Cuantificación del estrés de replicación en células de cáncer de ovario mediante inmunofluorescencia de ADN monocatenario

Resumen

Aquí, describimos un método basado en inmunofluorescencia para cuantificar los niveles de ADN monocatenario en las células. Este método eficiente y reproducible se puede utilizar para examinar el estrés de replicación, una característica común en varios cánceres de ovario. Además, este ensayo es compatible con una tubería de análisis automatizada, lo que aumenta aún más su eficiencia.

Resumen

El estrés de replicación es un sello distintivo de varios cánceres de ovario. El estrés de replicación puede surgir de múltiples fuentes, incluidas las roturas de doble cadena, los conflictos de transcripción-replicación o los oncogenes amplificados, lo que inevitablemente resulta en la generación de ADN monocatenario (ssDNA). La cuantificación de ssDNA, por lo tanto, presenta una oportunidad para evaluar el nivel de estrés de replicación en diferentes tipos de células y bajo diversas condiciones o tratamientos que dañan el ADN. La evidencia emergente también sugiere que el ssDNA puede ser un predictor de las respuestas a los fármacos quimioterapéuticos que se dirigen a la reparación del ADN. Aquí, describimos una metodología detallada basada en inmunofluorescencia para cuantificar ssDNA. Esta metodología consiste en etiquetar el genoma con un análogo de la timidina, seguido de la detección basada en anticuerpos del análogo en la cromatina en condiciones no desnaturalizantes. Los tramos de ssDNA se pueden visualizar como focos bajo un microscopio de fluorescencia. El número y la intensidad de los focos se relacionan directamente con el nivel de ssDNA presente en el núcleo. También describimos una tubería automatizada para cuantificar la señal de ssDNA. El método es rápido y reproducible. Además, la simplicidad de esta metodología la hace susceptible a aplicaciones de alto rendimiento, como exámenes genéticos y de medicamentos.

Introducción

El ADN genómico está frecuentemente expuesto a múltiples agresiones de diversas fuentes endógenas y exógenas¹. La frecuencia de daño endógeno se correlaciona directamente con los niveles de subproductos metabólicos, como especies reactivas de oxígeno o aldehídos, que son intrínsecamente más altos en múltiples tipos de cáncer, incluidos los cánceres de ovario ^2,3. Es imperativo que el daño al ADN se resuelva de manera eficiente; de lo contrario, puede fomentar lesiones genotóxicas y, en consecuencia, mutagénesis. La capacidad de las células para reparar lesiones genotóxicas depende de la....

Protocolo

NOTA: La línea celular de cáncer de ovario, OVCAR3, se utilizó en estos pasos, pero este protocolo es ampliamente aplicable a muchas otras líneas celulares, incluidas las derivadas de fuentes no ováricas. En la figura 2 se muestra un esquema del protocolo.

1. Recubrimiento de las células

1. Haga cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina.
   1. Agregue cubreobjetos de 12 mm de diámetro esterilizados en autoclave a un tubo cónico de 50 ml con solución de poli-L-lisina y colóquelos en un balancín durante 15 minutos.
   2. Aspirar la solución en una campana de cultivo de tejidos. Lave ....

Resultados

En la Figura 4 se muestran imágenes representativas y la cuantificación de focos IdU de los núcleos derivados de las células no tratadas y células tratadas con hidroxiurea de 0,5 mM durante 24 h. Ambos núcleos están teñidos e identificables en el canal DAPI. El análisis de estas imágenes consiste en cuantificar el número de focos en cada núcleo. El número de focos es proporcional al grado de tensión de replicación.

Discusión

Como se mencionó en el protocolo, es valioso incluir algunos controles experimentales para garantizar que el ensayo esté funcionando. Estos incluyen una muestra no tratada con IdU, así como una muestra no tratada con anticuerpos primarios. Ambos controles negativos deben producir células teñidas por DAPI pero que no contienen señal de IdU.

Según las condiciones experimentales y las líneas celulares utilizadas, se pueden necesitar diferentes diluciones de anticuerpos para obtener la mejor señal.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3% de paraformaldehído (PFA)	Fisher Scientific NC0179595		10 g de sacarosa + 100 mL 10X PBS + agua para aumentar el volumen a 925 mL. Agregue 75 mL de PFA libre de metanol al 40%, mezcle y haga alícuotas de 50 mL antes del almacenamiento Almacenamiento: Almacenar en -20 ° C
5-yodo-2'-desoxiuridina (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354,10 g/mol. Para caldo de 10 mM: disolver 3.541 mg IdU en 1 mL 1 N de amoníaco líquido Almacenamiento: Almacenado en -20 ° C
Anticuerpo anti-BrdU	BD Biosciences	347580	Almacenamiento: Almacenar en 4 ° C
Anti-ratón Alexa Fluor Plus 488 anticuerpo secundario	Thermo Scientific	A32766	Sensible a la luz - mantener en la oscuridad Almacenamiento: Almacenar en 4 & grados; C
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Hecho agregando masa específica al volumen de PBS Almacenamiento: Almacenar en 4 & grados; C
Cubierta de vidrio circular	Ciencias de la Microscopía Electrónica	72230-01
NIS GA3 Software	Nikon
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Medios de crecimiento: RPMI suplementado con L-glutamina, 0,01 mg/mL de insulina bovina; suero fetal bovino a una concentración final del 20% y 1X Pen Strep Almacenamiento: Medios de congelación: medios de crecimiento + 5% DMSO y almacenados en -80 ° C
Solución de poli-L-lisina	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Almacenamiento: Almacenar en 4 ° C
ProLong Diamond Mountant Antidecoloración con DAPI	Thermo Scientific	P36962	Almacenamiento: Almacenar en 4 & grados; C
Tripsina-EDTA, 0.25%	Genesee Scientific	25-510	Almacenamiento: Almacenar en 4 & grados; C
Agua, filtrada estéril	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Almacenamiento: Almacenar en 4 & grados; C

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