El presente protocolo describe un método para aislar, expandir y reprogramar células derivadas de orina de primates humanos y no humanos a células madre pluripotentes inducidas (iPSC), así como instrucciones para el mantenimiento sin alimentador de las iPSC recién generadas.
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Artículo de método
Generación y mantenimiento de células madre pluripotentes inducidas por primates derivadas de la orina
En este artículo
Resumen
Resumen
Los enfoques entre especies que estudian las células madre pluripotentes de los primates y sus derivados son cruciales para comprender mejor los mecanismos moleculares y celulares de la enfermedad, el desarrollo y la evolución. Para hacer que las células madre pluripotentes inducidas por primates (iPSC) sean más accesibles, este documento presenta un método no invasivo para generar iPSC de primates humanos y no humanos a partir de células derivadas de la orina, y su mantenimiento utilizando un método de cultivo sin alimentador.
La orina puede ser muestreada de un ambiente no estéril (por ejemplo, la jaula del animal) y tratada con un cóctel antibiótico de amplio espectro durante el cultivo celular primario para reducir la contaminación de manera eficiente. Después de la propagación de las células derivadas de la orina, las iPSC se generan mediante un método de transducción modificado de un sistema vectorial del virus Sendai disponible comercialmente. Las primeras colonias de iPSC ya pueden ser visibles después de 5 días, y se pueden recoger después de 10 días como muy pronto. El paso de grumos de rutina con tampón de disociación libre de enzimas apoya la pluripotencia de las iPSC generadas durante más de 50 pasajes.
Introducción
Las comparaciones genómicas de primates humanos y no humanos (NHP) son cruciales para comprender nuestra historia evolutiva y la evolución de los rasgos específicos de los humanos1. Además, estas comparaciones permiten inferir la función mediante la identificación de secuencias de ADN conservadas2, por ejemplo, para priorizar las variantes asociadas a la enfermedad3. Las comparaciones de fenotipos moleculares, como los niveles de expresión génica, son cruciales para interpretar mejor las comparaciones genómicas y descubrir, por ejemplo, las diferencias fenotípicas celulares. Además, tienen, simila....
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Protocolo
Este procedimiento experimental fue aprobado por el comité de ética responsable de la experimentación humana (20-122, Ethikkommission LMU München). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos pertinentes.
NOTA: Se debe obtener la aprobación del comité ético apropiado antes de comenzar los experimentos que tratan con muestras humanas y NHP. Todos los procedimientos experimentales deben realizarse de acuerdo con las directrices y reglamentos pertinentes. Cada uno de los siguientes pasos debe realizarse utilizando una técnica estéril en un armario de seguridad biológica. Todas las composiciones de búfer y medios se pueden encontra....
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Resultados
Al aislar células de la orina humana y NHP, se pueden identificar diferentes tipos de células directamente después del aislamiento. Las células escamosas, así como varias células redondas más pequeñas, se excretan con la orina; la orina femenina contiene muchas más células escamosas que la orina masculina (Figura 1B - Día 0; Figura suplementaria S1). Después de 5 días de cultivo en medio urinario primario, se pueden ver las primeras células adherentes en proliferación (
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Discusión
Las iPSC son tipos de células valiosas, ya que permiten la generación de tipos de células in vitro que de otro modo serían inaccesibles. Como los materiales de partida para la reprogramación, por ejemplo, los fibroblastos no están fácilmente disponibles de todas las especies de primates, este artículo presenta un protocolo para la generación de iPSCs a partir de células derivadas de la orina. Estas células se pueden obtener de manera no invasiva, incluso a partir de muestras de orina de primates no estériles, co.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por DFG EN 1093/5-1 (proyecto número 458247426). M.O. fue apoyado por JSPS Overseas Research Fellowship. Todas las figuras fueron creadas con BioRender.com. La citometría de flujo se realizó con la ayuda de la citometría de flujo de la instalación central en el Centro Biomédico de Munich. Nos gustaría agradecer a Makoto Shida y Tomoyo Muto de ASHBi, Universidad de Kyoto, por el apoyo a la videografía.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Accumax™ solución de desprendimiento de células (Solución de desprendimiento) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Anfotericina B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anticuerpo de ratón antihumano TRA-1-60 | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilución: 1/200 |
| Anticuerpo conjugado TRA-1-60 PE antihumano | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilución: 1/50 |
| Bambanker™ (Medio de congelación de células) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Placa multipocillo para cultivo celular, 12 pocillos CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II contador de células automatizado | Thermo Fisher Scientific AMQAX1000 | ||
| CryoKing&1.5 mL Tubos con código de barras 2D (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Se pueden utilizar diferentes tipos de criotubos para la congelación. Los tubos de código de barras 2D tienen la ventaja de que la información de la muestra se puede almacenar en una base de datos con información única del tubo. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-fenilindol diclorhidrato | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucosa | TH. Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 con L-glutamina | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilución: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilución: 1/500 |
| DPBS sin Calcio sin Magnesio | TH. Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Anticuerpo policlonal recombinante para conejos (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilución: 1/500 |
| Ácido etilendiaminérgico tetraacético (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL fondo cónico | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL fondo cónico | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Suero fetal bovino, calificado, inactivado por calor, Brasil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | ||
| Gelatina de piel porcina | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ Matriz de membrana basal sin LDEV, con calificación hESC, factor de crecimiento reducido Thermo | Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Suplemento | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i incubadora de CO2 | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe armario de seguridad | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, de primera calidad | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Versión 2.9.0 | |
| MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X) | Thermo Fisher Scientific 11140035 | ||
| Tubo de microcentrifugación PP, 1,5 mL | Microscopio Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Anticuerpo anti-alfa-fetoproteína de ratón | R& D Systems | MAB1368 | Dilución: 1/100 |
| Anticuerpo de actina anti-alfa-músculo liso de ratón | R& D Systems | MAB1420 Dilución: 1/100 | |
| Anticuerpo de tubulina anti-beta-III de ratón | R& D Systems | MAB1195 Dilución: 1/100 | |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Tecnología de señalización celular | 4903S | Dilución: 1/400 |
| normocure™ (Reactivo antimicrobiano) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Anticuerpo de conejo | Tecnología de señalización celular | 2750S | Dilución: 1/400 |
| Paraformaldehído (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | contiene 100 U/mL de penicilina y 100 µ g/mL de estreptomicina. |
| FGF humano recombinante-básico | PeproTech | 100-18B | |
| PDGF-AB humano recombinante | PeproTech | 100-00AB | |
| Centrífuga de sobremesa refrigerada | SIGMA | 4-16KS | |
| renales | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) mAb de ratón #4900 | Tecnología de señalización celular | 4900S | Dilución: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) mAb de ratón | NEB | 4755S | Dilución: 1/500 |
| Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | La producción de este medio se suspendió, utilizando StemFit Basic04CT para líneas celulares humanas o StemFit Basic03 para primates no humanos en su lugar. |
| Tritón X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Seleccione Enzima (1x), sin rojo de fenol (Enzima de disociación) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Sal de diclorhidrato (Inhibidor de roca) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Tampón | Para la composición, consulte el suplemento tabla S1 | ||
| Tampón | Para la composición, véase la tabla complementaria S1 | ||
| REMC | Para la composición, véase la tabla complementaria S1 | ||
| Medio urinario primario | Para la composición, véase la tabla complementaria S1 | ||
| cultivo | Para la composición, véase la tabla complementaria S1 | ||
| generación PSC | Para la composición, véase la tabla complementaria S1 | ||
| Tampón | de orina Para conocer la composición, véase la tabla complementaria S1 |
Referencias
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al.
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Reimpresiones y permisos
