Optimización del proceso de preparación de muestras para la microscopía electrónica de transmisión de uniones neuromusculares en larvas de Drosophila

Summary

Este informe proporciona un nuevo procedimiento de preparación de muestras para visualizar las uniones neuromusculares en larvas de Drosophila . Este método es más eficaz para evitar el enroscamiento de las muestras en comparación con el método tradicional y es particularmente útil para el análisis ultraestructural de la unión neuromuscular de Drosophila .

Abstract

La unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) se ha convertido en un valioso sistema modelo en el campo de la neurociencia. La aplicación de la microscopía confocal en el NMJ de Drosophila permite a los investigadores adquirir información sináptica, que abarca tanto datos cuantitativos sobre la abundancia de sinapsis como información detallada sobre su morfología. Sin embargo, la distribución difusa y el alcance visual limitado del TEM presentan desafíos para el análisis ultraestructural. Este estudio presenta un método innovador y eficiente de preparación de muestras que supera el enfoque convencional. El procedimiento comienza colocando una malla metálica en la base de una botella de fondo plano o tubo de ensayo, seguido de la colocación de muestras de larvas fijas en la malla. Se coloca una malla adicional sobre las muestras, asegurando que estén colocadas entre las dos mallas. Las muestras fijas se deshidratan completamente y se infiltran antes de continuar con el procedimiento de incrustación. Luego, la incrustación de las muestras en resina epoxi se realiza en forma de lámina plana, lo que permite la preparación de los músculos para el posicionamiento y la sección. Beneficiándose de estos pasos, todos los músculos de las larvas de Drosophila pueden visualizarse bajo microscopía óptica, lo que facilita su posterior posicionamiento y seccionamiento. El exceso de resina se elimina después de localizar los músculos^6º y^7º de los segmentos corporales_A2 y_A3. Se realiza un corte ultrafino en serie del^6º o^7º músculo.

Introduction

La microscopía electrónica es uno de los métodos más idóneos para estudiar la ultraestructura de materiales biológicos que puede demostrar de forma visual y precisa la estructura interna de las células a nivel nanométrico¹. Sin embargo, debido a la complejidad del proceso de preparación de muestras y al alto costo, la microscopía electrónica no es tan popular como la microscopía óptica. Los avances recientes en las técnicas de microscopía electrónica han dado lugar a mejoras significativas en la calidad de las imágenes, coincidiendo con una notable reducción de la carga de trabajo asociada. En consecuencia, la microscopía electrónica ha asumido....

Protocol

NOTA: El método de preparación de muestras de microscopía electrónica de transmisión utilizado en este artículo ha sido reportado anteriormente¹⁶. Es importante tener en cuenta que la selección de reactivos y el ajuste de la dosis son necesarios en función de la muestra. Hay muchos reactivos químicos tóxicos utilizados en el proceso de preparación de muestras, por lo tanto, el operador debe tomar ciertas medidas de protección, como usar ropa y guantes protectores y operar en una campana extractora.

1. Procedimiento de disección, fijación y colocación

1. Disección
   1. Diseccionar las larvas ....

Results

La pared del cuerpo de la larva de Drosophila está compuesta por 30 fibras musculares identificables dispuestas en un patrón regular y se ve como una rebanada delgada después de la disección y fijación²¹ (Figura 1A). La muestra permanece plana durante el proceso de deshidratación debido a la presencia de las mallas metálicas (Figura 1B, C). El músculo del cuerpo de la larva se entierra en una placa delgada hecha .......

Discussion

Las muestras de larvas de Drosophila tienden a enroscarse durante la deshidratación, ya que las muestras son delgadas, lo que dificulta la localización precisa de la unión neuromuscular, lo que aumenta la dificultad y la carga de trabajo para la preparación de la muestra. La mejora tradicional consiste en acortar la muestra⁷, pero las muestras seguían estando curvadas en diferentes grados.

En nuestro método, hay dos pasos críticos: primero, las muestras permane.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-epoxipropano	SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD	JYJ 037-2015	Agente penetrante
Drosophila Stocks Bloomington		ninguno	Las cepas de Drosophila de control de tipo salvaje utilizadas en esta investigación fueron todas W1118, y se criaron de acuerdo con métodos de cultivo estándar
Tubos de ensayo de vidrio de fondo plano	Haimen Chenxing Experimental equipment Company	ninguno	Tubos de ensayo de vidrio de fondo plano (botella) con tapón de esponja (o tapón de botella)
K4M reticulante	Agar Scientific	Cat# 1924B	Las resinas de incrustación se basan en una fórmula de acrilato y metacrilato altamente reticulado
Resina K4M (monómero B)	Agar Scientific	Lot # 631557	Monómero de resina
Película de polivinilo	Haimen Chenxing Equipo experimental Compañía	none	La película de polietileno transparente es la mejor, espesor de aproximadamente 0,2 mm
SPI Chem DDSA	SPI	SpI#02827-AF	Anhídrido succínico dodecenil
SPI-Chem DMP-30 Epoxi	SPI	02823-DA	Acelerador
SPI-Chem NMA	SPI	SpI#02828-AF	Endurecedor para epoxi
SPI-PON 812 Epoxi		SPI SPI#0259-AB	Monómero
de resinaMalla de acero	Tienda de jardinería Yuhuiyuan (en línea)	ninguno	Red de cobre o acero inoxidable
Microscopía electrónica de transmisión	Hitachi H-7650	11416692	Todas las rejillas (en las que se recolectaron muestras) se tiñeron con citrato de plomo y se observaron bajo una microscopía electrónica de transmisión.
Microtomo ultrafino	Leica UC7 micrótomo ultrafino 595915		Todas las operaciones de corte se realizan en un micrótomo ultrafino Leica UC7 utilizando un cuchillo de diamante