Desde la aparición de los detectores directos de electrones y la mejora del software y el hardware, la criomicroscopía electrónica (crio-EM) se ha convertido en una técnica que permite a los investigadores determinar rutinariamente la estructura de las macromoléculas con detalles casi atómicos 1,2. Esta aceleración ha sido catalizada por una serie extremadamente rápida de nuevos desarrollos, desde la preparación de muestras hasta la recopilación y el procesamiento de datos. Para permitir una amplia democratización de esta técnica para los no expertos, se han creado tuberías más eficientes y accesibles. Sorprendentemente, menos de 10 años después de la "revolución de la resolución", la crio-EM se ha convertido en una técnica esencial para la caracterización de proteínas, tanto en el mundo académico como en la industria 3,4.
Uno de los aspectos más notables de la comunidad de investigación crio-EM ha sido la voluntad de compartir abiertamente protocolos, estrategias y software5. Esta apertura de la tecnología y los conocimientos especializados contribuyó significativamente al ritmo muy rápido del desarrollo, pero algunos cuellos de botella siguen impidiendo que sea plenamente accesible. En esta recopilación de métodos, nuestro objetivo es describir algunos de los desarrollos recientes en la preparación de cuadrículas adecuadas para el análisis estructural mediante crio-EM, que es, junto con el acceso al hardware de análisis de datos, el principal cuello de botella para muchos proyectos. También discutimos nuevos protocolos que se están desarrollando actualmente en este campo, para nuevos enfoques en análisis crio-EM.
Como se indicó anteriormente, uno de los cuellos de botella actuales para la aplicación rutinaria de crio-EM en el laboratorio es la preparación de muestras. Se pueden encontrar varios problemas a nivel de aplicación de muestras a las cuadrículas: más comúnmente, la orientación preferida de la muestra en hielo y su desnaturalización en la interfaz aire-agua. Proteger la muestra de la interfaz aire-agua es una solución a este problema, mediante el uso de películas de soporte de carbono o grafeno que evitan físicamente que la muestra esté en contacto con el aire. Para facilitar la aplicación de películas delgadas sobre rejillas, de Martin Garrido et al.6 han desarrollado un bloque de flotación de soporte producido por una impresora 3D que permite aplicar pequeñas gotas de agua y muestra de forma controlada. Con este bloque, las capas de grafeno y carbono se depositan de una manera económica y fácil de usar.
Otra forma de prevenir el daño en la interfaz aire-agua es limitar el tiempo que la proteína está expuesta a la atmósfera. Para ello, dos instrumentos diferentes, desarrollados por Klebs et al.7 y Budell et al.8, utilizan enfoques novedosos para la preparación rápida (tan baja como 10 ms) de la cuadrícula, lo que reduce la probabilidad de problemas con la orientación de las partículas. Otra ventaja de estos dispositivos es la posibilidad de realizar experimentos resueltos en el tiempo, una nueva y emocionante frontera para los estudios estructurales.
En un enfoque contrastante, Nguyen et al.9 informan de un método para congelar rejillas para el análisis crio-EM en ausencia de dispositivos comerciales o a medida, que son muy costosos o difíciles de construir. Muestran cómo se pueden obtener rejillas de calidad similar utilizando un dispositivo casero barato que no requiere ninguna instrumentación costosa, lo que contribuye a la democratización de la crio-EM.
En crio-EM, la muestra de interés no siempre es una proteína, sino que puede ser una molécula pequeña o un sistema biológico grande, como una célula completa. La preparación de tales muestras es única y requiere pasos específicos, así como diferentes estrategias en la recopilación de datos.
Para la difracción de electrones de microcristales (MicroED), la muestra a estudiar es una pequeña sustancia química que generalmente se encuentra en forma de polvo. El polvo se aplica directamente a la rejilla EM para mantener una forma cristalina. La recolección de datos se realiza en modo de difracción, como lo muestran Martynowycz y Gonen10. Por el contrario, las células enteras son demasiado gruesas para el análisis crio-EM. Para abordar esto, Bisson et al. reportan un método para usar un SEM para perforar físicamente dicha muestra, con el fin de obtener secciones delgadas adecuadas para estudios estructurales11.
Desde la muestra hasta la estructura, es importante mantener un registro de cada paso del proceso, ya que se cambian muchos parámetros para cada muestra de proteína, desde la concentración de proteínas hasta la configuración del microscopio y el análisis de datos. Con este fin, Wypych et al.12 han desarrollado una herramienta de gestión de la información basada en la web que permite a los usuarios organizar su flujo de trabajo y realizar un seguimiento de todos los detalles necesarios para futuras publicaciones. Esto es particularmente crítico ya que la automatización se está volviendo cada vez más frecuente en la crio-EM, particularmente en los entornos de la industria.
Cryo-EM ha avanzado a un ritmo sobresaliente en la última década, tanto en el frente de hardware como en el de software. Para garantizar la difusión generalizada de las mejores prácticas y la amplia adopción de nuevos métodos, es necesario un conjunto transparente de protocolos. Este número especial contribuirá a este esfuerzo.