Análisis de aislamiento y transcriptoma de tipos de células vegetales

Resumen

La viabilidad y efectividad de los métodos scRNA-seq de alto rendimiento anuncian una era unicelular en la investigación de plantas. Aquí se presenta un procedimiento robusto y completo para aislar tipos específicos de células de raíz de Arabidopsis thaliana y la posterior construcción y análisis de la biblioteca del transcriptoma.

Resumen

En los organismos multicelulares, la programación del desarrollo y las respuestas ambientales pueden ser altamente divergentes en diferentes tipos de células o incluso dentro de las células, lo que se conoce como heterogeneidad celular. En los últimos años, el aislamiento de células individuales y de tipo celular combinado con técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS) se han convertido en herramientas importantes para estudiar procesos biológicos a resolución de una sola célula. Sin embargo, aislar las células vegetales es relativamente más difícil debido a la presencia de paredes celulares vegetales, lo que limita la aplicación de enfoques unicelulares en las plantas. Este protocolo describe un procedimiento robusto para el aislamiento de células individuales y de tipo celular activado por fluorescencia (FACS) con células vegetales, que es adecuado para el análisis multiómico posterior y otros estudios. Usando líneas marcadoras fluorescentes de la raíz de Arabidopsis , demostramos cómo se aíslan tipos particulares de células, como las células periciclo del xilema-polo, las células iniciales de la raíz lateral, las células de la tapa de la raíz lateral, las células de la corteza y las células endodérmicas. Además, también se proporciona un método efectivo de análisis de transcriptoma aguas abajo utilizando Smart-seq2. El método de aislamiento celular y las técnicas de análisis del transcriptoma se pueden adaptar a otros tipos de células y especies de plantas y tienen un amplio potencial de aplicación en la ciencia de las plantas.

Introducción

Las células son la unidad fundamental de todos los organismos vivos y realizan funciones estructurales y fisiológicas. Aunque las células en organismos multicelulares muestran una aparente sincronicidad, las células de diferentes tipos y células individuales presentan diferencias en sus transcriptomas durante el desarrollo y las respuestas ambientales. La secuenciación de ARN unicelular de alto rendimiento (scRNA-seq) proporciona una potencia sin precedentes para comprender la heterogeneidad celular. La aplicación de scRNA-seq en ciencias de las plantas ha contribuido a construir con éxito un atlas celular^{vegetal 1}, se ha utilizado para identif....

Protocolo

El siguiente protocolo se ha optimizado para semillas de tipo salvaje (WT) de A. thaliana sin fluorescencia y líneas marcadoras fluorescentes para los siguientes tipos de células radiculares: células periciclo xilema-polo (J0121), células iniciales de raíz lateral, células de la tapa lateral de la raíz (J3411), endodermis y células de la corteza (J0571) (Figura 1A). Todas las líneas marcadoras se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales), excepto la línea de marcador celular de iniciación de la raíz lateral, que se generó mediante la introducción de una construcción GFP impulsada por el promoto....

Resultados

Aislamiento de protoplastos
Este protocolo es efectivo para la clasificación de protoplastos de líneas marcadoras de raíces fluorescentes de A. thaliana. Estas líneas marcadoras se han desarrollado mediante la fusión de proteínas fluorescentes con genes expresados específicamente en tipos de células diana, o mediante el uso de líneas de trampa potenciadoras (Figura 1). Numerosos tejidos y órganos se han diseccionado en tipos de células que expresan marcadores flu.......

Discusión

El protocolo basado en Smart-seq2 puede generar bibliotecas de secuenciación fiables a partir de varios cientos de celdas⁸. La calidad del material de partida es esencial para la precisión del análisis del transcriptoma. FACS es una herramienta poderosa para preparar células de interés, pero este procedimiento, especialmente el paso de protoplasting , debe optimizarse para aplicaciones de plantas. La microdisección de captura láser (LCM) o las células diseccionadas manualmente también se pueden us.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 y micro; m colador	Sorfa	622110
Agar	Yeasen	70101ES76
Analizador de fragmentos Agilent	Aglient Aglient	5200
Agilent kit de ADN de alta sensibilidad	Aglient	DNF-474-0500
Perlas Ampure XP	BECKMAN	A63881
Betaína	yuanye	S18046-100g
Bleach	Mr Muscle	FnBn83BK	20% (v/v) lejía
BSA	sigma	9048-46-8
CaCl2	yuanye	S24109-500g
Celulase R10	Yakult (Japón)	9012-54-8
Celulase RS	Yakult (Japón)	9012-54-8
Tubo de centrífuga (1,5 mL)	Eppendolf	30121589
Descontaminantes de superficie de DNasa, RNasa, ADN y ARN	Beyotime	R0127
dNTPs (10 mM)	NEB	N0447S
DTT (0.1 M)	invitrogen	18090050
etanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092680
FACS	BD FACS Melody	BD-65745
FACS	Sony	SH800S
Consejo de filtro  (1000 y micro; L)	Thermo Scientific	TF112-1000-Q
Punta de filtro  (200 y micro; L)	Thermo Scientific	TF140-200-Q
Punta de filtro (10 y micro; L)	Thermo Scientific	TF104-10-Q
Punta de filtro (100 y micro; L)	Thermo Scientific	TF113-100-Q
Nikon		Eclipse Ni-E
Mezclador giratorio cuatridimensional	Kylin -Bell	BE-1100
Hemicelulasa	sigma	9025-56-3
IS PCR primer			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3'KAPA
HiFi HotStart ReadyMix ( 2X)	Roche
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	7447-40-7
Macerozyme R10	Yakult (Japón)	9032-75-1
Soporte de separación magnética	invitrogen	12321D
Manitol	aladdin	69-65-8
MES	aladdin	145224948
MgCl2	yuanye	R21455-500ml
Microcentrífugas	Centrífuga Eppendorf	5425
Micro-mini-centrífuga	Titan	Timi-10k
MS	Phytotech	M519
Nextera XT Kit de preparación de bibliotecas de ADN	illumina	FC-131-1024
oligo-dT30VN cebador			5'-AAGCAGTGTGTATCAACGCAGAG TACTTT>
Fluorímetro Qubit 2.0	invitrogen	Q32866
Inhibidor de RNasa	Thermo Scientific	EO0382
Invitrogen	de agua sin RNasa	10977023
solución A			400 mM manitol, 0,05 % BSA , 20 mM MES (pH5,7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Solución B			1 % (p/v)celulasa R10, 1 % (p/v) celulasa RS, 1 %  (p/v)hemicelulasa, 0,5 %  (c/v)pectolyasa y 1 %  (s/v) Macerozima R10 en una alícuota fresca de solución Un
mortero estéril	BIOTREAT	453463
Colador (40 µ m )	Sorfa	251100
Transcriptasa inversa SuperScript IV (200 U/µ L)	tampón invitrogen	18090050
SuperScript IV (5x)	invitrogen	18090050
Tubo de ensayo (5 mL)	BD Falcon	352052
Tubos de PCR de pared delgada con tapones (0,5 mL)	AXYGEN	PCR-05-C
Triton X-100	Sangon Biotech	A600198-0500
TSO			primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3'Vortex
	Titan	VM-T2