Análisis de aislamiento y transcriptoma de tipos de células vegetales

Resumen

La viabilidad y efectividad de los métodos scRNA-seq de alto rendimiento anuncian una era unicelular en la investigación de plantas. Aquí se presenta un procedimiento robusto y completo para aislar tipos específicos de células de raíz de Arabidopsis thaliana y la posterior construcción y análisis de la biblioteca del transcriptoma.

Resumen

En los organismos multicelulares, la programación del desarrollo y las respuestas ambientales pueden ser altamente divergentes en diferentes tipos de células o incluso dentro de las células, lo que se conoce como heterogeneidad celular. En los últimos años, el aislamiento de células individuales y de tipo celular combinado con técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS) se han convertido en herramientas importantes para estudiar procesos biológicos a resolución de una sola célula. Sin embargo, aislar las células vegetales es relativamente más difícil debido a la presencia de paredes celulares vegetales, lo que limita la aplicación de enfoques unicelulares en las plantas. Este protocolo describe un procedimiento robusto para el aislamiento de células individuales y de tipo celular activado por fluorescencia (FACS) con células vegetales, que es adecuado para el análisis multiómico posterior y otros estudios. Usando líneas marcadoras fluorescentes de la raíz de Arabidopsis , demostramos cómo se aíslan tipos particulares de células, como las células periciclo del xilema-polo, las células iniciales de la raíz lateral, las células de la tapa de la raíz lateral, las células de la corteza y las células endodérmicas. Además, también se proporciona un método efectivo de análisis de transcriptoma aguas abajo utilizando Smart-seq2. El método de aislamiento celular y las técnicas de análisis del transcriptoma se pueden adaptar a otros tipos de células y especies de plantas y tienen un amplio potencial de aplicación en la ciencia de las plantas.

Introducción

Las células son la unidad fundamental de todos los organismos vivos y realizan funciones estructurales y fisiológicas. Aunque las células en organismos multicelulares muestran una aparente sincronicidad, las células de diferentes tipos y células individuales presentan diferencias en sus transcriptomas durante el desarrollo y las respuestas ambientales. La secuenciación de ARN unicelular de alto rendimiento (scRNA-seq) proporciona una potencia sin precedentes para comprender la heterogeneidad celular. La aplicación de scRNA-seq en ciencias de las plantas ha contribuido a construir con éxito un atlas celular^{vegetal 1}, se ha utilizado para identificar taxones celulares raros en tejidos vegetales², ha proporcionado información sobre la composición de los tipos de células en los tejidos vegetales y se ha utilizado para identificar la identidad celular y las funciones importantes empleadas durante el desarrollo y la diferenciación de las plantas. Además, es posible inferir trayectorias de desarrollo espaciotemporal en tejidos vegetales ^1,2,3 para descubrir nuevos genes marcadores⁴ y estudiar las funciones de importantes factores de transcripción⁵ utilizando scRNA-seq con el fin de revelar la conservación evolutiva del mismo tipo celular en diferentes plantas³. El estrés abiótico se encuentra entre las influencias ambientales más importantes en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Al explorar los cambios en la composición de los tipos de células en los tejidos vegetales bajo diferentes condiciones de tratamiento a través de la secuenciación del transcriptoma unicelular, también se puede resolver el mecanismo de respuesta al estrés abiótico⁶.

El potencial para resolver la heterogeneidad transcripcional entre los tipos de células mediante la secuenciación de scRNA depende del método de aislamiento celular y la plataforma de secuenciación. La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) es una técnica ampliamente utilizada para aislar una subpoblación de células para scRNA-seq basada en la dispersión de la luz y las propiedades de fluorescencia de las células. El desarrollo de líneas marcadoras fluorescentes mediante tecnología transgénica ha mejorado considerablemente la eficiencia del aislamiento celular mediante el sistema de control de los datos sobre el terreno⁷. La realización de scRNA-seq utilizando Smart-seq2⁸ mejora aún más la capacidad de diseccionar la heterogeneidad celular. El método Smart-seq2 tiene buena sensibilidad para la detección de genes y puede detectar genes incluso con una entrada de transcripción baja⁹. Además de la recolección masiva de tipos de células, los clasificadores de células modernos proporcionan un formato de clasificación de índice de una sola célula, lo que permite el análisis del transcriptoma a una resolución de una sola célula utilizando Smart-seq2¹⁰ u otros métodos multiplexados de RNA-seq, como CEL-seq2¹¹. La clasificación de una sola célula o de tipo celular puede utilizarse potencialmente para muchas otras aplicaciones posteriores, como los estudios multiómicos paralelos^12,13. Aquí se presenta un protocolo robusto y versátil para aislar tipos de células vegetales, como células periciclo xilema-polo, células de la tapa lateral de la raíz, células iniciales de la raíz lateral, células de la corteza y células endodérmicas de las raíces de las líneas celulares marcadoras de Arabidopsis thaliana por FACS. El protocolo implica además la construcción de la biblioteca Smart-seq2 para el análisis del transcriptoma aguas abajo.

Protocolo

El siguiente protocolo se ha optimizado para semillas de tipo salvaje (WT) de A. thaliana sin fluorescencia y líneas marcadoras fluorescentes para los siguientes tipos de células radiculares: células periciclo xilema-polo (J0121), células iniciales de raíz lateral, células de la tapa lateral de la raíz (J3411), endodermis y células de la corteza (J0571) (Figura 1A). Todas las líneas marcadoras se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales), excepto la línea de marcador celular de iniciación de la raíz lateral, que se generó mediante la introducción de una construcción GFP impulsada por el promotor GATA23 en una planta de Arabidopsis de tipo silvestre siguiendo un informe previamente publicado¹⁴.

1. Preparación del material vegetal

1. Esterilice las semillas WT de A. thaliana y las semillas de línea marcador fluorescente incubando las semillas en lejía al 20% en una incubadora giratoria a temperatura ambiente durante 15 min.
2. Enjuague las semillas en agua de doble destilación (_ddH2O) de tres a cinco veces. Realice este paso en un banco limpio estéril.
3. Platea las semillas de la línea WT y reporter en medio Murashige y Skoog (MS) de media fuerza con 0.8% de agar (w / v) ¹⁵. Cultivar las plantas verticalmente durante 5 días (16 h de luz a 23 °C) después de estratificar durante 2 días a 4 °C.

2. Protoplasting

1. Preparar las soluciones de protoplasting^2,5, denominadas Solución A y Solución B (ver Tabla de materiales).
   1. Prepare la solución A que contenga 400 mM de manitol, 0,05% de BSA, 20 mM de MES (pH 5,7), 10 mM de CaCl₂ y 20 mM de KCl (consulte la Tabla de materiales). Guarde la solución A a -20 °C durante un máximo de 1 mes.
   2. Prepare la solución B añadiendo 1% (p/v) de celulasa R10, 1% (p/v) de celulasa RS, 1% (p/v) de hemicelulasa, 0,5% (p/v) de pectolyasa y 1% (p/v) de macerozima R10 en una nueva alícuota de la solución A. Conservar la solución B a -20 °C durante un máximo de 1 mes.
2. Descongele suavemente la solución A y la solución B en hielo antes de comenzar el experimento.
3. Corte las raíces con una cuchilla limpia o tijeras, y corte las raíces en trozos de ~0.5 cm. Sumergir las raíces en 1,5 ml de solución B seguido de una rotación suave (a aproximadamente 18 rpm) a temperatura ambiente durante 1,5-2 h.
4. Filtre los protoplastos de la raíz a través de la malla del filtro de 40 μm (consulte la Tabla de materiales).
5. Enjuague la malla del colador con 1-2 ml de solución A.
6. Combinar los líquidos de los pasos 2.4 y 2.5, y centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante con una pipeta, resuspenda el pellet celular en 500-600 μL de solución A y luego colóquelo en hielo inmediatamente.
7. Transfiera la solución celular resuspendida a un nuevo tubo de ensayo de 5 ml para la clasificación celular.

3. Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)

1. Encienda y finalice los pasos de configuración del instrumento en el clasificador (consulte Tabla de materiales). Seleccione los canales de fluorescencia, use una planta WT (sin fluorescencia) como control para determinar la línea de base para la autofluorescencia y ajuste la puerta de clasificación en función de la intensidad de fluorescencia y los singletes FSC / SSC (Figura 2).
2. Añadir 500 μL de solución A (paso 2.1.1) en un tubo colector de 1,5 ml para evitar que las células se dañen. Recolectar 2,000-3,000 células por tubo.
3. Después de la clasificación, colocar inmediatamente las muestras en hielo, centrifugar el tubo de recolección que contiene las células a 300 x g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante con una pipeta.
4. Tome 2 μL de células clasificadas y verifique la fluorescencia con un microscopio de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales).
5. Almacene las celdas ordenadas a -80 °C o utilícelas inmediatamente para la construcción de bibliotecas (paso 4).
6. Para la clasificación de índices de una sola celda, coloque la placa de 96 pocillos en el adaptador. Calibre la posición de la placa para que la gota caiga en el orificio central de la placa. Seleccione el modo de ordenación de una sola celda al ordenar, introduzca el número objetivo de celdas ordenadas como 1 y comience a ordenar.

4. Preparación de la biblioteca Smart-seq2

1. Como resultado de la cantidad ultra baja de entrada, realice la construcción de una biblioteca RNA-seq de tipo unicelular en un ambiente libre de contaminación. Antes de comenzar el experimento, limpie el banco con un descontaminante superficial⁸ (consulte la Tabla de materiales) y etanol al 75%.
2. Preparar tampón de lisis (mezcla A) (Tabla 1) combinando 0,33 μL de Tritón X-100 al 10%, 0,55 μL de inhibidor de la RNasa y 0,22 μL de DTT 0,1 M (ver Tabla de materiales).
3. Añadir 1 μL de mezcla A en la muestra clasificada y moler con un mortero estéril. El volumen de muestra preferible es ≤0,5 μL; use agua libre de RNasa para completar el volumen a 14 μL. Transfiera cada muestra de una sola célula a un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml.
4. Preparar la mezcla B que contenga 0,44 μL de cebador de reacción de transcripción inversa (RT) oligo-dT₃₀VN (100 μM) y 4,4 μL de dNTPs (10 mM) (Tabla 2) (ver Tabla de materiales).
5. Añadir 4,4 μL de mezcla B a los 14 μL de muestra en cada tubo, pipetear suavemente para mezclar la muestra e incubar la muestra a 72 °C durante 3 min. Después de la incubación, ponga inmediatamente las muestras en hielo para hibridar el oligo-dT a la cola poli A.
6. Prepare la mezcla de reacción de transcripción inversa (mezcla C) (Tabla 3) (ver Tabla de materiales). Añadir 21,6 μL de mezcla C a cada tubo que contenga las muestras. Activar el programa RT en un instrumento de PCR común (Tabla 4).
7. Realizar la reacción de preamplificación sobre hielo. Preparar la mezcla D combinando 44 μL de 2x mezcla de PCR polimerasa y 0,88 μL de cebador IS PCR (10 μM) (Tabla 5) (ver Tabla de materiales). Agregue 40.8 μL de mezcla D a los 40 μL de producto de reacción RT y ejecute el programa de preamplificación (Tabla 6).
8. Purificar los productos de reacción de preamplificación utilizando perlas Ampure XP (ver Tabla de materiales). Añadir 48 μL de perlas (proporción 0,6:1) en cada muestra del paso 4.7 y mezclar suavemente las muestras mediante pipeteo.
9. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 min. Coloque los tubos de 1,5 ml que contienen las muestras en un soporte de separación magnética durante 5 minutos. Deseche cuidadosamente el sobrenadante de las muestras sin alterar las cuentas.
10. Lave las perlas resuspendiéndolas en 200 μL de etanol al 80% y coloque las muestras en el soporte de separación magnética (consulte la Tabla de materiales) durante otros 3 minutos antes de desechar el sobrenadante que contiene etanol.
11. Seque al aire las muestras durante 10 minutos y cubra el tubo para evitar la contaminación y la contaminación cruzada durante el secado al aire.
12. Vuelva a suspender las perlas en 20 μL de_ddH2O, incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 min y, a continuación, colóquelas en el soporte de separación magnética durante 5 min.
13. Pipetear 18 μL del sobrenadante de cada tubo y transferir las muestras a nuevos tubos centrífugos de 1,5 ml. Utilice 1 μL de la muestra para evaluar la calidad del ADNc utilizando un kit de cuantificación de ADN, determine la distribución de tamaño de cada prebiblioteca utilizando un analizador de fragmentos (consulte la Tabla de materiales) y almacene la muestra restante a -20 °C.
14. Construya una biblioteca de ADNc⁸ para la secuenciación 16 de Illumina a partir del producto de prebiblioteca del paso^4.13 utilizando un kit de preparación de biblioteca de secuenciación (consulte Tabla de materiales).
15. Purificar las bibliotecas (del paso 4.14) utilizando las cuentas de Ampure XP, cuantificar las bibliotecas purificadas y determinar la distribución de tamaño de cada biblioteca siguiendo el paso 4.13.
    NOTA: Agrupe nanomoles iguales de cada biblioteca, asegurándose de que ninguno de ellos tenga la misma combinación del índice Illumina. De lo contrario, las bibliotecas se pueden agrupar en una proporción basada en la salida de secuenciación deseada y secuenciar juntas en el mismo carril del secuenciador Illumina. En general, la secuenciación de cada biblioteca a una profundidad de 4-6 GB, lo que produce >10 millones de lecturas mapeadas, proporciona una cobertura de 20x-30x del genoma de Arabidopsis . Las profundidades de secuenciación más bajas también son aceptables, pero podrían afectar la importancia del análisis de expresión diferencial.

5. Análisis de datos RNA-seq

1. Recorte las lecturas sin procesar usando Trim-Galore¹⁷ seguido de mapeo al genoma de referencia usando hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2), y elimine los fragmentos duplicados de PCR usando Picard¹⁹ (broadinstitute.github.io/picard).
2. Realizar el procesamiento del recuento bruto y posterior análisis de los genes expresados diferencialmente (DEG) con DESeq2²⁰ utilizando al menos tres réplicas biológicas para cada muestra. Realice la agrupación de la expresión génica con el paquete Pheatmap y visualice en un mapa de calor de expresión.
   NOTA: Los valores RPKM (lecturas por kilobase por millón de lecturas mapeadas) de los genes y los TEs (elementos transponibles) se calcularon con Stringtie¹⁸ (github.com/gpertea/stringtie) y se visualizaron en un navegador de genoma.

Resultados

Aislamiento de protoplastos
Este protocolo es efectivo para la clasificación de protoplastos de líneas marcadoras de raíces fluorescentes de A. thaliana. Estas líneas marcadoras se han desarrollado mediante la fusión de proteínas fluorescentes con genes expresados específicamente en tipos de células diana, o mediante el uso de líneas de trampa potenciadoras (Figura 1). Numerosos tejidos y órganos se han diseccionado en tipos de células que expresan marcadores flu...

Discusión

El protocolo basado en Smart-seq2 puede generar bibliotecas de secuenciación fiables a partir de varios cientos de celdas⁸. La calidad del material de partida es esencial para la precisión del análisis del transcriptoma. FACS es una herramienta poderosa para preparar células de interés, pero este procedimiento, especialmente el paso de protoplasting , debe optimizarse para aplicaciones de plantas. La microdisección de captura láser (LCM) o las células diseccionadas manualmente también se pueden us...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 y micro; m colador	Sorfa	622110
Agar	Yeasen	70101ES76
Analizador de fragmentos Agilent	Aglient Aglient	5200
Agilent kit de ADN de alta sensibilidad	Aglient	DNF-474-0500
Perlas Ampure XP	BECKMAN	A63881
Betaína	yuanye	S18046-100g
Bleach	Mr Muscle	FnBn83BK	20% (v/v) lejía
BSA	sigma	9048-46-8
CaCl2	yuanye	S24109-500g
Celulase R10	Yakult (Japón)	9012-54-8
Celulase RS	Yakult (Japón)	9012-54-8
Tubo de centrífuga (1,5 mL)	Eppendolf	30121589
Descontaminantes de superficie de DNasa, RNasa, ADN y ARN	Beyotime	R0127
dNTPs (10 mM)	NEB	N0447S
DTT (0.1 M)	invitrogen	18090050
etanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092680
FACS	BD FACS Melody	BD-65745
FACS	Sony	SH800S
Consejo de filtro  (1000 y micro; L)	Thermo Scientific	TF112-1000-Q
Punta de filtro  (200 y micro; L)	Thermo Scientific	TF140-200-Q
Punta de filtro (10 y micro; L)	Thermo Scientific	TF104-10-Q
Punta de filtro (100 y micro; L)	Thermo Scientific	TF113-100-Q
Nikon		Eclipse Ni-E
Mezclador giratorio cuatridimensional	Kylin -Bell	BE-1100
Hemicelulasa	sigma	9025-56-3
IS PCR primer			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3'KAPA
HiFi HotStart ReadyMix ( 2X)	Roche
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	7447-40-7
Macerozyme R10	Yakult (Japón)	9032-75-1
Soporte de separación magnética	invitrogen	12321D
Manitol	aladdin	69-65-8
MES	aladdin	145224948
MgCl2	yuanye	R21455-500ml
Microcentrífugas	Centrífuga Eppendorf	5425
Micro-mini-centrífuga	Titan	Timi-10k
MS	Phytotech	M519
Nextera XT Kit de preparación de bibliotecas de ADN	illumina	FC-131-1024
oligo-dT30VN cebador			5'-AAGCAGTGTGTATCAACGCAGAG TACTTT>
Fluorímetro Qubit 2.0	invitrogen	Q32866
Inhibidor de RNasa	Thermo Scientific	EO0382
Invitrogen	de agua sin RNasa	10977023
solución A			400 mM manitol, 0,05 % BSA , 20 mM MES (pH5,7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Solución B			1 % (p/v)celulasa R10, 1 % (p/v) celulasa RS, 1 %  (p/v)hemicelulasa, 0,5 %  (c/v)pectolyasa y 1 %  (s/v) Macerozima R10 en una alícuota fresca de solución Un
mortero estéril	BIOTREAT	453463
Colador (40 µ m )	Sorfa	251100
Transcriptasa inversa SuperScript IV (200 U/µ L)	tampón invitrogen	18090050
SuperScript IV (5x)	invitrogen	18090050
Tubo de ensayo (5 mL)	BD Falcon	352052
Tubos de PCR de pared delgada con tapones (0,5 mL)	AXYGEN	PCR-05-C
Triton X-100	Sangon Biotech	A600198-0500
TSO			primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3'Vortex
	Titan	VM-T2