Seguimiento de umbral eléctrico de circuito cerrado en tiempo real de código abierto para la investigación traslacional del dolor

Los nociceptores son neuronas aferentes primarias en el sistema nervioso periférico que se activan por eventos que dañan el tejido abierta o potencialmente y desempeñan un papel protector crítico en el dolor agudo¹. Los registros electrofisiológicos de los nociceptores de fibra C y fibra Aδ en modelos animales, voluntarios humanos sanos y pacientes han revelado sensibilización y actividad espontánea anormal en una amplia gama de condiciones de dolor 2,3,4,5,6,7. La comprensión de los mecanismos que subyacen a estos cambios en la excitabilidad de los nociceptores en los pacientes podría permitir intervenciones terapéuticas dirigidas⁸. Sin embargo, hay pocas herramientas para evaluar directamente la excitabilidad de los nociceptores, particularmente en pacientes⁹, pero el potencial para la utilidad de tales herramientas es bien reconocido^10,11.

El seguimiento del umbral eléctrico de todo el nervio se puede utilizar para examinar la excitabilidad axonal en humanos¹². Sin embargo, como las neuronas periféricas grandes, mielinizadas, contribuyen desproporcionadamente a la amplitud del potencial de acción del compuesto sensorial, el seguimiento del umbral eléctrico de todo el nervio no permite la evaluación de la función de la fibra C^11,13. De hecho, en un estudio previo, el seguimiento del umbral eléctrico de todo el nervio en cohortes de dolor neuropático crónico con neuropatía diabética y polineuropatía inducida por quimioterapia no mostró diferencias en la excitabilidad axonal¹¹.

En un estudio anterior, el seguimiento del umbral eléctrico a nivel de una sola neurona se utilizó para examinar la excitabilidad de los nociceptores de fibra C durante los registros de fibra burlada en una preparación ex vivo de piel y nervio de rata¹⁴. Los autores demostraron que un aumento de la concentración de potasio, las condiciones ácidas y la bradiquinina aumentaron la excitabilidad del nociceptor de fibra C, como se refleja en un umbral eléctrico reducido para la generación de potencial de acción. Además, el calentamiento del campo receptivo de los nociceptores sensibles al calor redujo su umbral eléctrico, mientras que los nociceptores insensibles al calor mostraron un aumento en su umbral eléctrico¹⁴. Esto proporciona una prueba importante de que el seguimiento del umbral eléctrico de una sola neurona es posible y puede ser útil, pero actualmente no hay soluciones de software y / o hardware disponibles para permitir tales investigaciones, particularmente para estudios en humanos.

En humanos, la microneurografía es el único método disponible para evaluar directamente las propiedades electrofisiológicas de las fibras C¹⁵. Este abordaje ha sido utilizado para demostrar disfunción de los nociceptores en pacientes con dolor crónico 2,3,4,5,6,7. La microneurografía puede detectar potenciales de acción de una sola neurona; sin embargo, debido a las bajas relaciones señal-ruido, los investigadores utilizan la técnica de marcado para caracterizar la actividad de la fibra C¹⁶. En la técnica de marcado, la estimulación eléctrica supraumbral se aplica a los campos receptivos de fibra C en la piel. Esta estimulación eléctrica genera un potencial de acción que ocurre a una latencia constante, que está determinada por la velocidad de conducción de la fibra C. Las fibras C exhiben una desaceleración dependiente de la actividad, por lo que su velocidad de conducción se reduce y, por lo tanto, su latencia de conducción aumenta durante los períodos de descarga potencial de acción¹⁷. En condiciones basales, las fibras C normalmente no generan potenciales de acción en ausencia de estímulos nocivos y, por lo tanto, su latencia de conducción en respuesta a la estimulación eléctrica de baja frecuencia es constante. Los estímulos mecánicos, térmicos o farmacológicos, que evocan el disparo, inducen una desaceleración dependiente de la actividad, lo que aumenta la latencia de los potenciales de acción evocados por la estimulación eléctrica de baja frecuencia concomitante. Esto permite la identificación objetiva de las respuestas a los estímulos no eléctricos aplicados en el contexto de una baja relación señal-ruido. Por lo tanto, la desaceleración dependiente de la actividad puede ser utilizada para caracterizar funcionalmente las fibras C¹⁶. De hecho, diferentes clases funcionales de fibras C exhiben patrones distintivos de desaceleración dependiente de la actividad en paradigmas de estimulación eléctrica que implican variar la frecuencia de estimulación^18,19. Esta variabilidad en la latencia de los potenciales de acción de la fibra C presenta un desafío para los algoritmos diseñados para monitorizarlos.

La actividad continua en un nociceptor conduce a una mayor variabilidad en su latencia durante la estimulación eléctrica de baja frecuencia, y esto se debe nuevamente a la desaceleración dependiente de la actividad. Este aumento de la variabilidad, o jitter, es una medida indirecta cuantificable de la excitabilidad². Otras causas de variabilidad en la latencia del potencial de acción incluyen flip-flop, donde se estimulan ramas terminales alternativas de una sola neurona, lo que hace que el potencial de acción evocado tenga dos (o más) latencias de referencia que son mutuamente excluyentes²⁰. Finalmente, los cambios en la temperatura de las ramas terminales de una neurona periférica también causan cambios de latencia de potencial de acción de manera termodinámica, con el calentamiento aumentando la velocidad de conducción y el enfriamiento disminuyendo la velocidad de conducción¹⁹. Por lo tanto, cualquier software que busque realizar un seguimiento de umbral eléctrico de bucle cerrado de fibras C nociceptivas debe permitir cambios en la latencia en los potenciales de acción evocados eléctricamente.

Para lograr nuestro objetivo de seguimiento de umbral eléctrico entre especies de nociceptores de fibra C, desarrollamos APTrack, un complemento de software de código abierto para la plataforma Open Ephys²¹, para permitir el seguimiento de umbral eléctrico en tiempo real, de circuito cerrado, y el seguimiento de latencia. Proporcionamos datos de prueba de concepto que demuestran que es posible el seguimiento del umbral eléctrico del nociceptor de fibra C durante la microneurografía humana. Además, demostramos que esta herramienta se puede utilizar en electrofisiología de fibra burlada ex vivo de roedores, lo que permite estudios traslacionales entre humanos y roedores. Aquí, describiremos en detalle cómo los investigadores pueden implementar y usar esta herramienta para ayudar a su estudio de la función y excitabilidad de los nociceptores.

Los experimentos de microneurografía humana fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación de la Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad de Bristol (número de referencia: 51882). Todos los participantes del estudio dieron su consentimiento informado por escrito. Los experimentos con animales se realizaron en la Universidad de Bristol de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986 después de la aprobación de la Junta de Bienestar Animal y Revisión Ética de la Universidad de Bristol y estaban cubiertos por una Licencia de Proyecto.

1. Instalación de Open Ephys GUI y APTrack

1. Consulte la documentación del software para encontrar la versión más reciente de la interfaz gráfica de usuario (GUI) de Open Ephys compatible (https://github.com/Microneurography/APTrack#readme) y, a continuación, descargue e instale la GUI.
2. Instale una versión compatible de la GUI desde la siguiente URL: https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases.
3. Descargue la última versión de GitHub: https://github.com/Microneurography/APTrack/releases. Para una computadora con Windows, copie el archivo .dll en la carpeta de complementos, que generalmente se encuentra en C: \ Archivos de programa \ Open Ephys \ plugins. Para un ordenador MacOS, copie el archivo .bundle en la carpeta Contents/PlugIns del paquete.

2. Montaje del aparato de registro y estimulación

1. Conecte la placa de adquisición al ordenador mediante el cable suministrado por el fabricante y enciéndalo.
   NOTA: Para la microneurografía humana, se utilizó un aislador USB 3.0 para aislar eléctricamente al participante de la computadora, y la placa de adquisición fue alimentada por una batería portátil en lugar de la fuente de alimentación de voltaje de red utilizada para estudios con roedores. Todas las conexiones USB, excluyendo la placa de control del motor paso a paso, se pasaron a través del aislador USB durante los estudios en humanos.
2. Conecte la placa de E/S al puerto de entrada analógico de la placa de adquisición. Conecte un cabezal de grabación Intan RHD a la placa de adquisición mediante un cable de interfaz serie-periférica (SPI).
   NOTA: Aquí se utilizó el cabecera bipolar Intan de 16 canales, pero se pueden usar otras cabeceras monopolares de la serie RHD2000.
3. Conecte el PulsePal al ordenador²². Para el montaje con un estimulador analógico controlado por voltaje (por ejemplo, un DS4) utilizando un PulsePal, como con las grabaciones de fibra provocada del ratón, siga los pasos 2.5.1-2.5.3; para el montaje con un estimulador basado en un codificador rotativo (por ejemplo, un DS7) utilizando un motor paso a paso, como con los registros de microneurografía humana, siga los pasos 2.6.1-2.6.8 (Figura 1).
4. Cree la cadena de señal en la GUI como se describe a continuación.
   1. Inserte el complemento Rhythm FPGA en la cadena de señal haciendo clic izquierdo y arrastrándolo a la cadena de señal; esto conecta la GUI a la placa de adquisición. Asegúrese de que se ha hecho clic en el botón ADC para iniciar la grabación de los canales ADC desde la placa de E/S. El botón ADC se iluminará de color naranja cuando esté encendido.
      NOTA: Si desea reproducir datos experimentales previamente grabados, el complemento File Reader se puede utilizar al principio en lugar de Rhythm FPGA. El uso de esto en combinación con APTrack permitirá la visualización y el seguimiento de la latencia de los potenciales de acción en experimentos anteriores.
   2. Inserte un filtro de paso de banda en la cadena de señal; la configuración predeterminada de 300-6.000 Hz es adecuada tanto para grabaciones humanas como de ratón. Además, inserte un divisor después de él.
   3. Inserte el complemento APTrack en la cadena de señal en un lado del divisor y LFP Viewer en el otro lado. LFP Viewer proporciona una vista tradicional de trazas de voltaje similar a un osciloscopio, que es útil durante los experimentos.
   4. Inserte un nodo de registro después del complemento. En el menú desplegable, cambie el formato de guardado de datos de binario a Open Ephys. Esto completa una cadena de señal simple que funciona bien (Figura 2); Sin embargo, se pueden agregar componentes adicionales según lo determinen los requisitos experimentales.
      NOTA: Si el nodo de registro se coloca antes del complemento en la cadena de señal, la información de seguimiento potencial de acción no se guardará.
   5. En la parte superior derecha de la GUI, haga clic en el botón de reproducción para comenzar a transmitir datos desde la placa de adquisición y visualizarlos. Para comenzar a grabar, haga clic en el botón circular de grabación junto al botón de reproducción.
      NOTA: Es fácil olvidarse de hacer clic en el registro; Registramos datos desde el momento en que comenzamos a adquirir para evitar que esto suceda.
5. Para el montaje con un estimulador analógico controlado por voltaje, siga los pasos que se describen a continuación.
   1. Encienda un estimulador de corriente constante que tiene su amplitud de estimulación controlada por una entrada de voltaje analógica. En este caso se utilizó un DS4 (Figura 1).
   2. El canal de salida 1 de PulsePal es para el comando de voltaje analógico. Divida esta señal utilizando un divisor BNC en T y, a continuación, conéctela a la entrada del estimulador de corriente constante y a la placa de E/S para que se registre el voltaje del comando.
   3. El canal de salida 2 de PulsePal es para el marcador de evento TTL de estimulación eléctrica. Conecte esto a la placa de E/S para que los marcadores de eventos TTL de estimulación se registren para que el complemento los use y para el análisis post hoc.
6. Para el montaje con un estimulador analógico controlado por voltaje, siga los pasos que se describen a continuación.
   1. Encienda un estimulador de corriente constante que tiene su amplitud de estimulación controlada por un dial de codificación giratorio. En este caso se utilizó un DS7 (Figura 1).
   2. Conecte la placa de control del motor paso a paso al motor paso a paso utilizando el cable y el soporte magnético suministrados por el fabricante.
   3. Conecte la placa de control al ordenador directamente mediante cualquier cable USB A a USB micro-B estándar. No conecte la placa de control en el lado participante del aislador USB, ya que también está conectada a una fuente de alimentación de 12 V.
   4. Si es la primera vez que usa el tablero de control, cargue el script del motor paso a paso desde GitHub al tablero de control; Esto solo debe hacerse una vez, o si se lanzan actualizaciones de software para el script del motor paso a paso.
   5. Ajuste el dial de amplitud de estimulación del estimulador de corriente constante a 0 mA. Utilice un soporte de montaje personalizado para interconectar el motor paso a paso y el dial de amplitud de estimulación. Estos pueden imprimirse en 3D, lo que permite soluciones de montaje baratas, rápidas y personalizables. Consulte GitHub para ver si ya se ha diseñado una montura para el estimulador de elección.
   6. Utilice un adaptador de barril personalizado para conectar el barril del motor paso a paso al dial de control de amplitud de estimulación. Estos adaptadores deben estar construidos de metal por razones de resistencia y durabilidad; sin embargo, las piezas impresas en 3D también serían adecuadas, aunque es posible que deban reemplazarse regularmente. Consulte GitHub para ver si ya se ha diseñado un adaptador de barril para el estimulador de su elección.
   7. Fije libremente el tablero de control/aparato del motor paso a paso al dial de control del estimulador mediante un montaje personalizado y un adaptador de barril.
      NOTA: El adaptador de montaje y barril se apretará más adelante una vez que se haya iniciado el software y el motor paso a paso, automáticamente, se ajuste a la posición cero.
   8. Conecte el PulsePal como se describe en los pasos del protocolo 2.5.2-2.5.3 (menos la conexión del canal de salida 1 a un estimulador), ya que la generación de marcadores de eventos TTL sigue siendo necesaria para el análisis y para que el complemento funcione. Además, conecte el canal de salida 2 al estimulador DS7 para activarlo.
7. Prepare la preparación del nervio de la piel del ratón como se describe a continuación.
   1. Proporcionar alimentos y agua ad libitum a ratones C57BL/6J (Charles River Laboratories, Reino Unido, Reino Unido) de 2-4 meses de edad y de ambos sexos.
   2. Después del sacrificio por sobredosis anestésica mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (≥200 mg/kg) y confirmando el cese de la circulación, diseccionar la piel desde la cara dorsal de la pata trasera del ratón y el nervio safeno, que inerva esta área, utilizando los métodos descritos por Zimmermann et ^al.23.
   3. Mantener la preparación piel-nervio en líquido intersticial sintético carbogenado (Tabla 1) a 30-32 °C en la mitad de un baño acrílico de doble cámara hecho a medida (velocidad de perfusión de 15 mL/min, volumen de 30 mL). Enhebra el nervio a través de un pequeño orificio en la cámara llena de aceite mineral y selle con vaselina. El aceite proporciona un entorno de grabación aislado.
   4. Retire dos filamentos finos del tronco del nervio con pinzas súper finas y cuelgue uno a cada lado de un electrodo de grabación bipolar de plata / cloruro de plata.
   5. Digitalice y amplifique la señal neuronal utilizando un panel de cabeza bipolar RHD2216 de 16 canales y procese con la placa de adquisición. Muestree la señal a 30 kHz, con un filtro de paso de banda de 300-6.000 Hz, y visualícela usando la GUI.
   6. Con una varilla de vidrio romo, acaricia la piel de la preparación. Use la actividad de masa de baja amplitud para confirmar que la preparación está viva.
8. Realice microneurografía de fibra C humana como se describe a continuación.
   1. Realizar microneurografía con participantes que hayan dado su consentimiento informado por escrito, como se describió anteriormente²⁴.
   2. Con el participante sentado cómodamente reclinado en una cama y apoyado con almohadas, identifique el nervio peroneo superficial con un escáner de ultrasonido y marque un área objetivo aproximadamente 5-10 cm proximal al maléolo lateral, alrededor del nivel medio de la espinilla.
   3. Esterilice la piel alrededor del área objetivo con una toallita con clorhexidina al 2% en alcohol al 70% e inserte un electrodo de referencia estéril por vía subcutánea cerca del sitio de grabación previsto a nivel de la espinilla media.
   4. Inserte un electrodo de registro estéril en el nervio peroneo superficial bajo guía de ultrasonido dentro del área objetivo.
   5. Digitalice y amplifique la señal neuronal utilizando un panel de cabeza bipolar RHD2216 de 16 canales y procese con la placa de adquisición. Muestree la señal a 30 kHz, con un filtro de paso de banda de 300-6.000 Hz, y visualícela usando la GUI.
      NOTA: El equipo de adquisición se aisló eléctricamente de la computadora portátil mediante un aislador USB 3.0 con aislamiento RMS de 5 kV y se alimentó a través de una fuente de alimentación de batería de 12 V hecha a medida.
   6. Confirme el posicionamiento intraneural exitoso acariciando suavemente la piel para revelar la actividad masiva provocada mecánicamente. Además, los participantes generalmente informan parestesia en la cara dorsolateral del pie tras una posición intraneural exitosa.

3. Configuración del software e identificación y fenotipado de neuronas periféricas

1. Configure el software como se describe a continuación.
   1. Abra la GUI (Figura 3). Si la placa de control del motor paso a paso está conectada a su PC, se detectará y se establecerá en la posición cero. Apriete el soporte personalizado y el adaptador de barril descritos en los pasos 2.6.5-2.6.7, ya que el dial de amplitud de estimulación del estimulador y el motor paso a paso están ajustados a cero.
      NOTA: Si el motor paso a paso y el dial de amplitud de estimulación no están "puestos a cero", esto puede provocar que el motor paso a paso intente girar el dial de control fuera de su rango, lo que puede causar daños.
   2. En el menú de opciones, seleccione el Canal de activación. Elija el canal ADC que contiene el marcador TTL de estimulación eléctrica del canal de salida 2 de PulsePal.
   3. En el menú de opciones, seleccione el Canal de datos y elija el canal que contiene los datos electrofisiológicos.
   4. En el panel de control de estimulación, defina las amplitudes de estimulación inicial, mínima y máxima utilizando el control deslizante. Asegúrese de que la estimulación actual se establezca por encima de 0 para que se generen marcadores TTL.
      NOTA: Algunos estimuladores tienen una relación de escala de entrada a salida que no es 1:1; Tenga esto en cuenta al seleccionar una amplitud de estimulación adecuada. Por ejemplo, se puede seleccionar una relación de salida de 1:10 en algunos sistemas de estimulación para lograr una mayor salida del estimulador de corriente constante.
   5. En el panel de control de estimulación, haga clic en F para cargar un archivo que contenga las instrucciones de estimulación. Los protocolos de estimulación eléctrica se almacenan como archivos de valores separados por comas (CSV) compuestos por las frecuencias y la duración de estimulación deseadas, lo que permite a los usuarios crear paradigmas de estimulación complejos para sus experimentos. Una plantilla de ejemplo está disponible aquí: https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv
   6. En el panel de control de estimulación, haga clic en > para comenzar el paradigma de estimulación cargada. De forma predeterminada, APTrack solicita al PulsePal que genere pulsos de onda cuadrada positiva de 0,5 ms de duración de amplitudes variables para controlar la amplitud de estimulación del estimulador de corriente constante.
   7. El gráfico ráster temporal comenzará a actualizarse con la respuesta a la estimulación eléctrica, y cada nueva respuesta de estimulación se mostrará como una nueva columna a la derecha.
2. Visualice e identifique potenciales de acción de una sola neurona.
   1. Para la detección exitosa de potenciales de acción de una sola neurona, es importante tener umbrales de imagen adecuados establecidos. En el panel Gráfico ráster temporal, ajuste los valores de umbral de imagen bajo, de detección y alto.
      1. Seleccione una combinación de colores en el menú de opciones. En el modo WHOT (White Hot) (predeterminado), los voltajes por debajo del umbral de imagen bajo se codifican en negro. Los voltajes entre la imagen baja y los umbrales de detección se codifican en escala de grises. Los voltajes por encima del umbral de detección se codifican en verde y los voltajes por encima del umbral de imagen alto se codifican en rojo.
   2. Las neuronas periféricas exhiben respuestas de latencia constante a bajas frecuencias de estimulación (<0.25 Hz), y estas respuestas están determinadas por su velocidad de conducción y la distancia entre los sitios de estimulación y registro. Con los umbrales de imagen adecuados establecidos, los eventos de cruce de umbral detectados por los algoritmos se codificarán en verde (Figura 4).
   3. Mueva sistemáticamente el electrodo estimulante alrededor del área de la piel inervada por el nervio que se está registrando, permitiendo un mínimo de tres eventos de estimulación en cada sitio. Monitoree el diagrama ráster temporal para detectar eventos de cruce de umbral (marcados en verde) que ocurren en el mismo punto de tiempo después de cada evento de estimulación eléctrica.
      NOTA: En ratones, se utilizó un estímulo de búsqueda de 5 mA. En humanos, la amplitud del estímulo de búsqueda eléctrica transcutánea se tituló a una calificación de dolor verbal tal que nunca excedió 7/10.
   4. Compruebe si hay tres eventos de cruce de umbral (barras verdes) que aparecen en una fila con la misma latencia y en la misma posición de estimulación; Esto indica la identificación de un potencial de acción neuronal periférica.
   5. Optimice la posición del electrodo estimulante identificando el punto más sensible eléctricamente del campo receptivo de la neurona objetivo y, a continuación, fije el electrodo en su posición. En este punto de la microneurografía humana, cambie al uso de agujas de electroacupuntura intradérmica (0,2 mm de diámetro) para la estimulación eléctrica bipolar, en ratones, se utiliza una sonda estimulante transcutánea personalizada para que la posición de estimulación sea constante.
3. Realizar clasificación y fenotipado sensorial de las neuronas periféricas.
   1. Estime el umbral eléctrico del potencial de acción objetivo ajustando la amplitud de la simulación manualmente o utilizando APTrack si lo desea (descrito en los pasos 4.1-4.2).
   2. Estimular el campo receptivo a 2x el umbral eléctrico estimado a una frecuencia de 0,25 Hz a lo largo del protocolo de fenotipado sensorial.
   3. Calcula la velocidad de conducción de la neurona dividiendo la distancia de conducción por la latencia de conducción. Las fibras C se pueden identificar por una velocidad de conducción de ≤2 m/s.
   4. Estimular mecánicamente el campo receptivo utilizando filamentos de von Frey para determinar el umbral mecánico para la activación. La mecanosensación se puede identificar por potenciales de acción evocados visibles en la traza de voltaje y un aumento en la latencia de la neurona, si es una fibra C, con suficiente fuerza.
   5. Caliente el campo receptivo de la neurona, observando nuevamente los potenciales de acción visibles en la traza de voltaje y un aumento en la latencia de la neurona, si es una fibra C, con suficiente aplicación de calor. Las neuronas insensibles al calor exhibirán una disminución en la latencia debido al efecto termodinámico sobre la propagación axonal.
      NOTA: En microneurografía humana, utilice un TSC-II para un control térmico rápido y preciso. En la preparación del ratón, agregue líquido intersticial sintético calentado o enfriado a una cámara de aislamiento de aluminio colocada sobre el campo receptivo para permitir el acceso a los terminales neuronales mientras restringe la rápida disipación de calor en el fluido circundante. Registre la temperatura usando un termopar.
   6. Enfríe el campo receptivo, observando nuevamente los potenciales de acción visibles en la traza de voltaje y un marcado aumento en la latencia de la neurona, si es una fibra C, con suficiente aplicación en frío. Todas las neuronas exhibirán un aumento en la latencia debido al efecto termodinámico sobre la propagación axonal, así que tenga cuidado al etiquetar las neuronas como sensibles al frío basándose solo en un aumento de latencia.

4. Seguimiento de latencia y umbral eléctrico

1. Realice el seguimiento de latencia como se describe a continuación.
   1. Después de identificar los potenciales de acción de una sola neurona en el gráfico ráster temporal, mueva el control deslizante lineal gris en el lado derecho del gráfico ráster temporal para ajustar la posición del cuadro de búsqueda.
   2. Debajo del gráfico ráster temporal, ajuste el control deslizante giratorio de ancho del cuadro de búsqueda a un ancho adecuado. Haga que el ancho del cuadro de búsqueda se reduzca para reducir la posibilidad de picos de ruido transitorios, potenciales de acción de disparo espontáneo u otros potenciales de acción de latencia constante cercanos que se identifiquen erróneamente como el potencial de acción de interés.
   3. Para comenzar a rastrear el potencial de acción objetivo, haga clic en el + debajo de la tabla de seguimiento de unidades múltiples. Se agregará una nueva fila a la tabla que contiene detalles del potencial de acción objetivo, incluida la ubicación de latencia, el porcentaje de disparo sobre 2-10 estímulos (ajustado en el menú de opciones) y la amplitud máxima detectada.
   4. Una vez que se agrega un potencial de acción a la tabla de seguimiento de unidades múltiples, el algoritmo de seguimiento de latencia (Figura 5) se ejecutará automáticamente en él en cada estimulación eléctrica posterior.
   5. Si hay varios potenciales de acción discretos visibles en la gráfica ráster temporal, agréguelos a la tabla de seguimiento de varias unidades como se describió anteriormente. El número máximo teórico de potenciales de acción que se pueden agregar a la tabla para el seguimiento simultáneo de latencia es el valor entero máximo de 32 bits.
   6. Marque la casilla Track Spike en la tabla de seguimiento de varias unidades para mover el cuadro de búsqueda a la posición adecuada para ese potencial de acción en particular, según lo determinado por el algoritmo de seguimiento de latencia. Esto permitirá monitorear el seguimiento de latencia en tiempo real y garantizar que el seguimiento siga el potencial de acción como se esperaba. El seguimiento de latencia de otros picos continuará normalmente en segundo plano.
   7. Elimine los potenciales de acción rastreados de la tabla de seguimiento de varias unidades utilizando el botón de eliminación al final de cada fila.
2. Realice un seguimiento del umbral eléctrico como se describe a continuación.
   1. Ajuste las tasas de incremento y disminución en el panel de control de estimulación entre 0.1 V y 0.5 V. Mantenga estos valores iguales y no los ajuste durante el experimento a menos que esto sea parte del paradigma experimental.
   2. Asegúrese de que la frecuencia de estimulación se establezca en una velocidad adecuada, típicamente 0.25-0.5 Hz, a menos que la modulación de la frecuencia de estimulación sea parte del paradigma experimental. El aumento de las tasas de disparo del nociceptor puede alterar el umbral eléctrico del nociceptor.
   3. Una vez que se esté rastreando correctamente un potencial de acción, marque la casilla Track Threshold en la tabla de seguimiento de varias unidades, que iniciará el algoritmo de seguimiento de umbral eléctrico (Figura 6).
      NOTA: El seguimiento del umbral eléctrico solo se ejecuta en el potencial de acción objetivo; De hecho, las tasas de disparo de otros potenciales de acción en la tabla de seguimiento de unidades múltiples se actualizarán en consecuencia a medida que cambie la amplitud de la estimulación.
   4. Ajustar la amplitud de estimulación manualmente a la estimación del umbral eléctrico; Esto reducirá el tiempo de espera para determinar el umbral eléctrico. El tiempo necesario para establecer un umbral eléctrico fiable depende de la frecuencia de estimulación, las tasas de incremento y decremento, y la diferencia en la amplitud de estimulación desde la estimulación inicial hasta el umbral eléctrico de la neurona.
   5. El software utiliza un método arriba-abajo para la estimación del umbral eléctrico de las neuronas. En la tabla de seguimiento de unidades múltiples, la velocidad de disparo se determina en 2-10 estimulaciones previas (seleccionadas en el menú de opciones). Seleccionar el número de eventos de estimulación a considerar; Un número mayor aumentará la fiabilidad de la estimación del umbral, pero tardará más en alcanzarse.
   6. Durante la microneurografía humana, es importante controlar el dolor de los estímulos eléctricos para evitar molestias excesivas de los participantes; algunas molestias son inevitables durante el estudio de los nociceptores, particularmente de las fibras C silenciosas / dormidas. Solicite regularmente calificaciones de dolor mientras la amplitud de estimulación aumenta durante el seguimiento del umbral eléctrico y permanezca cerca del estimulador de corriente constante para desconectarlo a petición del participante.
      NOTA: Alternativamente, la estimulación eléctrica se puede desconectar a través de la interfaz de usuario haciendo clic en el botón [ ] en el panel de control de estimulación.
   7. Una velocidad de disparo del 50% indica que se ha determinado el umbral eléctrico aproximado.
   8. Durante el seguimiento del umbral eléctrico, aplique una manipulación experimental al campo receptivo, como la temperatura o las manipulaciones de medicamentos. Se rastrearán los efectos de estas manipulaciones en el umbral eléctrico del nociceptor.
      NOTA: Deje tiempo suficiente para identificar un nuevo umbral de nociceptores después de la manipulación experimental.

Un ejemplo representativo del software que trabaja para controlar un experimento se muestra en la Figura 7. Ajusta iterativamente la amplitud de estimulación utilizando un método arriba-abajo para encontrar efectivamente el umbral eléctrico de los nociceptores individuales. Por primera vez, demostramos la viabilidad del seguimiento del umbral eléctrico de una sola neurona en tiempo real en humanos durante la microneurografía (Figura 7A). Además, mostramos el seguimiento del umbral eléctrico en una fibra Aδ de ratón (Figura 7B). La identificación de potenciales de acción mediante el cruce de umbrales, como se usa aquí, es suficiente para rastrear umbrales eléctricos a lo largo del tiempo. Recomendamos a los usuarios que tomen medidas para minimizar el ruido eléctrico durante sus grabaciones, como el uso de una jaula de Faraday y filtros de paso de banda para mejorar la relación señal-ruido.

Para demostrar que el seguimiento del umbral eléctrico se puede utilizar como una medida de los cambios en la excitabilidad de los nociceptores en humanos, se realizó el seguimiento del umbral eléctrico durante un paradigma de calentamiento escalonado (Figura 8). El aumento de la temperatura de los terminales del nociceptor disminuyó la corriente de estimulación eléctrica requerida para provocar un potencial de acción, lo que refleja un aumento en la excitabilidad del nociceptor (Figura 8C). Esto probablemente fue causado por la generación de potenciales receptores por los canales iónicos sensibles al calor expresados en el nociceptor de fibra C14. En el paso de temperatura más alto, 44 °C, se obtuvieron potenciales de acción evocados térmicamente (Figura 8A, número de estímulo 86-96). Esto provoca un aumento en el umbral eléctrico ya que el nociceptor puede estar en un estado refractario después de una descarga de alta frecuencia. Como era de esperar, la latencia del potencial de acción rastreado disminuyó a medida que aumentaba la temperatura. Se cree que esto ocurre debido a un efecto termodinámico en la maquinaria de conducción, que aumenta la velocidad de conducción de la fibra C. Esta fibra C también puede estar exhibiendo flip-flop (Figura 8B, número de estímulo 47-54), lo que puede resultar en que la siguiente estimulación eléctrica aumente erróneamente en amplitud si el potencial de acción cae fuera de la ventana de búsqueda del algoritmo.

Figura 1: Un esquema de la configuración del equipo y las conexiones de cable requeridas para el seguimiento del umbral eléctrico del nociceptor con APTrack en roedores y humanos. Tenga en cuenta los dos métodos diferentes de controles de amplitud de estimulación: un motor paso a paso para estimuladores ajustados manualmente en nuestra configuración humana, y un PulsePal para estimuladores controlados por voltaje de entrada en nuestra configuración de roedores. (1) Un PC (Windows, Mac o Linux) que ejecute el complemento para la plataforma Open Ephys. (2) Un motor paso a paso que opera el dial de amplitud de estimulación en el DS7. (3) Un estimulador de corriente constante aprobado para su uso en humanos; aquí usamos un DS7. (4) Un optoiaislador USB 3.0, que aísla al participante humano de la PC (opcional, solo se requiere para la investigación humana). (5) Un generador de pulsos PulsePal V2, que genera marcas de tiempo TTL (canal de salida 2) y pasos de voltaje correspondientes a la amplitud de estimulación solicitada (canal de salida 1). (6) Un estimulador de corriente constante para uso en animales; aquí, usamos un DS4. (7) Una fuente de alimentación de CC para el sistema (fuente de alimentación de CC de red utilizada para la configuración de roedores y fuente de alimentación de CC de batería utilizada para la configuración humana). (8) Una junta de adquisiciones. (9) Una placa de E/S para conectar los cables coaxiales BNC que transportan las señales a grabar, como las salidas de termopar y los marcadores TTL. (10) La preparación piel-nervio del ratón sometida a registros electrofisiológicos de nociceptores. (11) Un participante humano sometido a un registro de microneurografía de fibras C en el nervio peroneo superficial. (12) Un cabecera Intan RHD2216 para la adquisición y digitalización de las grabaciones. (13) Una placa adaptadora de electrodos Intan, a la que están conectados los electrodos de grabación y que permite que la señal pase al cabezal RHD2216. (14) Un sistema de estimulación térmica que puede emitir la temperatura a través de una conexión coaxial BNC. (15) Un botón / pedal alimentado por batería de 3.3 V que se utiliza para marcar los eventos de estimulación mecánica y las aplicaciones de medicamentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cadena de señal de plantilla. La flecha roja apunta al botón para habilitar la entrada ADC desde la placa de E/S. La flecha amarilla indica el menú desplegable para seleccionar el formato de archivo Open Ephys. La flecha verde indica los botones Reproducir y Grabar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Interfaz gráfica de usuario. La GUI consta de cuatro componentes principales. (1) Panel Diagrama de trama temporal (verde) para la visualización de datos y los ajustes asociados con el control de la gráfica. Una respuesta de latencia constante que muestra una desaceleración gradual dependiente de la actividad se indica con la flecha verde. (2) Panel de control de estimulación (amarillo) para establecer los parámetros de amplitud de estimulación y cargar los scripts del paradigma de estimulación. (3) Tabla de seguimiento de unidades múltiples (azul) para agregar los potenciales de acción para rastrear y activar la latencia y el seguimiento del umbral eléctrico. (4) Menú de opciones para seleccionar los estilos de color y el canal de entrada para los disparadores de datos y TTL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Facilitación de la identificación de potenciales de acción de latencia constante a través de la visualización de datos en tiempo real en un diagrama ráster temporal utilizando APTrack. Este es un ejemplo de alta relación señal-ruido. Los datos presentados en el diagrama ráster temporal provienen de un registro de fibra C humana del nervio peroneo superficial durante la microneurografía. Voltage Trace es el complemento LFP Viewer similar a un osciloscopio dentro de Open Ephys. La interfaz de usuario de APTrack es la interfaz gráfica de usuario del plugin. El potencial de acción rastreado se indica mediante flechas verdes, y el control deslizante circular en el borde del gráfico ráster temporal es para controlar la posición del cuadro de búsqueda donde los algoritmos buscarán eventos de cruce de umbral. El artefacto de estimulación eléctrica está marcado en azul en la traza de voltaje. La amplitud de estimulación del comando de voltaje analógico se indica en rojo; Tenga en cuenta que esto puede no ser lo mismo que la amplitud de la corriente de estimulación dependiendo del factor de escala establecido en el estimulador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Representación gráfica del algoritmo de seguimiento de latencia. En términos simples, si se detecta un potencial de acción al cruzar el umbral, el cuadro de búsqueda ajustará su posición para centrarse en el momento del voltaje máximo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Representación gráfica del algoritmo de seguimiento del umbral eléctrico. En términos simples, si se detecta un potencial de acción al cruzar el umbral, la amplitud de estimulación disminuirá por la tasa de decremento. Si no se detecta ningún potencial de acción, la amplitud de la estimulación aumentará en la tasa de incremento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Seguimiento automatizado del umbral eléctrico de potenciales de acción de una sola neurona a una frecuencia de estimulación de 0,25 Hz . (A) Trazas secuenciales de una fibra C humana del nervio peroneo superficial durante un experimento de microneurografía. (B) Trazas secuenciales de una fibra Aδ de ratón del nervio safeno durante la preparación del nervio de la piel electrofisiología de la fibra provocada. Las trazas se colorearon de rojo cuando se identificó un potencial de acción, lo que resultó en una disminución en la amplitud del estímulo. El algoritmo de software encuentra efectivamente la amplitud de estímulo requerida para una probabilidad del 50% de disparo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Seguimiento del umbral eléctrico a una frecuencia de estimulación de 0,25 Hz durante la estimulación térmica de un nociceptor de fibra C humano. El eje y codifica el número de estimulación desde el inicio del paradigma. (A) Traza de voltaje durante 4.000 ms después de la estimulación eléctrica, con eventos de cruce de umbral marcados en rojo. (B) Traza de voltaje de A ampliada alrededor del potencial de acción rastreado. Los rastros fueron de color rojo cuando se detectó el potencial de acción rastreado. La línea azul vertical es la latencia de línea base de la unidad rastreada. (C) Corriente de estimulación comandada por APTrack. La línea azul vertical es el umbral eléctrico de referencia. (D) Temperatura de la sonda de estimulación térmica TCS-II del campo receptivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Contenido del líquido intersticial sintético para la preparación piel-nervio del ratón23.

G.W.T.N. es una beca de doctorado de BBSRC Collaborative Training Partnership con la Universidad de Bristol y Eli Lilly and Company (BB / T508342 / 1). A.P.N. es un empleado actual de Eli Lilly and Company y puede poseer acciones en esta compañía.