Los modelos de ratón pueden ser herramientas útiles para investigar la biología del epitelio pigmentado de la retina (EPR). Se ha establecido que los ratones pueden desarrollar una serie de patologías del EPR. Aquí, describimos un protocolo de fenotipado para dilucidar y cuantificar patologías de EPR en ratones utilizando luz, electrones de transmisión y microscopía confocal.
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Artículo de método
Un protocolo para evaluar y cuantificar patologías del epitelio pigmentado retiniano en modelos murinos de degeneración macular relacionada con la edad
En este artículo
Resumen
Resumen
La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) es un trastorno retiniano debilitante en las poblaciones que envejecen. Se cree ampliamente que la disfunción del epitelio pigmentado de la retina (EPR) es un evento patobiológico clave en la DMAE. Para comprender los mecanismos que conducen a la disfunción del EPR, los investigadores pueden utilizar modelos de ratón. Se ha establecido por estudios previos que los ratones pueden desarrollar patologías del EPR, algunas de las cuales se observan en los ojos de individuos diagnosticados con DMAE. Aquí, describimos un protocolo de fenotipado para evaluar patologías de EPR en ratones. Este protocolo incluye la preparación y evaluación de cortes transversales retinianos mediante microscopía óptica y microscopía electrónica de transmisión, así como la de montajes planos RPE por microscopía confocal. Detallamos los tipos comunes de patologías murinas del EPR observadas por estas técnicas y las formas de cuantificarlas a través de métodos imparciales para las pruebas estadísticas. Como prueba de concepto, utilizamos este protocolo de fenotipado de EPR para cuantificar las patologías del EPR observadas en ratones que sobreexpresan la proteína transmembrana 135 (Tmem135) y ratones envejecidos C57BL / 6J de tipo salvaje. El objetivo principal de este protocolo es presentar métodos estándar de fenotipado de EPR con evaluaciones cuantitativas imparciales para científicos que utilizan modelos de ratón de DMAE.
Introducción
La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es una enfermedad ceguera común que afecta a poblaciones mayores de 55 años1. Muchos investigadores creen que la disfunción dentro del epitelio pigmentado de la retina (EPR) es un evento patobiológico temprano y crucial en la DMAE2. El EPR es una monocapa de células polarizadas encargadas de mantener la homeostasis de los fotorreceptores vecinos y los vasos sanguíneos coroideos3. Existe una variedad de modelos para investigar los mecanismos asociados a la enfermedad dentro del EPR, incluidos los modelos de cultivo celular
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Protocolo
Todos los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Wisconsin-Madison, y cumplen con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión.
1. Evaluación del EPR del ratón mediante microscopía óptica
- Haga un tampón fijador que tenga una concentración final de 2% de paraformaldehído y 2% de glutaraldehído a temperatura ambiente (RT) en una botella de vidrio.
NOTA: Este protocolo requiere, como máximo, 14 ml de ta....
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Resultados
La finalización del protocolo de fenotipado del EPR descrito en este artículo proporciona un análisis cuantitativo de las anomalías estructurales del EPR comúnmente observadas en modelos de ratón de DMAE. Para confirmar la efectividad de este protocolo, lo utilizamos en ratones que se sabe que presentan patologías del EPR, incluidos los ratones transgénicos que sobreexpresan WT Tmem135 impulsado por el promotor de beta-actina de pollo (Tmem135 TG)30 y ratones C57BL / 6J envejecidos
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Discusión
En este artículo, presentamos un protocolo de fenotipado para evaluar las patologías estructurales del EPR de modelos de ratón. Describimos los pasos necesarios para procesar los ojos para diversas técnicas de imagen, incluida la luz, el electrón de transmisión y la microscopía confocal, así como la cuantificación de patologías típicas observadas a través de estos métodos de imagen. Demostramos la efectividad de nuestro protocolo de fenotipado de EPR examinando ratones Tmem135 TG y WT de 24 meses de eda.......
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Divulgaciones
Los autores de este protocolo no tienen divulgaciones ni conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Satoshi Kinoshita y al laboratorio de Iniciativas de Investigación Traslacional en Patología (TRIP) de la Universidad de Wisconsin (UW) por preparar nuestros tejidos para la microscopía óptica. Este núcleo cuenta con el apoyo del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad de Wisconsin, el Centro de Cáncer Carbone de la Universidad de Wisconsin (P30 CA014520) y la Oficina del Director de los NIH (S10OD023526). La microscopía confocal se realizó en el Núcleo Óptico de Bioquímica de la UW, que se estableció con el apoyo del Departamento de Dotación de Bioquímica de la UW. Este trabajo también fue apoyado por subve....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,1 M Tampón de cacodilato pH7.2 | PolyScientiifc R& D Company | S1619 | |
| deslizante de 100 capacidades | Se necesitan dos para este protocolo (uno para H& Portaobjetos teñidos con E y uno para montajes planos RPE). | ||
| 100% Etanol | MDS Warehouse | 2292-CASE | Se puede utilizar para hacer soluciones de etanol diluido en este protocolo. |
| Llave de paso de 1 vía, 2 cerraduras Luer hembra | Qosina | 11069 | |
| 1x Solución tampón de fosfato (PBS) | Prefabricada 1x PBS se puede utilizar en este protocolo. | ||
| Microtubos de 2,0 mL Genesee | Scientific | 24-283-LR | |
| 24 Cápsula de inclusión de cavidad Sustituto de molde | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 70165 | |
| Tubo de PVC de 24 pulgadas con extremos Luer | Fisher Scientific | NC1376778 | |
| 400 Dorador de malla 400 Barra delgada Rejillas de malla cuadrada | Ciencias de la microscopía electrónica | T400-Cu | |
| Etanol al 95% | Almacén MDS | 2293-CASE | |
| Almohadillas absorbentes con barrera contra la humedad impermeable (23 pulgadas por 24 pulgadas) | VWR | 56616-031 | |
| Ajustable 237 ml Botella de spray | VWR | 23609-182 | |
| Alexa Fluor488 Burro conjugado anti-conejo IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Papel de aluminio | |||
| BD Deslizamiento de precisión Aguja de jeringa de calibre 19 | Sigma-Aldrich | ||
| Pinzas de helecho; Curvo; dentado cruzado fino; 4" de largo, 1 mm de ancho de punta | Roboz Surgical Instrument | RS-5211 | Conocidos como pinzas curvas en este protocolo. |
| Pincel de pelo de camello | Ciencias de la microscopía electrónica 65575-02 | ||
| eutanasia de dióxido | |||
| de carbono Medidor | |||
| de carbono Tanque | |||
| Abrazaderas de extensión de punta Castaloy | Fisher Scientific | 05-769-7Q | |
| Soporte de base en forma de L de hierro fundido | Fisher Scientific | 11-474-207 | |
| Programa | Disponible para descargar: https://cellprofiler.org/releases | ||
| Esmalte de uñas transparente | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 72180 | |
| Colorfrost Portaobjetos de Microscopio Lavanda | VWR | 10118-956 | |
| Ordenador | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | |
| destilada H20 | del sistema de purificación Milli-Q. | ||
| Pinzas de punta fina Dumont; Patrón #55 | Instrumento quirúrgico | Roboz RS-4984 | Conocido como pinzas de punta fina en este protocolo, y se necesitan 3 para este protocolo (dos para disecciones y una para el procesamiento con microscopio electrónico). |
| Soporte de rejilla para microscopía electrónica | Ciencias de la microscopía electrónica | 71147-01 | |
| EPON 815 Ciencias | de la microscopía electrónica de | 14910 | |
| Epredia Mark-It Marcaje de tejidos Tinte amarillo | Fisher Scientific | 22050460 | Siga el protocolo del fabricante cuando utilice este tinte para marcar tejidos. |
| Medios de montaje Epredia | Fisher Scientific | 22-110-610 | Uso para el montaje de H& Diapositivas E. |
| Serie de iluminadores Fiber-Lite Mi-150, fuente de luz halógena de 150 w | Dolan-Jenner Industries | Mi-150 | Fuente de luz para microscopio de disección. |
| Fiji ImageJ | Disponible para descargar: https://imagej.net/downloads | ||
| Flexaframe Castaloy Hook Connector | Thermo Scientific | 14-666-18Q | |
| extractora | |||
| Glutaraldehído 2,5% en tampón de fosfato, pH 7,4, 32% | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 16537-05 | |
| JEM-1400 Microscopio electrónico de transmisión (JEOL) con cámara CCD | |||
| Agitador | de laboratorio de sobremesaSe necesitan dos para estos experimentos. Uno debe estar a temperatura ambiente, mientras que el otro debe estar en una cámara frigorífica de 4 grados centígrados. | ||
| Etiquetas de etiquetas criogénicas | Ciencias de la microscopía electrónica | 77564-05 | |
| Citrato | de plomo Ciencias de la microscopía electrónica | 17800 | |
| Leica EM UC7Ultramicrotomo | |||
| Leica Reichert Ultracut S Elevador de micrótomoSlips | |||
| Thermo Fisher Scientific | 22X22I24788001LS | Utilice estos cubreobjetos para los montajes planos del RPE, ya que tienen bordes elevados y se adaptan al grosor del RPE. | |
| Hematoxilina de Mayer | VWR | 100504-406 | |
| McPherson-Vannas Micro Tijeras de disección | Roboz Instrumento quirúrgico | RS-5600 | Conocidas como tijeras de microdisección en protocolo. |
| Metanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Ratones | Cualquier modelo de ratón AMD y sus respectivos controles pueden funcionar para este protocolo. | ||
| Micro tijeras de disección; Versión estándar; Curvo; Puntas afiladas; Longitud de la hoja de 24 mm; Longitud total de 4.5" | Instrumento quirúrgico Roboz | RS-5913 | Conocidos como tijeras curvas en este protocolo. |
| Microsoft Excel | |||
| Bastidores de microtubos Nikon | |||
| A1RS Microscopio | |||
| Suero de burro normal | SouthernBiotech | 0030-01 | |
| Número 11 Hojas de bisturí desechables estériles | VWR | 21909-380 | |
| Tetróxido de osmio | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 19150 | |
| Paraformaldehído, 32% | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 15714-S | |
| Lápiz | |||
| Placa de Petri | VWR | 21909-380 | |
| Puntas | |||
| Pipetas | |||
| Anticuerpo policlonal anti-ZO-1 | Thermo Fisher Scientific | 402200 | |
| Óxido de propileno | Microscopía electrónica Sciences | 20412 | |
| Hoja de afeitar | VWR | 10040-386 | |
| Bandeja poco profunda para perfusiones de | |||
| Shandon Eosin y Alcohol | VWR | 89370-828 | |
| Sharpie Ultra Fine Tip Black | Permanent Marker Staples | 642736 | |
| Slide Rack para teñir | Grainger | 49WF31 | |
| Cubreobjetos de vidrio cuadrados | Fisher Scientific | 12-541B | |
| Plato de tinción con tapa | Grainger | 49WF30 | Need 15 para H& E Procedimiento de tinción. |
| Jeringa Luer-Slip desechable de 50 ml totalmente plástica de Target | Thermo Scientific | S7510-50 | Utilice únicamente el cilindro de la jeringa. |
| Temporizador | Fisher | 1464917 | |
| Acetato de uranilo | Ciencias de la microscopía electrónica | 22400 | |
| Horno | |||
| Vectashield Medio | de montaje Laboratorios de vectores H-1000 | Uso para el montaje de montajes planos RPE. | |
| Xileno | Fisher Scientific | ||
| Zeiss Axio Imager 2 | Este microscopio tiene la capacidad de generar imágenes cosidas de 20x. Si un microscopio óptico no tiene esta capacidad, tome imágenes de toda la retina que se superpongan ligeramente entre sí. Usa Adobe Photoshop para unir estas imágenes. Consulte los manuales del programa Adobe Photoshop para la unión de imágenes. | ||
| Zeiss Stemi 2000 Microscopio de disección | Ciencias de la microscopía electrónica | 65575-02 |
Referencias
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
- Bhutto, I., Lutty, G.
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Reimpresiones y permisos
