Este informe proporciona un nuevo procedimiento de preparación de muestras para visualizar las uniones neuromusculares en larvas de Drosophila . Este método es más eficaz para evitar el enroscamiento de las muestras en comparación con el método tradicional y es particularmente útil para el análisis ultraestructural de la unión neuromuscular de Drosophila .
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Artículo de método
Optimización del proceso de preparación de muestras para la microscopía electrónica de transmisión de uniones neuromusculares en larvas de Drosophila
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Resumen
Resumen
La unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) se ha convertido en un valioso sistema modelo en el campo de la neurociencia. La aplicación de la microscopía confocal en el NMJ de Drosophila permite a los investigadores adquirir información sináptica, que abarca tanto datos cuantitativos sobre la abundancia de sinapsis como información detallada sobre su morfología. Sin embargo, la distribución difusa y el alcance visual limitado del TEM presentan desafíos para el análisis ultraestructural. Este estudio presenta un método innovador y eficiente de preparación de muestras que supera el enfoque convencional. El procedimiento comienza colocando una malla metálica en la base de una botella de fondo plano o tubo de ensayo, seguido de la colocación de muestras de larvas fijas en la malla. Se coloca una malla adicional sobre las muestras, asegurando que estén colocadas entre las dos mallas. Las muestras fijas se deshidratan completamente y se infiltran antes de continuar con el procedimiento de incrustación. Luego, la incrustación de las muestras en resina epoxi se realiza en forma de lámina plana, lo que permite la preparación de los músculos para el posicionamiento y la sección. Beneficiándose de estos pasos, todos los músculos de las larvas de Drosophila pueden visualizarse bajo microscopía óptica, lo que facilita su posterior posicionamiento y seccionamiento. El exceso de resina se elimina después de localizar los músculos6º y7º de los segmentos corporalesA2 yA3. Se realiza un corte ultrafino en serie del6º o7º músculo.
Introducción
La microscopía electrónica es uno de los métodos más idóneos para estudiar la ultraestructura de materiales biológicos que puede demostrar de forma visual y precisa la estructura interna de las células a nivel nanométrico1. Sin embargo, debido a la complejidad del proceso de preparación de muestras y al alto costo, la microscopía electrónica no es tan popular como la microscopía óptica. Los avances recientes en las técnicas de microscopía electrónica han dado lugar a mejoras significativas en la calidad de las imágenes, coincidiendo con una notable reducción de la carga de trabajo asociada. En consecuencia, la microscopía electrónica ha asumido un papel importante en el avance del conocimiento científico en diversos campos2.
Drosophila es un excelente modelo animal para realizar manipulaciones genéticas con el fin de controlar con precisión la expresión espacial y temporal de los genes diana3. Además, Drosophila tiene las ventajas de un período de crecimiento corto y una crianza fácil en comparación con los modelos de mamíferos; por lo tanto, Drosophila es ampliamente utilizada en la investigación de morfología 4,5.
En las larvas de Drosophila, los botones de la unión neuromuscular (NMJ) están ampliamente distribuidos en los músculos 6,7, y la inmunotinción de NMJ puede proporcionar fácilmente información sobre la cantidad y morfología de la sinapsis 8,9 . Los botones NMJ ubicados en los músculos6º/7º de los segmentos A2 y A3 son muy adecuados para la investigación cuantitativa y morfológica mediante microscopía óptica. Esto se debe a su tamaño y abundancia10,11. Por lo tanto, las larvas de Drosophila NMJs se consideran un modelo útil para la investigación en neurociencia12.
Sin embargo, es un desafío observar la ultraestructura del bautista NMJ por el TEM. Dado que la ventana de barrido de la microscopía electrónica de transmisión es estrecha, es difícil posicionar los botones NMJ13 ampliamente distribuidos. La otra razón es que la pared corporal de Drosophila es susceptible de enroscarse durante la etapa de deshidratación alcohólica del protocolo de preparación de muestras7.
Los estudios tradicionales han escogido generalmente botones entre los músculos6º y7º de los segmentosA2 yA3 como material de muestra debido a su abundancia y tamaño14,15. Los músculos6º y7º de los segmentosA2 yA3 son más grandes que los otros músculos y contienen más botones. Sin embargo, cuando las muestras se prepararon para microscopía electrónica, las muestras fijas tendían a volverse delgadas y propensas a curvarse, lo que conducía a un posicionamiento incorrecto de los músculos6º y7º de los segmentos A2 y A3.
Presentamos un nuevo procedimiento de procesamiento que es más efectivo para prevenir el enroscamiento de las muestras en comparación con el método tradicional de preparación de muestras 7,16, al permitir que las muestras permanezcan planas durante la deshidratación posterior, lo que facilita un mejor posicionamiento de las uniones neuromusculares de las larvas de Drosophila.
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Protocolo
NOTA: El método de preparación de muestras de microscopía electrónica de transmisión utilizado en este artículo ha sido reportado anteriormente16. Es importante tener en cuenta que la selección de reactivos y el ajuste de la dosis son necesarios en función de la muestra. Hay muchos reactivos químicos tóxicos utilizados en el proceso de preparación de muestras, por lo tanto, el operador debe tomar ciertas medidas de protección, como usar ropa y guantes protectores y operar en una campana extractora.
1. Procedimiento de disección, fijación y colocación
- Disección
- Diseccionar las larvas errantes del tercer estadio tardío en solución de Jan y obtener toda la pared corporal según los procedimientos estándar17. Prepare la solución de Jan de la siguiente manera: 128 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 4 mM de MgCl2, 35 mM de sacarosa, 5 mM de HEPES, pH 7,4
NOTA: La pared corporal de las larvas de Drosophila se refiere a la cubierta exterior o tegumento de la etapa larvaria de la mosca de la fruta Drosophila. Esto incluye la cutícula, las células epidérmicas y los tejidos subyacentes que forman el exoesqueleto larval. La pared del cuerpo proporciona soporte estructural y protección y sirve como barrera entre el cuerpo de la larva y el ambiente externo17.
- Diseccionar las larvas errantes del tercer estadio tardío en solución de Jan y obtener toda la pared corporal según los procedimientos estándar17. Prepare la solución de Jan de la siguiente manera: 128 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 4 mM de MgCl2, 35 mM de sacarosa, 5 mM de HEPES, pH 7,4
- Fijación
- Fije la pared del cuerpo larvario en la cámara de disección a 4 °C durante la noche con el fijador. Para preparar el fijador, mezcle un 2% de glutaraldehído y un 2% de formaldehído en un tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4)
- Enjuague las muestras varias veces con tampón de cacodilato de sodio.
- Preparar 1% de OsO4 en tampón de cacodilato. Fijar las muestras en OsO4 al 1% durante 2 h, seguido de varios enjuagues en agua destilada.
NOTA: La doble fijación con aldehídos y OsO4 proporciona una mejor protección de la ultraestructura celular. Además, OsO4 puede manchar el tejido de la muestra, permitiendo que el contraste entre la luz y la muestra sea más evidente18. - Teñir las muestras de la unión neuromuscular de Drosophila con acetato de uranilo saturado al 2% durante 2 h, seguido de varios enjuagues con agua desionizada (Figura 1A).
- Colocación de muestras
- Corta dos piezas redondas de malla metálica de tamaño similar (tamaño de poro 270 μm) con unas tijeras.
- Coloque una malla metálica (270 μm) en la base de una botella de fondo plano con anticipación.
- Coloque las muestras de larvas fijadas en la malla y luego coloque otra malla sobre ellas para que las muestras se coloquen entre las dos mallas.
2. Deshidratación
NOTA En este trabajo se utilizó el método de deshidratación en gradiente eténol.
- Deshidratar las muestras en un gradiente de concentración creciente de etanol secuencialmente (50%, 70%, 85%, 95% una vez cada una, 100% dos veces), cada una durante 20 min a 4 °C.
- Enjuague las muestras dos veces con óxido de propileno a temperatura ambiente durante 5 minutos cada vez (Figura 1C).
3. Infiltración
NOTA: La infiltración es uno de los pasos necesarios para la preparación de la muestra TEM. La infiltración permite el reemplazo gradual del medio de deshidratación con el medio de inclusión en la muestra para permitir el llenado del intersticio celular con el medio de inclusión19.
- Coloque las muestras en la solución mezclada de óxido de propileno y resina epoxi en una proporción de 1:1 y 1:2 durante 1 h cada una, seguidas de resina epoxi pura durante 2 h a temperatura ambiente.
4. Incrustación
- Prepara una película de polietileno y córtala en un cuadrado grande (aproximadamente 5 × 5 cm) y un pequeño soporte rectangular hueco (aproximadamente 2 × 2 cm). Pega el cuadrado pequeño con el cuadrado grande.
- Precoloca suficiente resina epoxi en el centro del cuadrado grande.
- Coloque las muestras en la resina epoxi precolocada con el lado del músculo hacia arriba. Usa un estereoscopio.
- Agregue varias gotas de resina a las muestras y luego cúbralas con una película de PE (un poco más grande que el espaciador) (Figura 1D-E).
- Polimerizar las muestras a 37 °C, 42 °C y 60 °C durante 24 h respectivamente (Figura 1F).
5. Procedimiento de seccionamiento
- Retire las partes sobrantes de la pared del cuerpo larvario con una cuchilla afilada y conserve un trapecio, incluido el segmento A2/A3 .
NOTA: La línea superior debe estar cerca delmúsculo 13 y la línea de base debe estar lejos de la muestra hacia la resina epoxi. La altura entre la línea superior y la línea de base es de aproximadamente 5-8 mm. - Retire el trapezoide del resto de la muestra y adhiéralo a la cápsula rellena de resina con el pegamento A/B.
- Confirme la posición de los músculos6º y7º de los segmentosA2 yA3 bajo el microscopio óptico (Figura 1G) y mantenga el plano tangente paralelo al6º músculo.
- Corte una quinta parte de la muestra a lo largo de los dos lados del segmento A3 .
NOTA: Retire la mayor parte del6º músculo y conserve 1/3 del ancho del7º músculo. - Usando un micrótomo ultrafino, prepare una sección ultradelgada de la muestra comenzando con el6º músculo.
NOTA: Cada rebanada tiene un grosor aproximado de 90 nm. - Fije tantas rodajas como sea posible a cada malla de cobre.
- Realizar microscopía electrónica de transmisión como se ha descrito anteriormente16.
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Resultados
La pared del cuerpo de la larva de Drosophila está compuesta por 30 fibras musculares identificables dispuestas en un patrón regular y se ve como una rebanada delgada después de la disección y fijación21 (Figura 1A). La muestra permanece plana durante el proceso de deshidratación debido a la presencia de las mallas metálicas (Figura 1B, C). El músculo del cuerpo de la larva se entierra en una placa delgada hecha ...
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Discusión
Las muestras de larvas de Drosophila tienden a enroscarse durante la deshidratación, ya que las muestras son delgadas, lo que dificulta la localización precisa de la unión neuromuscular, lo que aumenta la dificultad y la carga de trabajo para la preparación de la muestra. La mejora tradicional consiste en acortar la muestra7, pero las muestras seguían estando curvadas en diferentes grados.
En nuestro método, hay dos pasos críticos: primero, las muestras permane...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de China Grant 32070811 y el Fondo de Pruebas de Análisis de la Universidad del Sureste (China) 11240090971. Agradecemos al Laboratorio de Microscopía Electrónica y Centro de Análisis Morfológico de la Facultad de Medicina de la Universidad del Sureste, Nanjing, China.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,2-epoxipropano | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Agente penetrante |
| Drosophila Stocks Bloomington | ninguno | Las cepas de Drosophila de control de tipo salvaje utilizadas en esta investigación fueron todas W1118, y se criaron de acuerdo con métodos de cultivo estándar | |
| Tubos de ensayo de vidrio de fondo plano | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | ninguno | Tubos de ensayo de vidrio de fondo plano (botella) con tapón de esponja (o tapón de botella) |
| K4M reticulante | Agar Scientific | Cat# 1924B | Las resinas de incrustación se basan en una fórmula de acrilato y metacrilato altamente reticulado |
| Resina K4M (monómero B) | Agar Scientific | Lot # 631557 | Monómero de resina |
| Película de polivinilo | Haimen Chenxing Equipo experimental Compañía | none | La película de polietileno transparente es la mejor, espesor de aproximadamente 0,2 mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Anhídrido succínico dodecenil |
| SPI-Chem DMP-30 Epoxi | SPI | 02823-DA | Acelerador |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Endurecedor para epoxi |
| SPI-PON 812 Epoxi | SPI SPI#0259-AB | Monómero | |
| de resinaMalla de acero | Tienda de jardinería Yuhuiyuan (en línea) | ninguno | Red de cobre o acero inoxidable |
| Microscopía electrónica de transmisión | Hitachi H-7650 | 11416692 | Todas las rejillas (en las que se recolectaron muestras) se tiñeron con citrato de plomo y se observaron bajo una microscopía electrónica de transmisión. |
| Microtomo ultrafino | Leica UC7 micrótomo ultrafino 595915 | Todas las operaciones de corte se realizan en un micrótomo ultrafino Leica UC7 utilizando un cuchillo de diamante |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan
