Medición de tensiones tisulares locales en tendones a través de la correlación de imágenes digitales de código abierto

Resumen

Este documento describe un algoritmo de correlación de imágenes digitales de código abierto para medir las tensiones locales de tejido 2D dentro de los explantes de tendones. La precisión de la técnica ha sido validada utilizando múltiples técnicas, y está disponible para uso público.

Resumen

Existe un considerable interés científico en comprender las tensiones que experimentan las células tendinosas in situ y cómo estas cepas influyen en la remodelación de los tejidos. Sobre la base de este interés, se han desarrollado varias técnicas analíticas para medir las tensiones del tejido local dentro de los explantes tendinosos durante la carga. Sin embargo, en varios casos, la precisión y sensibilidad de estas técnicas no se han informado, y ninguno de los algoritmos está disponible públicamente. Esto ha dificultado la medición más generalizada de las tensiones tisulares locales en los explantes de tendones. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue crear una herramienta de análisis validada para medir las tensiones tisulares locales en los explantes tendinosos que esté fácilmente disponible y sea fácil de usar. Específicamente, se adaptó un algoritmo de correlación de imagen digital (ALDIC) de Lagrange aumentada disponible públicamente para medir las tensiones 2D mediante el seguimiento de los desplazamientos de los núcleos celulares dentro de los tendones de Aquiles del ratón bajo tensión uniaxial. Además, la precisión de las cepas calculadas se validó mediante el análisis de imágenes transformadas digitalmente, así como mediante la comparación de las deformaciones con los valores determinados a partir de una técnica independiente (es decir, líneas fotoblanqueadas). Finalmente, se incorporó una técnica al algoritmo para reconstruir la imagen de referencia utilizando el campo de desplazamiento calculado, que se puede utilizar para evaluar la precisión del algoritmo en ausencia de valores de deformación conocidos o una técnica de medición secundaria. El algoritmo es capaz de medir deformaciones de hasta 0,1 con una precisión de 0,00015. La técnica para comparar una imagen de referencia reconstruida con la imagen de referencia real identificó con éxito muestras que tenían datos erróneos e indicó que, en muestras con buenos datos, aproximadamente el 85% del campo de desplazamiento era preciso. Finalmente, las tensiones medidas en tendones de Aquiles de ratón fueron consistentes con la literatura previa. Por lo tanto, este algoritmo es una herramienta muy útil y adaptable para medir con precisión las tensiones tisulares locales en los tendones.

Introducción

Los tendones son tejidos mecanosensibles que se adaptan y degeneran en respuesta a la carga mecánica 1,2,3,4. Debido al papel que desempeñan los estímulos mecánicos en la biología de las células del tendón, existe un gran interés en comprender las tensiones que experimentan las células del tendón en el entorno del tejido nativo durante la carga. Se han desarrollado varias técnicas experimentales y analíticas para medir las tensiones tisulares locales en los tendones. Estos incluyen análisis de correlación de imágenes digitales (DIC) 2D / 3D de deformaciones superficiales utilizando patrones de moteado o líneas fotoblanqueadas (PBL)5,6,7,8, medición de los cambios en la distancia centroide a centroide de núcleos individuales dentro del tejido ^9,10, y un método DIC 3D reciente de campo completo que considera el movimiento fuera del plano y las deformaciones 3D ¹¹ . Sin embargo, la exactitud y sensibilidad de estas técnicas se han informado sólo en unos pocos casos, y ninguna de estas técnicas se ha puesto a disposición del público, lo que dificulta la adopción y utilización generalizadas de estas técnicas.

El objetivo de este trabajo fue crear una herramienta de análisis validada para medir las tensiones tisulares locales en los explantes tendinosos que esté fácilmente disponible y sea fácil de usar. El método elegido se basa en un algoritmo de correlación de imágenes digitales (ALDIC) de lagrangiano aumentado disponible públicamente escrito en MATLAB que fue desarrollado por Yang y Bhattacharya¹². Este algoritmo se adaptó para analizar muestras de tendones y se validó aplicándolo a imágenes transformadas digitalmente y comparando las deformaciones medidas en muestras de tendones reales con los resultados obtenidos de líneas fotoblanqueadas. Además, se implementó una funcionalidad adicional en el algoritmo para confirmar la precisión del campo de desplazamiento calculado incluso en ausencia de valores de deformación conocidos o una técnica de medición secundaria. Por lo tanto, este algoritmo es una herramienta muy útil y adaptable para medir con precisión las tensiones locales del tejido 2D en los tendones.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Pensilvania.

1. Preparación del tejido

1. Para este protocolo, recolecte los tendones de Aquiles de ratones machos C57BL / 6 de 2-4 meses de edad.
   NOTA: También se pueden usar diferentes tendones o ligamentos de ratones u otros animales pequeños.
   1. Haga una incisión en la piel superficial del tendón de Aquiles para exponer el tendón plantar y el tejido conectivo circundante. Luego, retírelos con una cuchilla quirúrgica.
   2. Separe los músculos sóleo y gastrocnemio expuestos de la extremidad posterior, y raspe cuidadosamente el tendón de Aquiles con la cuchilla quirúrgica
   3. Separe el calcáneo del resto del pie con un accesorio de rueda de corte en una herramienta rotativa.
2. Teñir el tejido en 1,5 ml de una solución de 5 μg/ml de 5-(4,6-diclorotriazinil) aminofluoresceína (DTAF) y tampón de bicarbonato de sodio 0,1 M durante 20 min en un mezclador giratorio a temperatura ambiente. Esta solución tiñe proteínas (por ejemplo, matriz extracelular) en el tejido.
   NOTA: Durante este período de 20 minutos, se debe completar el paso 1.3.
3. Prepare una solución 1:1.000 de DRAQ5 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para teñir los núcleos. Utilice un mezclador de vórtice para homogeneizar la solución.
4. Después del período de incubación de 20 minutos en el paso 1.2, transferir el tejido de la solución DTAF a la solución DRAQ5 e incubar en un espacio oscuro durante 10 minutos a temperatura ambiente.

2. Carga del tendón y adquisición de imágenes

NOTA: Este protocolo requiere un dispositivo de tracción que se puede montar en la parte superior de un microscopio confocal. Para este estudio, se utilizó el dispositivo de microtracción descrito por Peterson y Szczesny¹³ .

1. Coloque el tendón en las empuñaduras del dispositivo de carga de tracción. Antes de montar las empuñaduras en el dispositivo de carga, utilice pinzas digitales para medir la distancia entre el accesorio calcáneo y la empuñadura opuesta. Esta distancia es la longitud del calibre del tendón.
   1. Alternativamente, monte las empuñaduras en el dispositivo de carga antes de insertar el tendón y empújelas en contacto para definir la posición del motor de desplazamiento cero. El desplazamiento de los motores después de insertar el tendón podría proporcionar una longitud de medidor de agarre a agarre potencialmente más precisa.
2. Monte las empuñaduras en el dispositivo de carga, que contiene PBS para mantener la hidratación de los tejidos. Alinee el tendón lo mejor posible con el eje x o el eje y de las imágenes del microscopio para que las salidas de deformación x y deformación del algoritmo se correspondan con los ejes del tendón.
   NOTA: En este estudio, los tendones se alinearon con el eje x. Si no es posible alinear perfectamente el tendón con los ejes de imagen, entonces las salidas de deformación x y deformación y del algoritmo se pueden transformar para alinearse con los ejes longitudinales / perpendiculares del tendón utilizando ecuaciones estándar de transformación de deformación¹⁴.
3. Precargue el tendón con 1 g de tensión y, si lo desea, aplique carga cíclica para preacondicionar la muestra. En este protocolo, no se utilizó ningún preacondicionamiento ya que el objetivo del estudio era validar las cepas tisulares locales medidas en lugar de medir las propiedades del material tisular. Si hay interés en medir las propiedades del material a macroescala, que dependen del historial de carga, se recomienda el preacondicionamiento. Después del preacondicionamiento y la recuperación, vuelva a aplicar una precarga de 1 g.
4. Si lo desea, fotoblanquee un conjunto de cuatro líneas separadas por 80 μm en la región central del tejido (ver Peterson y Szczesny¹³ para más detalles).
   NOTA: Las líneas fotoblanqueadas se utilizaron para validar las mediciones del algoritmo ALDIC y no son necesarias para realizar el ALDIC en sí. El número y el espaciado de las líneas se pueden ajustar, y la ubicación de las líneas debe elegirse para evitar cualquier artefacto en la muestra que disminuya la claridad de la línea.
5. Repita el procedimiento de fotoblanqueo en los extremos izquierdo y derecho del tejido cerca de los agarres.
6. Usando el microscopio confocal, adquiera imágenes volumétricas (x,y: 1,25 μm/píxel, z: 2,5 μm/píxel) de la fluorescencia DTAF y DRAQ5 a 1 g de precarga.
7. Realice una rampa de deformación a 0,5%/s a 2% de deformación. Tenga en cuenta que la velocidad de deformación y la magnitud de deformación incremental se pueden ajustar.
8. Permita que el tejido se estrese y se relaje durante 10 minutos.
   NOTA: La duración de la relajación del estrés debe elegirse de tal manera que la muestra esté bajo una carga aproximadamente cuasiestática durante la adquisición de la imagen. Para determinar si la duración de la relajación de la tensión es aceptable, determine la pendiente de la curva fuerza-tiempo durante el último minuto de relajación de la tensión (Figura suplementaria 1) y multiplique esta pendiente por la duración total de la imagen. En este estudio, la fuerza aplicada al mayor incremento de deformación nunca cambió en más del 5%.
9. Tome otra imagen volumétrica del tejido después de la deformación.
10. Repita los pasos 2.7-2.9 hasta alcanzar la tensión final deseada. En este trabajo, se eligió un valor final de cepa del 12%.

3. Procesamiento de imágenes

1. Utilice ImageJ o Fiji para crear proyecciones z máximas de cada imagen volumétrica del canal DRAQ5 (nuclear). Esto servirá como las imágenes moteadas en 2D para el ALDIC.
2. Guarde las proyecciones z de intensidad máxima como archivos .tiff y asígneles un nombre según la siguiente convención de nomenclatura.
   1. Utilice un número como primer carácter del nombre de la imagen.
   2. Haga que el número corresponda al orden en que se considerarán las imágenes durante el análisis de deformación. Por ejemplo, la primera imagen debe comenzar con uno, y la segunda imagen debe comenzar con dos. Se pueden elegir diferentes números, pero deben aumentar secuencialmente. Un ejemplo de convención de nomenclatura es el siguiente: "0_Experiment1_MaxZProjection".
3. Guarde todas las proyecciones z de intensidad máxima cuyo nombre ha cambiado en una carpeta.

4. Instalación y aplicación del código de análisis de línea fotoblanqueada

NOTA: Estos pasos sólo son necesarios si se desea confirmar la precisión del algoritmo ALDIC utilizando líneas fotoblanqueadas. El código calcula la tensión tisular local como el cambio normalizado promedio en la distancia entre cada línea fotoblanqueada dentro del conjunto de líneas fotoblanqueadas. En este estudio, los valores locales promedio se promediaron en todos los conjuntos de líneas fotoblanqueadas (es decir, en el centro y los extremos izquierdo / derecho) para determinar un solo valor promedio de deformación tisular local para cada muestra. Este valor se utilizó para estimar la precisión del algoritmo ALDIC.

1. Descargue la carpeta "PBL Code" de GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) y mueva todo el contenido al directorio de trabajo en MATLAB.
2. Abra el script de MATLAB "Micro_Mech_Template.m".
   1. Pulse Ejecutar y seleccione uno de los archivos de imagen que contienen las imágenes volumétricas. Las imágenes volumétricas pueden ser cualquiera de los siguientes tipos de archivo: .lsm, .tiff, .nd2.
   2. El software cargará automáticamente todas las imágenes en la carpeta y mostrará una imagen proyectada de la imagen volumétrica de referencia. Cuando se le solicite, haga clic con el botón izquierdo para crear líneas multipunto que tracen los extremos izquierdo y derecho de la muestra. Haga clic con el botón secundario para terminar una línea. Una vez procesada la entrada, si las aristas son correctas, pulse Ok para aceptar el resultado.
   3. Dibuje una línea diagonal aleatoria a través de la muestra como línea de referencia cuando se le solicite.
   4. Introduzca el número de líneas fotoblanqueadas creadas y trace las líneas fotoblanqueadas con líneas multipunto.
   5. Si el resultado es aceptable, acéptalo. Si el resultado es erróneo, ajústelo y vuelva a procesarlo.
3. Repita el paso 4.2 para todas las imágenes y mueva todas las imágenes de líneas trazadas a una sola carpeta.
4. Abra el script "Micro_Mech_Strain.m".
   1. Pulse Ejecutar para ejecutar el código y seleccione una de las imágenes guardadas donde se trazan las líneas fotoblanqueadas.
   2. Confirme que las imágenes que acompañan seleccionadas son correctas una vez seleccionada la imagen pulsando Ok.

5. Creación de imágenes transformadas digitalmente

NOTA: Estos pasos sólo son necesarios si se desea confirmar la precisión del algoritmo ALDIC utilizando imágenes transformadas digitalmente. Estas imágenes simulan campos de deformación 2D homogéneos de una magnitud conocida mediante la transformación artificial de la imagen de referencia.

1. Descargue el código "Digital_strain.m" de GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc).
2. Abra y ejecute el código.
3. Cuando se le solicite, inserte los valores deseados para la deformación máxima aplicada, el incremento de deformación aplicada y la relación de Poisson. Presione Ok.
   NOTA: Para este experimento, la deformación máxima aplicada fue de 0,1 (10%), el incremento de deformación aplicado fue de 0,02 (2%) y se utilizó una relación de Poisson de 1, que es consistente con los datos experimentales de la prueba de tracción del tendón^15,16. El código utiliza la función imwarp de MATLAB integrada y los valores de entrada (por ejemplo, incrementos de deformación, relación de Poisson) para crear las imágenes transformadas digitalmente.
4. Cuando se le solicite, seleccione la imagen de referencia sin deformar.
5. Para cada incremento de deformación, se muestra una superposición de la imagen de referencia y la imagen transformada. La imagen transformada se guardará en el directorio bajo el título "DigitallyTransformedX%Strain", donde X es el incremento de deformación.

6. Instalación y aplicación del código de validación y cálculo de deformación

1. Descargue la carpeta "Código de validación y cálculo de deformación" de GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) y mueva todo el contenido al directorio de trabajo de MATLAB
2. Instale un compilador mex C / C ++ de acuerdo con Yang y Bhattacharya¹². Los pasos se resumen a continuación.
   1. Compruebe MATLAB para ver si se ha instalado un compilador mex C/C++ escribiendo "mex -setup" en la ventana de comandos de MATLAB y pulsando Intro.
   2. Si aparece un error que indica que un compilador no es compatible o no está presente, continúe con los pasos 6.3 y 6.4.
   3. Si no hay ningún error, continúe con el paso 6.5
3. Para descargar un compilador mex C/C++, vaya a "https:/tdm-gcc.tdragon.net/" y elija el compilador TDM-gcc.
4. Instale el compilador descargado en una ubicación conocida.
5. Vuelva a la ventana de comandos de MATLAB y escriba: "setenv("MW_MINGW64_LOC","[Escriba su ruta de instalación aquí]")". Por ejemplo, podría ser "setenv("MW_MINGW64_LOC","C:\TDM-GCC-64")". Si este comando se ejecuta correctamente, el compilador mex está instalado correctamente.
6. Introduzca el script de función "main_aldic.m" y cambie la línea 22 para que coincida con el comando ejecutado en el paso 6.5.
7. Abra el script "Strain_calc_and_validate.m".
8. Pulse Ejecutar para comenzar el análisis de la imagen.
9. Cuando se le solicite, modifique los valores de los parámetros ALDIC como desee.
   NOTA: El tamaño de la ventana debe ser de 0,25 a 1 veces el tamaño del subconjunto. Para obtener más información sobre las opciones de parámetros, consulte el manual del usuario en línea: (https://www.researchgate.net/publication/344796296_Augmented_Lagrangian_Digital
   _Image_Correlation_AL-DIC_Code_Manual).
   1. En este estudio se utilizaron los siguientes valores:
      Tamaño del subconjunto (píxeles): 20
      Tamaño de ventana (píxeles): 10
      Método para resolver ALDIC: Diferencia finita (1)
      No se utilizó la computación paralela (1)
      Método para calcular la estimación inicial: búsqueda multigrid basada en pirámide de imagen (0)
10. Cuando se le solicite, seleccione la casilla de verificación "Sí" para que el algoritmo guarde automáticamente el valor medio, la desviación estándar y los mapas 2D para la colección deseada de variables (por ejemplo, deformación x, deformación y, deformación cortante, regiones defectuosas, etc.). Seleccione qué variables deben guardarse y pulse Aceptar.
11. Cuando se le solicite, modifique los parámetros como desee.
    1. En este experimento se utilizaron los siguientes valores:
       Puntos circundantes para calcular la deformación (numP): 12
       Coeficiente de correlación para la identificación de regiones incorrectas (corr_threshold): 0.5
       Tamaño de subregión (píxeles) para análisis de región incorrecta (Subtamaño): 32
12. Cuando se le solicite, seleccione la carpeta que contiene las proyecciones z de intensidad máxima cuyo nombre ha cambiado. Tenga en cuenta que el software realiza automáticamente ALDIC incremental para determinar los campos de deformación de las imágenes deformadas. Es decir, cada imagen deformada sirve como la nueva imagen de "referencia" para la siguiente imagen deformada. Esto mejora la precisión de los resultados (Figura complementaria 2) en comparación con la realización de ALDIC acumulativo, donde cada imagen deformada se compara con la imagen de referencia original (0% de deformación). Para realizar un análisis acumulativo, cargue las imágenes, pero solo seleccione la imagen de referencia original y la imagen deformada de interés.
    NOTA: La deformación normal se calcula como λ - 1, donde λ es el estiramiento del tejido. El estiramiento del tejido se calcula de acuerdo con , donde N = [1 0]T o [0 1]T para la dirección x y la dirección y, respectivamente, y C = F ^T F, donde F es el gradiente de deformación calculado utilizando puntos "numP" que rodean cada punto de datos de salida por el algoritmo ALDIC. La deformación cortante se calcula como , donde .
13. Cuando se le solicite, haga clic con el botón izquierdo para crear un polígono de cuatro puntos para definir la región de interés para medir las cepas. Comience con el punto en la esquina superior izquierda y asigne los puntos siguientes en el sentido de las agujas del reloj.
    NOTA: La variable "Almacenamiento" guardada en el espacio de trabajo de MATLAB contiene todos los valores para la deformación x media, la desviación estándar de deformación x, la deformación y media, la desviación estándar de deformación y, la deformación cortante media, la desviación estándar de deformación cortante y el porcentaje de regiones incorrectas. Las regiones malas se definen de acuerdo con el análisis del coeficiente de correlación dentro de la región de interés seleccionada en el paso 6.13. La carpeta "NuclearTrackingResults" (que se puede cambiar ajustando las líneas 555 y 556) almacena todas las gráficas especificadas en el paso 6.10. Esta carpeta también contiene un archivo de hoja de cálculo con el nombre "Resultados", que almacena todas las medias y desviaciones estándar especificadas en el paso 6.10.

Resultados

Antes de analizar los campos de deformación en muestras de tejido reales, el protocolo ALDIC se validó por primera vez utilizando imágenes tensadas / transformadas digitalmente de núcleos dentro de tendones de Aquiles de ratón. Específicamente, las imágenes se transformaron para producir digitalmente cepas uniformes en la dirección x de 2%, 4%, 6%, 8% y 10% de tensión con una relación de Poisson simulada de 1^15,16. La precisión del algoritmo ALDIC se evaluó compa...

Discusión

El objetivo de este trabajo fue proporcionar un método validado de código abierto para medir los campos de deformación 2D en tendones bajo carga de tracción. La base del software se basó en un algoritmo ALDIC disponible públicamente¹². Este algoritmo se integró en un código de MATLAB más grande con la funcionalidad añadida de análisis de deformación incremental (frente a acumulativo). Este algoritmo adaptado se aplicó a la prueba de tracción de tendones, y su precisión se evaluó mediante dos técni...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5-DTAF (5-(4,6-diclorotriazinil) aminofluoresceína), isómero único	Calibradores ThermoFisher	D16
	Mitutoyo	500-196-30
Microscopio confocal	Nikon	A1R HD
Corning LSE Mezclador de vórtice	Coning	6775
DRAQ5 Solución de sonda fluorescente (5 mM)	ThermoFisher	62554
MATLAB	MathWorks	R2022b
Dispositivo de carga de tracción	N/A	N/A	Dispositivo de carga de tracción descrito en Peterson et al, 2020. (ref 13)
Revólver de tubo ThermoFisher		88881001