se puede utilizar tanto en experimentos humanos como con roedores. Esto es posible gracias al soporte flexible para los sistemas de estimulación eléctrica. El software funcionará con cualquier estimulador que acepte un voltaje de comando analógico o que se pueda interconectar manualmente con un motor paso a paso. Para la microneurografía, lo usamos con un estimulador de corriente constante marcado CE que fue diseñado para su uso en investigación humana y tenía su estimulación controlada por un dial. Los estimuladores que aceptan comandos de voltaje analógicos pueden ser ruidosos ya que no desconectan el circuito entre estímulos, lo que significa que cualquier zumbido o ruido de 50/60 Hz en la entrada analógica se transmitirá a la grabación. Un estimulador que requiere una señal de disparo TLL adicional para conectar el circuito, permitiendo generar un estímulo a una corriente análoga a la entrada de voltaje analógica, es ideal para usar con el complemento. Esto evita que el ruido se transmita a la grabación entre estímulos.

El software utiliza un método simple de arriba hacia abajo para estimar el umbral eléctrico. Esto se ha utilizado en pruebas psicofísicas durante muchas décadas²⁵. En línea con el método arriba-abajo, el algoritmo de seguimiento del umbral eléctrico para modular la amplitud de estimulación solo considera la amplitud y la respuesta de la estimulación anterior al calcular la amplitud de la siguiente estimulación. Esto significa que la amplitud de estimulación oscilará alrededor del umbral eléctrico verdadero, produciendo así una tasa de disparo del 50%, suponiendo que el umbral sea estable. El tamaño mínimo de un incremento o disminución es 0.01 V; esto equivale a 0,01 mA suponiendo que el estimulador tenga una relación de entrada-salida de 1 V:1 mA y una resolución suficiente para lograr cambios de paso tan pequeños. El plugin actualizará la estimación en vivo del umbral eléctrico del potencial de acción objetivo cada vez que alcance una tasa de disparo del 50% sobre un número definido por el usuario de estímulos previos (2-10). Post hoc, recomendamos usar un promedio móvil de la amplitud de estimulación en los últimos 2-10 estímulos para estimar el umbral eléctrico, y debe tenerse en cuenta que esta estimación solo será precisa cuando la velocidad de disparo sea relativamente estable al 50%. Tanto en las estimaciones en vivo como post hoc del umbral eléctrico, hay un equilibrio de resolución, confiabilidad y tiempo a considerar. El uso de pasos de incremento y disminución más pequeños aumentará la precisión de la estimación del umbral eléctrico, pero aumentará el tiempo necesario para encontrar el nuevo umbral eléctrico inicialmente y después de la perturbación. Calcular el umbral eléctrico sobre un mayor número de estímulos previos proporcionará una mejor fiabilidad, pero aumentará el tiempo requerido para alcanzar una estimación precisa.

APTrack fue diseñado para su uso en registros de nervios periféricos, específicamente para rastrear los umbrales eléctricos de las fibras C durante perturbaciones experimentales y patológicas durante períodos en los que la latencia potencial de acción puede variar dependiendo de la actividad neuronal subyacente. Este método permitirá el examen no solo de la excitabilidad axonal sino también de los potenciales generadores de nociceptores en voluntarios y pacientes sanos. Anticipamos que otros campos de la electrofisiología pueden adoptar y adaptar esta herramienta para su uso en cualquier experimento que requiera el seguimiento del umbral eléctrico de una actividad bloqueada por estímulos. Por ejemplo, esto podría adaptarse fácilmente para la estimulación optogenética con pulsos de luz impulsados desde APTrack. El plugin es de código abierto y está disponible para los investigadores bajo una licencia GPLv3. Se basa en la plataforma Open Ephys, que es un sistema de adquisición de datos adaptable, de bajo costo y de código abierto. El complemento proporciona ganchos adicionales para que los complementos posteriores extraigan la información potencial de acción y proporcionen interfaces de usuario adicionales o paradigmas adaptativos. El complemento proporciona una interfaz de usuario simple para la visualización y el seguimiento de la latencia de los potenciales de acción en tiempo real. También puede reproducir datos anteriores y visualizarlos utilizando el gráfico ráster temporal. Además, también puede realizar un seguimiento de latencia durante la reproducción de datos anteriores. Si bien hay otros paquetes de software disponibles para el seguimiento de latencia en tiempo real, no son de código abierto y no pueden realizar un seguimiento de umbral eléctrico^26,27. APTrack tiene una ventaja sobre los métodos tradicionales para identificar potenciales de acción de latencia constante a partir de trazas de voltaje, ya que utiliza un gráfico ráster temporal para la visualización de datos. Además, nuestras experiencias de uso en experimentos con bajas relaciones señal-ruido han indicado que el método de visualización del diagrama ráster temporal permite la identificación de potenciales de acción de latencia constante que de otro modo podrían haberse perdido.

El seguimiento del umbral del nervio entero es un método ampliamente utilizado para evaluar la excitabilidad axonal¹³. El seguimiento del umbral eléctrico de una sola neurona en fibras C de roedores se ha utilizado previamente para cuantificar la excitabilidad del nociceptor¹⁴, y se reconoce su utilidad en humanos^10,11; Sin embargo, hasta ahora, esto no era posible. Proporcionamos una novedosa herramienta de código abierto para medir directamente la excitabilidad de un solo nociceptor en estudios electrofisiológicos de nervios periféricos humanos y roedores. APTrack permite el seguimiento de umbral eléctrico en tiempo real, de código abierto, de potenciales de acción de una sola neurona en humanos, por primera vez. Anticipamos que facilitará los estudios traslacionales de nociceptores entre roedores y humanos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fuente de alimentación de 12 V CC	NA	NA	Para alimentar uStepper S-lite. Necesario para estimuladores controlados por dial.
Placa adaptadora de electrodo de 36 pines	Intan Technology	C3410	APTrack Dependency. Para conectar la entrada del electrodo a la cabecera. $255 USD a marzo de 2021.
APTrack Plugin	NA	NA https://github.com/Microneurography/APTrack
Electrodo de registro bipolar de Ag / AgCl	NA		Electrodo de registro personalizado para la preparación de la piel y el nervio. O equivalente.
Electrodo estimulante concéntrico bipolar	World Precision Instruments	SNE-100	Para la estimulación eléctrica en la preparación de la piel y el nervio del ratón. O equivalente.
Electrodo estimulante transcutáneo bipolar	NA personalizado		Para la estimulación eléctrica transcutánea mientras se buscan potenciales de acción de una sola neurona durante la microneurografía.
Divisor BNC T (1+)	NA	NA	Dependencia de APTrack. Cualquier divisor BNC T estándar.
Cables BNC a BNC (3+)	NA	NA	APTrack Dependencia. Cualquier cable BNC estándar.
C6H11NaO7	Merck	S2054	Preparación piel-nervio constituyente del fluido intersticial sintético. O equivalente.
CaCl2	Merck	C5670	Preparación piel-nervio constituyente del fluido intersticial sintético. O equivalente.
Digitimer DS4 Estimulador de corriente constante Digitimer		DS4	Estimulador de corriente constante para la experimentación con animales. 1.695 GBP a septiembre de 2022.
Digitimer DS7 Estimulador de corriente constante	Digitimer	DS7A	Estimulador de corriente constante para la investigación humana. 3.400 GBP a septiembre de 2022.
Electroacupuntura Classic Plus Electrodos Estimulantes	Harmony Medical	NA	Para la estimulación eléctrica intradérmica en posición fija de la cara dorsal del pie durante la microneurografía humana.
Glucosa	Fisher Scientific	G/0450/60	Preparación piel-nervio: constituyente del líquido intersticial sintético. O equivalente.
Cable HDMI	NA	NA	Dependencia de APTrack. Cualquier cable HMDI pasivo estándar. Para conectar la placa de E/S de OE a la placa de adquisición de equipo original.
KCl	Merck	P9541	Preparación piel-nervio: constituyente del líquido intersticial sintético. O equivalente.
MgSO4	Acros Organics	213115000	Preparación piel-nervio, constituyente sintético del líquido intersticial. O equivalente.
Aceite mineral	Merck	330779	Aislamiento eléctrico para el registro de nervios en la preparación de la piel y los nervios. O equivalente.
NaCl	Merck	S9888	Preparación piel-nervio: constituyente sintético del líquido intersticial. O equivalente.
NaHCO3	Merck	S6014	Preparación piel-nervio constituyente del líquido intersticial sintético. O equivalente.
NaHCO3	Merck	S0751	Preparación piel-nervio constituyente del fluido intersticial sintético. O equivalente.
Abrir el tablero de adquisición de Ephys	Abrir Ephys	NA	APTrack Dependencia. Incluye cable USB para conectar al ordenador y a la toma de corriente. y euro; 2.955 EUR a septiembre de 2022.
Abrir la interfaz gráfica de usuario de Ephys Abrir	Ephys	NA	https://github.com/open-ephys/plugin-GUI
Abrir la placa de E/S Abrir Ephys		NA	Dependencia de APTrack. Para entradas de voltaje ADC a través de cables BNC. y euro; 12,5 EUR sin conectores, y euro; 85 EUR con conectores a partir de septiembre de 2022.
Dependencia de PulsePal v2	Sanworks	1102	APTrack. DAC de código abierto y generador de trenes. $725 USD preensamblado a septiembre de 2022. Aprox. $275 USD para automontaje.
Cable SPI RHD de 6 pies	Tecnología Intan	C3206	APTrack Dependencia. Para conectar la etapa principal a la placa de adquisición OE. $295 USD a marzo de 2021
RHD2216 16ch Bipolar Headstage	Intan Technology	C3313	APTrack Dependency. Para la adquisición y digitalización de datos. $725 USD a marzo de 2021. O equivalente RHD2000 cabecera de la serie.
Sacarosa	Fisher Scientific	S/8560/60	Preparación piel-nervio constituyente del fluido intersticial sintético. O equivalente.
Estimulador térmico TCS-II	QST. Lab	NA	Para la estimulación térmica de los campos receptores de nociceptores durante la microneurografía humana.
Par de Microelectrodos de Tungsteno (Activo + Referencia)	FHC	30085	Para grabaciones de microneurografía. 35mm.
ecógrafo iQ+	Butterfly Network	NA	Para la inserción de electrodos guiados por ultrasonido durante la microneurografía.
USB 3.0 5kV RMS	Isolation Inota Technology	7055-D	Para aislar a los participantes de la microneuroografía humana de la computadora. 459 EUR a septiembre de 2022.
Cable USB-A a micro USB-B (2)	NA	NA	APTrack Dependencia. Para conectar el ordenador a PulsePal y a uStepper S-lite si se utiliza la interfaz stepper-estimulador.
uStepper S-lite + motor NEMA17	uStepper	NA	Para interactuar con los estimuladores a través de un dial de control. € 50 EUR a partir de septiembre de 2022.
Filamentos Von Frey	Ugo Basile	37450-275	Para la estimulación mecánica de campos receptivos durante el fenotipado sensorial de nociceptores.