Artículo de método

Generación y mantenimiento de células madre pluripotentes inducidas por primates derivadas de la orina

DOI:

10.3791/64922

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28 de julio de 2023

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1Faculty of Biology, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology, Kyoto University, 3Hakubi Center, Kyoto University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente protocolo describe un método para aislar, expandir y reprogramar células derivadas de orina de primates humanos y no humanos a células madre pluripotentes inducidas (iPSC), así como instrucciones para el mantenimiento sin alimentador de las iPSC recién generadas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los enfoques entre especies que estudian las células madre pluripotentes de los primates y sus derivados son cruciales para comprender mejor los mecanismos moleculares y celulares de la enfermedad, el desarrollo y la evolución. Para hacer que las células madre pluripotentes inducidas por primates (iPSC) sean más accesibles, este documento presenta un método no invasivo para generar iPSC de primates humanos y no humanos a partir de células derivadas de la orina, y su mantenimiento utilizando un método de cultivo sin alimentador.

La orina puede ser muestreada de un ambiente no estéril (por ejemplo, la jaula del animal) y tratada con un cóctel antibiótico de amplio espectro durante el cultivo celular primario para reducir la contaminación de manera eficiente. Después de la propagación de las células derivadas de la orina, las iPSC se generan mediante un método de transducción modificado de un sistema vectorial del virus Sendai disponible comercialmente. Las primeras colonias de iPSC ya pueden ser visibles después de 5 días, y se pueden recoger después de 10 días como muy pronto. El paso de grumos de rutina con tampón de disociación libre de enzimas apoya la pluripotencia de las iPSC generadas durante más de 50 pasajes.

Introducción

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Las comparaciones genómicas de primates humanos y no humanos (NHP) son cruciales para comprender nuestra historia evolutiva y la evolución de los rasgos específicos de los humanos1. Además, estas comparaciones permiten inferir la función mediante la identificación de secuencias de ADN conservadas2, por ejemplo, para priorizar las variantes asociadas a la enfermedad3. Las comparaciones de fenotipos moleculares, como los niveles de expresión génica, son cruciales para interpretar mejor las comparaciones genómicas y descubrir, por ejemplo, las diferencias fenotípicas celulares. Además, tienen, similar a las comparaciones a nivel de ADN, el potencial de inferir relevancia funcional y, por lo tanto, de interpretar mejor la variación médicamente relevante dentro de los humanos4. La incorporación de datos fenotípicos moleculares completos en estos estudios comparativos requiere recursos biológicos apropiados (es decir, células ortólogas en todas las especies). Sin embargo, razones éticas y prácticas hacen que sea difícil o imposible acceder a tales células comparables, especialmente durante el desarrollo. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) permiten la generación de tales tipos de células inaccesibles in vitro5,6, son experimentalmente accesibles y se han utilizado para comparaciones de primates 6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Para generar iPSCs, uno necesita adquirir las células primarias para ser reprogramadas. Las células aisladas de la orina tienen la ventaja de que pueden ser muestreadas de forma no invasiva de primates, y que pueden ser fácilmente reprogramadas, probablemente debido a sus perfiles moleculares similares a las células madre15. Las condiciones de cultivo para mantener las iPSCs de primates son tan importantes como la reprogramación; Clásicamente, el cultivo de células madre pluripotentes humanas requería un medio no definido, basado en suero y cocultivo de fibroblastos embrionarios de ratón - las llamadas células de alimentación - que proporcionan nutrientes esenciales y un andamio para las células madre embrionarias (ESC)16. Desde el desarrollo de sistemas de cultivo químicamente definidos y sin alimentadores17,18, ahora hay varias opciones de medios de cultivo y matrices iPSC disponibles comercialmente. Sin embargo, la mayoría de estas condiciones de cultivo se han optimizado para ESC e iPSC humanas y, por lo tanto, podrían funcionar menos bien en la cultura NHP iPSC. En este protocolo de video, proporcionamos instrucciones para generar y mantener iPSCs humanas y NHP derivadas del cultivo de células urinarias.

Desde el primer informe de generación de iPSC por la expresión forzada de factores definidos en fibroblastos en 2006, este método se ha aplicado a muchos tipos celulares diferentes de diversos orígenes 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Entre ellos, solo se pueden obtener células derivadas de la orina de una manera completamente no invasiva. Con base en el protocolo previamente descrito por Zhou et al.33, se pueden aislar y expandir células de orina de primates, incluso de muestras no estériles, complementando antibióticos de amplio espectro15. En particular, las células derivadas de orina muestreadas por este protocolo exhiben un alto potencial para producir iPSCs, en un período de tiempo más corto (las colonias se hacen visibles en 5-15 días) que la reprogramación convencional de fibroblastos (20-30 días, en nuestra experiencia), y con una tasa de éxito suficientemente alta. Estas células derivadas de la orina fueron clasificadas como la población mixta de células madre mesenquimales similares a células madre y células epiteliales de la vejiga, causando la alta eficiencia de reprogramación15.

Además de la variación en las celdas primarias, los métodos de reprogramación para generar iPSC también varían según el propósito del uso. Los procedimientos convencionales de reprogramación para células somáticas humanas se llevaron a cabo mediante la sobreexpresión de factores de reprogramación con vectores de retrovirus o lentivirus, lo que permitió la integración de ADN exógeno en el genoma 5,34,35. Para mantener las iPSC generadas genómicamente intactas, los investigadores han desarrollado una amplia variedad de sistemas de no integración: vector PiggyBac36,37 extirpable, vector episomal38,39, vectores de virus no integradores como el virus Sendai 40 y el adenovirus 41, transfección de ARNm42, transfección de proteínas 43,44 y tratamiento con compuestos químicos 45. Debido a la eficiencia y facilidad en el manejo, los vectores de reprogramación basados en virus Sendai se utilizan en este protocolo. La infección de las células primarias se realiza en un cultivo en suspensión de 1 h de células y virus a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 antes del recubrimiento. Este paso modificado podría aumentar la probabilidad de contacto entre las superficies celulares y los virus, en comparación con el método convencional en el que los virus se agregan directamente al cultivo celular adherente, y así producir más colonias de iPSC15.

El paso de células madre pluripotentes humanas y NHP se puede hacer mediante el paso de grupos y el paso de células individuales. El ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) es un agente quelante rentable que se une a los iones de calcio y magnesio y, por lo tanto, impide la actividad adherente de la cadherina y la integrina. El EDTA también se utiliza como un reactivo de disociación selectiva suave, ya que las células indiferenciadas se desprenden antes que las células diferenciadas debido a sus diferentes moléculas de adhesión. La disociación completa induce la muerte celular masiva de las iPSC de primates a través de la hiperactivación de la miosina mediada por la bobina enrollada asociada a Rho/Rho (Rho/Rock). Por lo tanto, la suplementación del medio de cultivo con un inhibidor de Rho/Rock es esencial para experimentos que requieren células individuales en suspensión46,47. En este protocolo, recomendamos el paso por grupos como el método de paso de rutina y recomendamos el paso de una sola célula solo cuando sea necesario, por ejemplo, cuando se requiere la siembra de números de células definidos o durante la subclonación.

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Protocolo

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Este procedimiento experimental fue aprobado por el comité de ética responsable de la experimentación humana (20-122, Ethikkommission LMU München). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos pertinentes.
NOTA: Se debe obtener la aprobación del comité ético apropiado antes de comenzar los experimentos que tratan con muestras humanas y NHP. Todos los procedimientos experimentales deben realizarse de acuerdo con las directrices y reglamentos pertinentes. Cada uno de los siguientes pasos debe realizarse utilizando una técnica estéril en un armario de seguridad biológica. Todas las composiciones de búfer y medios se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria S1. Asegúrese de que todos los medios se calientan a temperatura ambiente (22 °C) antes de añadirlos a las celdas. Cada paso de centrifugación debe realizarse a temperatura ambiente, a menos que se mencione lo contrario.

1. Aislamiento de células de muestras de orina

PRECAUCIÓN: Asegúrese de que los donantes humanos estén libres del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la hepatitis C (VHC). Para los NHP, asegúrese de que los posibles donantes/células estén libres de patógenos específicos: virus B (VB), virus de inmunodeficiencia simia (SIV), betaretrovirus simio (SRV) y virus linfotrópico de células T simias (STLV).

  1. Prepare una placa de 12 pocillos recubierta de gelatina agregando 500 μL de gelatina al 0,2% por pocillo y distribuya el líquido moviendo la placa. Colocar a 37 °C durante al menos 30 min antes de que sea necesario.
  2. Recolectar muestras de orina humana en tubos cónicos de 50 ml. Para los primates, recolecte orina del piso de la instalación de animales con una jeringa.
    NOTA: Se demostró que un volumen de 5 ml de orina era suficiente para aislar al menos una colonia en el 42% de los intentos. Sin embargo, se recomienda usar un volumen más alto de ~ 50 ml de orina para aumentar la posibilidad de aislar colonias. La orina NHP debe tomarse lo más fresca posible, preferiblemente inmediatamente después de orinar. El almacenamiento de muestras de orina a 4 °C durante 4 h no tuvo ningún efecto negativo en la tasa de éxito del protocolo, pero no se probaron tiempos de almacenamiento más largos.
  3. Centrifugar el tubo que contiene orina a 400 × g durante 10 min, y aspirar cuidadosamente el sobrenadante, dejando aproximadamente 1 ml en el tubo.
  4. Resuspender el pellet en el residuo de 1 ml de líquido. Agrupe las suspensiones en un tubo si se recolectaron varios tubos de orina.
  5. Lave las células añadiendo 10 ml de tampón de lavado de orina (ver Tabla suplementaria S1) que contenga 2,5 μg/ml de anfotericina al tubo, y mezcle cuidadosamente la suspensión con una pipeta serológica.
  6. Centrifugar el tubo a 200 × g durante 10 min, y aspirar cuidadosamente el sobrenadante, dejando aproximadamente <0,2 ml en el tubo.
  7. Resuspender el pellet celular en 1 ml de medio urinario primario (ver Tabla suplementaria S1) que contenga 0,5 μg/ml de anfotericina por 50 ml de orina procesada inicialmente (resuspender en 1 ml, incluso si se procesaron menos de 50 ml de orina).
  8. Aspirar gelatina de los pocillos (preparada en el paso 1.1) y placa 1 ml de la suspensión del paso 1.7 en un pocillo de una placa de 12 pocillos. Repita para tantos pozos como desee, o para tantos mililitros de suspensión disponibles.
    Opcional: Para evitar la contaminación originada por la recolección de muestras insalubres, agregue 100 μg / ml de reactivo antimicrobiano a las células de aquí en adelante, hasta el primer paso.
  9. Colocar la placa en una incubadora de 37 °C, 5% deCO2 .
  10. Añadir 1 ml de medio urinario primario por pocillo diariamente hasta el día 5, sin eliminar el medio existente.
  11. El día 5, aspirar 4 mL de medio de la placa, dejando aproximadamente 1 mL de medio. Añadir 1 ml de medio REMC (véase la Tabla suplementaria S1) por pocillo para obtener una mezcla 1:1 con el nuevo medio de cultivo.
  12. Reemplace la mitad del medio con medio REMC todos los días hasta que aparezcan las primeras colonias (Figura 1A, B). Por lo tanto, retire 1 ml de medio viejo y agregue 1 ml de medio REMC fresco por pocillo.

2. Expansión de las células urinarias

NOTA: El paso de células urinarias debe realizarse antes de que el cultivo alcance el 90% de confluencia.

  1. Prepare la cantidad deseada de placas de 12 pocillos recubiertas de gelatina, como se indica en el paso 1.1.
  2. Aspire el medio viejo y lave las células agregando 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
  3. Aspirar el DPBS y añadir 300 μL de enzima de disociación 0,5x diluida con DPBS. Incubar la placa a 37 °C durante 5 min.
  4. Añadir 700 μL de medio REMC para detener la reacción enzimática. Pipetear suavemente la suspensión con una pipeta P1000 hasta que las células se disocien en células individuales.
  5. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifugue el tubo a 200 × g durante 5 min.
  6. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 1 ml de medio REMC.
  7. Cuente las células usando un contador de células (un hemocitómetro o un contador celular automatizado).
  8. Para la expansión de las células urinarias, placa 1.5 × 104 a 3 × 104 células en 1 ml de medio REMC en una placa de 12 pocillos recubierta con gelatina al 0.2%.
  9. Realizar cambios de medio posteriores cada dos días hasta que el cultivo alcance el 80%-90% de confluencia. Por lo tanto, aspire el medio viejo y agregue 1 ml de medio REMC fresco.

3. Generación de iPSCs por infección vectorial del virus Sendai

NOTA: Para el flujo de trabajo del procedimiento de reprogramación, consulte la figura 2A. Las células urinarias utilizadas para la reprogramación deben ser lo más jóvenes posible, pero no se observa una pérdida notable de la eficiencia de la reprogramación antes del pasaje 4. El kit de reprogramación de virus Sendai debe usarse en una instalación BL-2. Manipule los virus bajo un gabinete de seguridad biológica con flujo laminar, y siempre use el equipo de seguridad apropiado para evitar la exposición de la mucosa.

  1. Prepare una placa de 12 pocillos recubierta con matriz de membrana basal agregando 500 μL de matriz de membrana basal por pocillo y distribuya el líquido moviendo la placa. Incubar la placa a 37 °C durante al menos 1 h y sustituir la matriz de la membrana basal por 900 μL de medio REMC. Conservar el plato a 37 °C hasta su uso.
  2. Descongele rápidamente los componentes del kit de reprogramación Sendai en un baño maría a 37 °C. Mezclar los virus Sendai (policistrónico KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC y KLF4) con un MOI de 5, y añadir medio REMC hasta 100 μL. Utilice la ecuación (1):
    Cálculo de la fórmula del volumen del virus, método MOI, ecuación para aplicaciones de estudio celular.
    NOTA: Como los títulos de virus difieren entre lotes, verifique siempre el título en el certificado de análisis proporcionado por el fabricante.
    Opcional: Utilice el virus Sendai de la proteína verde fluorescente (GFP) además como control positivo para la eficiencia de la transducción. Para ello, prepare 3,5 × 104 celdas adicionales en un tubo separado durante el paso 3.3.
  3. Para la disociación de las células urinarias, siga los pasos 2.2-2.4. Contar las células con el contador de células y transferir 7 × 104 células urinarias a un tubo de 1,5 ml.
  4. Centrifugar el tubo a 200 × g durante 5 min, y retirar con cuidado el sobrenadante sin interrumpir el pellet celular. Resuspender el pellet en 100 μL de la mezcla de SeV preparada en la etapa 3.2. Incubar el tubo durante 1 h a 37 °C para la infección de la suspensión.
  5. Coloque la suspensión en las placas de 12 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal que se prepararon en el paso 3.1. Habitualmente, la placa 1 × 10 4 y 2,5 × 104 celdas por pocillo por duplicado.
  6. Incubar las células a 37 °C y 5% deCO2. Reemplace el medio con 1 ml de medio REMC fresco 24 h después de la transducción y el día 3.
  7. El día 5 después de la transducción, cambie el medio a medio de generación PSC (véase la Tabla suplementaria S1), con cambios posteriores del medio cada dos días. Por lo tanto, retire el medio viejo y agregue 1 ml de medio de generación PSC por pozo.
    NOTA: Puede tomar hasta 15 días hasta que aparezcan las primeras colonias.
  8. Elija colonias individuales de iPSC cuando el tamaño de la colonia supere 1 mm. Para hacer esto, raspe y recoja cuidadosamente una sola colonia con una pipeta p10 bajo un microscopio. Transfiera la colonia a un nuevo pocillo de una placa de 12 pocillos recubierta con una matriz de membrana basal que contiene 750 μL de medio de cultivo PSC.
    Opcional: Enjuagar la placa con DPBS y tratar durante 1 minuto con 0,5 mM EDTA antes de la recolección podría apoyar el cultivo robusto de pasos adicionales. Si las células se van a cultivar durante más tiempo para esperar colonias emergentes posteriores, no realice este paso de tratamiento con EDTA.
  9. Cultivar las células a 37 °C y 5% deCO2 con cambios posteriores del medio cada dos días, como se indica en la sección 4 del protocolo. Cuando la colonia recogida alcance un diámetro de 2 mm, continuar con el paso rutinario de iPSC, como se explica en la sección 5 del protocolo.

4. Cambio medio

NOTA: El medio de cultivo debe cambiarse cada dos días hasta que las colonias crezcan lo suficientemente grandes como para pasar.

  1. Aspirar el medio viejo y añadir 750 μL del medio fresco por placa de 12 pocillos. Para cambiar a un tipo diferente de medio, reemplace el medio al menos 1 día después de la muerte.

5. Transmisión

NOTA: Las células deben pasar cuando las colonias iPSC crecen lo suficientemente grandes (diámetro > 2 mm), o las colonias están a punto de tocarse entre sí. Rutinariamente, las iPSC se pueden dividir aproximadamente cada 5 días. Utilice el paso por grupos (paso 5.1) para el mantenimiento de rutina y el paso por una sola célula (paso 5.2) para experimentos en los que se necesita un número definido de células. En caso de que las iPSC se diferencien mucho, la recolección de colonias (paso 5.3) puede ayudar a mejorar la pureza de los cultivos.

  1. Eliminación de grumos
    1. Prepare una placa de 12 pocillos recubierta con matriz de membrana basal agregando 500 μL de matriz de membrana basal por pocillo y distribuya el líquido moviendo la placa. Incubar la placa a 37 °C durante al menos 1 h. Sustituir la matriz de la membrana basal por 500 μL de medio de cultivo PSC y conservar la placa a 37 °C hasta su utilización.
    2. Aspirar el medio de las células cultivadas y lavar las células agregando cuidadosamente 500 μL de DPBS. Retire el DPBS y agregue 500 μL de EDTA de 0,5 mM al pozo.
    3. Incubar la placa a RT durante 2-5 min, hasta que las colonias comiencen a desprenderse. Observe cuidadosamente las células bajo el microscopio.
    4. Cuando los bordes de las colonias comiencen a desprenderse y los espacios entre las células se hagan visibles (Figura 3A), retire el EDTA y agregue con cuidado 500 μL de DPBS.
      NOTA: Siempre pipetear contra la pared lateral del pozo y nunca directamente sobre las celdas, para no separar las células de la placa.
    5. Aspirar el DPBS y enjuagar el pocillo con 500 μL de medio de cultivo PSC utilizando una pipeta p1000. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 1x-5x para dispersar las colonias en grupos de tamaño apropiado (Figura 3A). No pipetear demasiado.
      NOTA: Si las iPSC se pipetean demasiado accidentalmente, agregue 10 μM del inhibidor de roca Y-27632 al medio. Esto puede mejorar la supervivencia, ya que las iPSC no pueden sobrevivir como células individuales.
    6. Transfiera 1/10-1/50 de la suspensión del grupo celular a los nuevos pocillos. La relación depende de la confluencia del pozo antes de la división, la densidad deseada de las células sembradas y la preferencia clonal de iPSC.
    7. Distribuya los grupos uniformemente en el pozo moviendo suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás varias veces. Incubar la placa durante al menos 30 minutos a 37 °C para dejar que los grumos se adhieran.
    8. Sustituir el medio por 750 μL de medio de cultivo PSC si se observan muchas células muertas flotantes; de lo contrario, añadir 250 μL de medio de cultivo PSC. Colocar la placa a 37 °C y 5% deCO2 en una incubadora.
      NOTA: El reemplazo medio después de 30 minutos es crítico, especialmente para líneas celulares inestables (por ejemplo, NHP).
    9. Cambie el medio cada 2-3 días hasta que las colonias crezcan lo suficientemente grandes como para pasar. Para el cambio medio, siga el paso 4 del protocolo.
  2. Paso unicelular
    1. Preparar la placa de cultivo recubierta con matriz de membrana basal, como se indica en el paso 5.1.1, con la adición de 10 μM Y-27632 al medio de cultivo PSC.
      Opcional: Añadir 10 μM Y-27632 a las células 1-3 h antes del paso para mejorar la supervivencia de líneas celulares sensibles.
    2. Aspirar el medio y lavar las células añadiendo 500 μL de DPBS. Retire el DPBS y agregue 300 μL de solución de desprendimiento a los pocillos.
    3. Incubar la placa a 37 °C durante 5-10 min. Cuando se observe suficiente desprendimiento de las células bajo el microscopio, agregue 700 μL de medio de cultivo PSC o DPBS.
    4. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 5-10x usando una pipeta p1000 hasta que las células se disocien en celdas individuales. No pipetear demasiado, con el fin de prevenir el daño celular.
    5. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml que contenga al menos 2 ml de DPBS para diluir la solución de desprendimiento.
    6. Centrifugar el tubo a 200 × g durante 5 min y aspirar la solución completamente, sin interrumpir el pellet celular.
    7. Resuspender el pellet en 500 μL de medio de cultivo PSC suplementado con 10 μM Y-27632.
    8. Contar las células y sembrar 5.000-7.000 células por placa de 12 pocillos recubierta con matriz de membrana basal, preparada en el paso 5.2.1.
      NOTA: Si se necesita un número de celda diferente, cambie a un pozo más grande o más pequeño en consecuencia.
    9. Incubar la placa durante al menos 30 minutos a 37 °C y 5% deCO2 para permitir que las células se adhieran.
    10. Sustituir el medio por 750 μL de medio de cultivo PSC + 10 μM Y-27632 si se observan muchas células muertas; de lo contrario, añadir 250 μL + 10 μM Y-27632.
      NOTA: Este paso es crítico, especialmente para las líneas celulares inestables (por ejemplo, NHP).
    11. Colocar la placa a 37 °C y 5% deCO2 en una incubadora.
    12. Cambie el medio a medio de cultivo PSC sin Y-27632 1 a 2 días después de la división, para permitir que las células vuelvan a mostrar la morfología clásica de la colonia (Figura 3B).
    13. Cambie el medio cada 2 días hasta que las colonias crezcan lo suficiente. Para un cambio medio, siga la sección 4 del protocolo.
  3. Paso de iPSCs por selección de colonias
    1. Preparar 12 pocillos recubiertos con matriz de membrana basal como se indica en el paso 5.1.1.
    2. Aspirar el medio y lavar las células añadiendo cuidadosamente 500 μL de DPBS. Retire el DPBS y agregue 500 μL de EDTA de 0,5 mM al pozo.
    3. Incubar la placa en RT durante 1-3 min y observar las células bajo el microscopio, hasta que el desprendimiento de la colonia sea visible en los bordes.
    4. Retire el EDTA y agregue cuidadosamente 500 μL de DPBS. Aspirar el líquido antes de añadir lentamente 500 μL de medio de cultivo PSC al pocillo, sin desprender las células.
    5. Use una pipeta p200 para recoger la colonia deseada bajo el microscopio, sin recoger las células diferenciadas. Para hacer esto, rasque suavemente sobre la colonia mientras toma las células que contienen el medio.
    6. Transfiera cada colonia recogida a un pocillo recubierto de matriz de membrana basal, tal como se prepara en el paso 5.3.1. Disociar las células en pequeños grupos usando una pipeta p1000, pipeteando las células 2-5x.
    7. Incubar la placa durante 30 min a 37 °C y 5% deCO2, permitiendo que los grumos se adhieran.
    8. Sustituir el medio por 750 μL de medio de cultivo PSC si se observan muchas células muertas flotantes; de lo contrario, añadir 250 μL de medio de cultivo PSC.
      NOTA: El reemplazo medio después de 30 minutos es crítico, especialmente para las líneas celulares inestables (por ejemplo, NHP).
    9. Colocar la placa a 37 °C y 5% deCO2 en una incubadora.
    10. Cambie el medio cada 2-3 días hasta que las colonias crezcan lo suficientemente grandes como para pasar. Para ello, siga la sección 4 del protocolo.

6. Congelación de células urinarias y CPS iPS para almacenamiento a largo plazo

NOTA: Rutinariamente, las iPSC se congelan como grupos en el medio de congelación celular sin contar. El pipeteo debe ser mínimo, para evitar la disociación en células individuales. Para las células urinarias, rutinariamente, 1.5 × 104 a 3 × 104 células se congelan por tubo, lo que permite al usuario descongelar un tubo directamente en un pocillo de una placa de 12 pocillos sin la necesidad de otro paso de conteo.

  1. Prepare 5 ml de DPBS en un tubo de 15 ml.
  2. Para la congelación de células urinarias, siga los pasos 2.2-2.4 del protocolo. Para la congelación de iPSCs, siga los pasos 5.1.2-5.1.5 del protocolo de paso de grupos.
  3. Transfiera la suspensión al tubo de 15 ml preparado en el paso 6.1. Para la congelación de células urinarias, contar 10 μL de la suspensión celular con un hemocitómetro. Centrifugar las células durante 5 min a 200 × g y aspirar el sobrenadante por completo.
  4. Resuspender el pellet celular en 400 μL de medio de congelación celular por tubo y distribuir las células a la cantidad deseada de criotubos.
  5. Transfiera los criotubos inmediatamente a -80 °C. Transfiera los tubos congelados a un congelador a -150 °C o nitrógeno líquido 1 día después de la congelación a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.

7. Descongelación de células urinarias e iPSCs

  1. Para la descongelación de las células urinarias, prepare la cantidad deseada de 12 pocillos recubiertos de gelatina, como se indica en el paso 1.1 del protocolo. Para las iPSC, preparar las placas de 12 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal, como se indica en el paso 5.1.1. En ambos casos, no intercambie la matriz con el medio.
  2. Prepare un tubo de 15 ml que contenga 4 ml de DPBS y guárdelo a 37 °C.
  3. Coloque un vial congelado de células rápidamente en un baño de agua a 37 °C para descongelar, hasta que se haga visible un trozo de hielo flotante.
    NOTA: Limpie el criotubo con etanol antes y después de la incubación en el baño de agua para evitar contaminaciones.
  4. Añadir 500 μL de medio REMC para células urinarias, o 500 μL de medio de cultivo PSC para iPSCs a la suspensión que contiene hielo, y transferir la suspensión inmediatamente al tubo precalentado de 15 ml preparado en el paso 7.2.
  5. Centrifugar el tubo a 200 × g durante 5 min, y desechar el sobrenadante por completo.
  6. Para las células urinarias, resuspender el pellet en 1 ml de medio REMC. Para las iPSC, resuspender cuidadosamente el pellet en 750 μL de medio de cultivo PSC. Evite pipetear demasiado, para mantener los grumos intactos.
    Opcional: Complementar el medio con 10 μM Y-27632 puede apoyar la supervivencia de las iPSCs después de la descongelación.
  7. Aspirar la matriz de las placas de 12 pocillos preparadas en el paso 7.1 y transferir cuidadosamente la suspensión celular al pozo.
  8. Colocar la placa durante la noche a 37 °C y 5% deCO2 en una incubadora.
  9. Al día siguiente, reemplace el medio con medio de cultivo PSC, sin Y-27632 para iPSCs y con REMC para células urinarias.
  10. Cultivar las células a 37 °C y 5% deCO2 en una incubadora.
  11. Cambie el medio cada 2-3 días hasta que las células crezcan lo suficientemente grandes como para pasar. Para un cambio medio, siga la sección 4 del protocolo.

8. Inmunocitoquímica

NOTA: La inmunotinción con anticuerpos dirigidos a marcadores relacionados con la pluripotencia como NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 y EpCAM es una de las validaciones más utilizadas de iPSCs recién generadas. Puede encontrar más información sobre los anticuerpos y diluciones en la Tabla de materiales.

  1. Placas iPSCs 1-3 días antes de su uso en un número apropiado de placas de 12 pocillos. Aspire el medio, lave las células agregando 500 μL de DPBS y retire el DPBS. Agregue 400 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) por pocillo y fije las células durante 15 minutos en RT.
  2. Retire el PFA al 4% y lave las células 3 veces con DPBS. Agregue 400 μL de tampón de bloqueo por pocillo e incube la placa durante 30 minutos a RT.
  3. Aspirar el tampón de bloqueo y añadir los anticuerpos diluidos en 400 μL de tampón de dilución de anticuerpos (ADB) a cada pocillo. Incubar la placa a 4 °C durante la noche.
  4. Retire el ADB que contiene los anticuerpos primarios y lave las células 3 veces con DPBS.
  5. Aspirar el DPBS y añadir 400 μL de anticuerpos secundarios diluidos en ADB por pocillo. Incubar la placa durante 1 h a RT en la oscuridad.
  6. Retire el ADB y lave las celdas 3 veces con DPBS. Añadir 1 μg/ml de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluido en DPBS por pocillo e incubar durante 3 min a RT.
  7. Aspire la solución DAPI y lave la celda 3 veces con DPBS. Agregue 500 μL de DPBS para obtener imágenes.

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Resultados

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Al aislar células de la orina humana y NHP, se pueden identificar diferentes tipos de células directamente después del aislamiento. Las células escamosas, así como varias células redondas más pequeñas, se excretan con la orina; la orina femenina contiene muchas más células escamosas que la orina masculina (Figura 1B - Día 0; Figura suplementaria S1). Después de 5 días de cultivo en medio urinario primario, se pueden ver las primeras células adherentes en proliferación (

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Discusión

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Las iPSC son tipos de células valiosas, ya que permiten la generación de tipos de células in vitro que de otro modo serían inaccesibles. Como los materiales de partida para la reprogramación, por ejemplo, los fibroblastos no están fácilmente disponibles de todas las especies de primates, este artículo presenta un protocolo para la generación de iPSCs a partir de células derivadas de la orina. Estas células se pueden obtener de manera no invasiva, incluso a partir de muestras de orina de primates no estériles, co...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por DFG EN 1093/5-1 (proyecto número 458247426). M.O. fue apoyado por JSPS Overseas Research Fellowship. Todas las figuras fueron creadas con BioRender.com. La citometría de flujo se realizó con la ayuda de la citometría de flujo de la instalación central en el Centro Biomédico de Munich. Nos gustaría agradecer a Makoto Shida y Tomoyo Muto de ASHBi, Universidad de Kyoto, por el apoyo a la videografía.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Accumax™ solución de desprendimiento de células (Solución de desprendimiento)Sigma-AldrichSCR006
Anfotericina B-SolutionMerckA2941-100ML
Anticuerpo de ratón antihumano TRA-1-60 Stem Cell Technologies60064Dilución: 1/200
Anticuerpo conjugado TRA-1-60 PE antihumano  Miltenyi Biotec130-122-965Dilución: 1/50
Bambanker™ (Medio de congelación de células)Nippon GeneticsBB01
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA3059-100G
Placa multipocillo para cultivo celular, 12 pocillos CELLSTARGreiner BIO-ONE665180
Countess™ II contador de células automatizadoThermo Fisher Scientific AMQAX1000
CryoKing&1.5 mL Tubos con código de barras 2D (Cryotubes)Sued-Laborbedarf52 95-0213Se pueden utilizar diferentes tipos de criotubos para la congelación. Los tubos de código de barras 2D tienen la ventaja de que la información de la muestra se puede almacenar en una base de datos con información única del tubo.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)Thermo Fisher ScientificA16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)Thermo Fisher ScientificA16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-fenilindol diclorhidratoSigma-Aldrich10236276001
DMEM High GlucosaTH. GeyerL0102
DMEM/F12 con L-glutaminaFisher Scientific15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor™ 488Thermo Fisher ScientificA-21202Dilución: 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor™ 594Thermo Fisher ScientificA-21207Dilución: 1/500
DPBS sin Calcio sin MagnesioTH. GeyerL0615-500
EpCAM Anticuerpo policlonal recombinante para conejos (22 HCLC)Thermo Fisher Scientific710524Dilución: 1/500
Ácido etilendiaminérgico tetraacético (EDTA)Carl RothCN06.3
Falcon Tube 15 mL fondo cónicoGreiner BIO-ONE188271-N
Falcon Tube 50 mL fondo cónicoGreiner BIO-ONE227261
Suero fetal bovino, calificado, inactivado por calor, Brasil (FBS)Thermo Fisher Scientific10500064
FlowJo V10.8.2FlowJo 
Gelatina de piel porcinaSigma-AldrichG1890-1KG
Geltrex™ Matriz de membrana basal sin LDEV, con calificación hESC, factor de crecimiento reducido ThermoFisher ScientificA1413301
GlutaMAX™ SuplementoThermo Fisher Scientific35050038
Heracell™ 240i incubadora de CO2Fisher Scientific16416639
Heraeus HeraSafe armario de seguridadKendro51017905
Human EGF, de primera calidadMiltenyi Biotec130-097-749
ImageJ FijiVersión 2.9.0
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X)Thermo Fisher Scientific 11140035
Tubo de microcentrifugación PP, 1,5 mLMicroscopio Nerbe Plus04-212-1000
Nikon eclipse TE2000-SNikonTE2000-S
Anticuerpo anti-alfa-fetoproteína de ratónR& D SystemsMAB1368Dilución: 1/100
Anticuerpo de actina anti-alfa-músculo liso de ratónR& D SystemsMAB1420 Dilución: 1/100
Anticuerpo de tubulina anti-beta-III de ratónR& D SystemsMAB1195 Dilución: 1/100
mTeSR™ 1STEMCELL Technolgies85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb Tecnología de señalización celular4903SDilución: 1/400
normocure™ (Reactivo antimicrobiano)Invivogenant-noc
Oct-4 Anticuerpo de conejo  Tecnología de señalización celular2750SDilución: 1/400
Paraformaldehído (PFA)Sigma-Aldrich441244-1KG
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml) (PS)Thermo Fisher Scientific15140122contiene 100 U/mL de penicilina y 100 µ g/mL de estreptomicina.
FGF humano recombinante-básicoPeproTech100-18B
PDGF-AB humano recombinantePeproTech100-00AB
Centrífuga de sobremesa refrigeradaSIGMA 4-16KS
renalesATCCPCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) mAb de ratón #4900Tecnología de señalización celular4900SDilución: 1/400
SSEA4 (MC813) mAb de ratónNEB4755SDilución: 1/500
Basic02Nippon Genetics3821.00La producción de este medio se suspendió, utilizando StemFit Basic04CT para líneas celulares humanas o StemFit Basic03 para primates no humanos en su lugar.
Tritón X-100 Sigma-AldrichT8787-50ML
TrypLE™ Seleccione Enzima (1x), sin rojo de fenol (Enzima de disociación)Thermo Fisher Scientific12563011
Waterbath Precision GP 05Thermo Fisher ScientificTSGP05
Y-27632, Sal de diclorhidrato (Inhibidor de roca)BiozolBYT-ORB153635
TampónPara la composición, consulte el suplemento tabla S1
TampónPara la composición, véase la tabla complementaria S1
REMCPara la composición, véase la tabla complementaria S1
Medio urinario primarioPara la composición, véase la tabla complementaria S1
cultivoPara la composición, véase la tabla complementaria S1
generación PSCPara la composición, véase la tabla complementaria S1
Tampónde orina Para conocer la composición, véase la tabla complementaria S1
663441La mezcla de penicilina-estreptomicina Medio basal de células epiteliales renales ATCC PCS-400-030 Kit de crecimiento de células epiteliales StemFit® de dilución de anticuerpos de bloqueo Medio Medio de PSC Medio de de lavado

Referencias

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