Artículo de método

Comprender el impacto de los bacteriófagos templados en sus lisógenos a través de la transcriptómica

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DOI:

10.3791/64945

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5 de enero de 2024

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1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences (IVES), University of Liverpool, 2School of Science, Engineering, and Environment, University of Salford

En este artículo

Resumen

Este protocolo permite revelar el impacto de los profagos en sus anfitriones. Los cultivos bacterianos se sincronizan utilizando las condiciones que mejor apoyan el estado lisogénico, limitando la inducción espontánea. La RT-qPCR distingue inequívocamente los genes restringidos por profagos y los desacoplados del control de fagos de los que se expresan durante el ciclo de replicación lítica.

Resumen

Los fagos templados se encuentran integrados como profagos en la mayoría de los genomas bacterianos. Algunos profagos son crípticos y están fijados en el cromosoma bacteriano, pero otros son activos y pueden desencadenarse en una forma replicativa, ya sea espontáneamente o por exposición a factores inductores. Los profagos se asocian comúnmente con la capacidad de conferir la producción de toxinas u otros rasgos asociados a la virulencia en su célula huésped. Estudios más recientes han demostrado que pueden desempeñar un papel mucho más importante en la alteración de la fisiología de sus huéspedes. La técnica aquí descrita nos ha permitido investigar cómo afectan los profagos a la expresión génica en la bacteria oportunista Pseudomonas aeruginosa.

En este trabajo, se comparó el crecimiento de la cepa silvestre de P. aeruginosa PAO1 con el de lisógenos isogénicos portadores de diferentes combinaciones de profagos de la cepa epidémica de Liverpool (LES) LESB58. En un cultivo de lisógenos, una proporción de células bacterianas apoyará la replicación de bacteriófagos líticos (inducción espontánea) con un alto nivel de expresión por célula de genes de fagos tardíos, como los asociados con el ensamblaje de partículas de fagos, enmascarando así el bajo nivel de expresión génica asociada con la expresión génica restringida por lisógenos. Por lo tanto, el impacto de la inducción espontánea puede oscurecer la expresión génica de los profagos en una población de lisógenos.

Se utilizaron experimentos de perfiles de crecimiento para identificar la inducción espontánea, que fue mínima durante la fase temprana de crecimiento exponencial. Este estudio informa sobre cómo preparar cultivos de muestra durante la fase temprana de crecimiento exponencial y cómo establecer controles adecuados a pesar del bajo número de células. Estos protocolos garantizan la comparación fiable y reproducible de bacterias de tipo salvaje y lisogénicas en diversas condiciones, mejorando así el perfil transcriptómico de los genomas de los profagos y ayudando a identificar funciones de los profagos previamente no reconocidas.

Introducción

Recientemente, la terapia con fagos para hacer frente a la resistencia a los antimicrobianos1 y la edición genética basada en CRISPR-Cas2 han generado un renovado interés en la investigación de bacteriófagos. Una vez más, los avances en biotecnología han permitido una investigación más profunda de las interacciones entre bacterias y fagos3. Sin embargo, el uso terapéutico de los fagos ("terapia con fagos") se ve obstaculizado por la preocupación de que los fagos actúen como elementos genéticos móviles con la capacidad de transferir genes de virulencia y resistencia horizontalmente4. La extensión de la "materia oscura"5 (genes con funciones desconocidas) es a la vez preocupante y tentadora. La materia oscura se considera una laguna en nuestra comprensión de la biología de los fagos y un recurso en gran medida sin explotar para herramientas moleculares y posibles nuevas terapias6. El desarrollo de técnicas de secuenciación de alto rendimiento, junto con la mejora de la anotación de genes 7,8,9 y los nuevos algoritmos de plegamiento de péptidos10, está mejorando la detección, descripción y predicción funcional de los genes de fagos. Sin embargo, la ciencia aún está lejos de validar las funciones genéticas de la mayoría de los fagos en cultivos o en el mundo real.

La secuenciación de ARN (RNA-Seq) puede mapear globalmente la expresión génica durante la infección por fagos y ha mejorado significativamente la comprensión de los elementos fagos y bacterianos involucrados en los ciclos líticos y lisogénicos11,12. Durante los procesos lisogénicos, los genomas de los fagos templados se integran en el ADN bacteriano para convertirse en profagos13. Los experimentos de perfiles de expresión génica global se pueden utilizar para identificar genes restringidos por profagos que están codificados en genomas de fagos templados, pero que solo se expresan durante el estado lisogénico11. Estos genes no codifican proteínas estructurales de fagos y no están implicados en ningún proceso de infección por fagos. RNA-Seq se puede utilizar para identificar aquellos genes que tienen más probabilidades de influir en la biología del huésped bacteriano, ya sea induciendo una ganancia de función o regulando los genes bacterianos existentes, lo que a menudo permite que las bacterias se adapten a entornos cambiantes. Por lo tanto, se podría estudiar la capacidad de los profagos para actuar como titiriteros microbianos, controlando una serie de funciones bacterianas.

Existen dos barreras principales para el análisis efectivo de la expresión génica restringida por profagos. En primer lugar, la disponibilidad de hosts susceptibles es una cuestión clave. Por definición, los profagos ya están incorporados en el genoma específico de su huésped, por lo que es difícil encontrar un huésped de tipo salvaje susceptible para comparar la expresión génica global en presencia y ausencia del profago. Esto puede lograrse mediante la infección de novo de otro huésped susceptible o la eliminación del profago del aislado original de tipo salvaje, sin alterar el resto del genoma del huésped. La segunda barrera radica en la naturaleza heterogénea de las poblaciones lisogénicas. Algunos profagos se degradan a través de la mutación o la recombinación para volverse "crípticos", lo que significa que se fijan en un lugar específico del genoma bacteriano. Sin embargo, otros profagos son "activos" y pueden ser inducidos a un ciclo lítico replicativo espontáneamente o después de la exposición a factores inductores. En muchos cultivos lisogénicos, la tasa de inducción espontánea significa que una proporción de las células bacterianas siempre están experimentando replicación de fagos líticos14,15,16. Un alto nivel de expresión de genes de fagos tardíos en estas poblaciones enmascara el bajo nivel de expresión génica asociado con la expresión génica restringida por lisógenos11,17. La proporción de lisógenos sometidos a la inducción espontánea de profagos puede variar según el estado de crecimiento, las condiciones de crecimiento u otros desencadenantes. Por lo tanto, para estudiar los impactos de los profagos sobre el lisógeno, los eventos de inducción espontánea de profagos deben minimizarse tanto como sea posible optimizando las condiciones de crecimiento para favorecer el estado lisogénico.

Este estudio reporta el trabajo preparatorio realizado para investigar la influencia de un conjunto de prófagos cohabitantes de la cepa epidémica de Liverpool (EEI) de Pseudomonas aeruginosa. Se indujeron y aislaron profagos activos del EEI y se utilizaron para infectar la cepa modelo del huésped P. aeruginosa, PAO116,18,19. Se secuenciaron los genomas completos de la cepa silvestre de P. aeruginosa, PAO1, y su lisógeno, PAO1Φ2, (a una profundidad de 30 veces la cobertura) para garantizar la identidad de la cepa salvaje y confirmar que el lisógeno era isogénico. El EEI se ha asociado con un aumento de la morbilidad y mortalidad en pacientes con fibrosis quística, y se ha sugerido que los fagos del EEI 19 ayudan a la adaptación al entorno pulmonar de la fibrosis quística16,19,20. A pesar de la fuerte evidencia de que estos profagos afectan la biología de su huésped20,21, la mayoría de sus funciones génicas aún no han sido caracterizadas, y los mecanismos específicos de interacción son poco conocidos. Un enfoque transcriptómico puede descubrir empíricamente las funciones de los genes de los profagos en un entorno de huésped controlado. Dado que la inducción espontánea puede afectar los perfiles de expresión, este artículo describe cómo optimizar las condiciones de crecimiento para favorecer el estado lisogénico. Esta sincronización de cultivos puede validarse mediante PCR en tiempo real para cuantificar los niveles de expresión de marcadores genéticos clave que se asocian con etapas cruciales de la replicación del fago LES en PAO1. El mismo enfoque se ha utilizado previamente para identificar las funciones restringidas a los profagos de los fagos toxigénicos de Shiga que afectan la motilidad, la resistencia a los ácidos y la resistencia a los antimicrobianos en Escherichia coli11,17,21,22.

Protocolo

1. Crear un host de indicador seleccionable (Figura 1)

NOTA: Los lisados de cultivo de fagos pueden contener células contaminantes del huésped bacteriano original. Tener una cepa indicadora resistente a los antibióticos permite discriminar entre la cepa indicadora y el huésped bacteriano original del profago. El uso de una cepa indicadora seleccionable permite la enumeración precisa de las partículas de fagos infecciosos sin necesidad de pasos de centrifugación o filtración para eliminar el fago de las células lisógenas siguiendo los pasos de amplificación de fagos. La cepa del huésped indicador seleccionable también reduce el tiempo y el número de pasos para la enumeración de fagos, de modo que se pueden probar varias condiciones simultáneamente.

  1. Identificar una cepa indicadora adecuada de hospedador susceptible a la infección lítica y lisogénica por el fago templado de interés. Se utilizó la cepa de laboratorio PAO118,20 de P. aeruginosa que es sensible a los tres fagos del EEI (LESΦ2, LESΦ3 y LESΦ4).
  2. Elegir un agente selectivo adecuado (aquí se utilizó rifampicina) y realizar un ensayo de dilución en caldo para determinar la concentración inhibitoria mínima (CMI) para el huésped indicador (16 μg·mL−1 es la CMI para PAO1)23,24.
  3. Exponer secuencialmente los cultivos del huésped indicador a concentraciones crecientes del agente selectivo en el caldo de lisogenia (LB), comenzando por debajo de la CMI (en este caso 5 μg·mL−1), durante 18-24 h, con agitación y a 37 °C.
  4. Transfiera el cultivo que crece a la concentración más alta en una proporción de 1:100 (inóculo a medio) a concentraciones dos veces mayores del agente selectivo (18-24 h cada vez) hasta que la CMI se haya incrementado lo suficiente. PAO1 se convirtió en una cepa resistente a rifampicina (PAO1-RifR) a 300 μg·mL−1 de rifampicina.

2. Enumeración temporal directa de la inducción espontánea (Figura 2)

  1. Establecer durante la noche cultivos iniciadores tanto del lisógeno (p. ej., P. aeruginosa PAO1 lisógeno que alberga fagos LES) como del huésped indicador (PAO1-RifR) inoculando una sola colonia en 5 mL de LB, e incubar a 37 °C con agitación a 180 rpm (18-24 h).
  2. Preparar cultivos frescos de lisógeno y hospedador indicador inoculando los cultivos durante la noche en 100 mL de LB en una proporción de 1:100, e incubar a 37 °C con agitación (180 rpm).
    1. Monitorizar el crecimiento del lisógeno midiendo el DO600 y el recuento viable mediante la técnica de Miles Misra25. Para ello, se debe recoger una muestra de 1 mL de cada cultivo de lisógeno cada hora desde el punto de inoculación durante 8 h.
    2. Diluir en serie la muestra inmediatamente después de la recolección añadiendo 100 μL de la muestra en 900 μL del medio respectivo. Ordene bien a la velocidad máxima, deseche la punta en cada dilución y continúe la serie de diluciones de 10−1 a 10−9.
    3. Colocar 10 μL de las diluciones requeridas por triplicado en una placa de agar LB, dejar secar e incubar a 37 °C durante 18-24 h.
    4. Para calcular el número de células bacterianas viables, busque una dilución con colonias fácilmente contables. Cuente el número de colonias en cada punto y luego use la siguiente fórmula:
      figure-protocol-1
      NOTA: A medida que crece el cultivo de lisógeno, se producirán partículas activas de fagos por inducción espontánea. La producción de fagos infecciosos significa que el transcriptoma de la población de lisógenos está ahora contaminado con la expresión génica asociada al ciclo de replicación lítica a partir de la señal de replicación del fago lítico y la correspondiente respuesta de la célula huésped. Por lo tanto, es importante identificar la etapa de crecimiento en la que la proporción de células lisogénicas con respecto a las partículas libres de fagos infecciosos es mayor para limitar la mayor cantidad posible de ruido de transcripción de fondo (generado por el transcriptoma del fago lítico) en el conjunto de datos.
  3. Para enumerar las partículas de fagos infecciosos en cada muestra temporal, inocule 5 ml de agar bacteriológico estéril al 0,4% en LB (agar superior) con 100 μl de huésped indicador de fase exponencial media (OD600: 0,4-0,5; en este caso, PAO1-RifR) en presencia de un agente selectivo apropiado (50 μg·mL−1 de rifampicina en este caso, ya que la CMI del huésped PAO1 es de solo 16 μg·mL−1; véase la Tabla de materiales, vuelta 8 y vuelta 9)
    1. Aplicar 10 μl de la misma dilución seriada (ver paso 2.2.2) en la capa superior de agar inoculada y dejar secar antes de incubar a 37 °C durante 18-24 h.
    2. Para calcular las partículas de fagos infecciosos, busque una dilución con placas fácilmente contables. Cuente el número de placas en cada lugar.
      figure-protocol-2
    3. Encuentre el tiempo/condición para el cual la inducción espontánea por UFC (unidad formadora de colonias) es mínima para los siguientes pasos experimentales.

3. Preparación de cultivos de lisógeno inducidos y no inducidos para la extracción de ARN (Figura 3)

  1. Preparar un nuevo cultivo durante la noche inoculando una sola colonia del lisógeno en 5 mL de LB e incubar a 37 °C con agitación (180 rpm) durante 18-24 h.
  2. Subcultivo: el cultivo nocturno en 80 mL de LB en una proporción de 1:100 en ocho matraces de 250 mL.
  3. Etiquete el primer matraz como "no inducido" y los demás como "inducidos", junto con los puntos de tiempo en que se debe recolectar cada muestra (es decir, "t inducida = 0", "t inducida = 10 min", "t inducida = 20 min", etc.; Figura 3).
  4. Después de 90 min de incubación, cuando el OD600 esté entre 0,1 y 0,2, o en el momento de una inducción espontánea mínima (ver la discusión), añadir 4 μL de ácido acético glacial al 1% (v/v) al matraz no inducido (Figura 3).
    NOTA: Como el agente inductor en este trabajo se hizo utilizando ácido acético glacial al 1% como solvente, se agregó la misma cantidad de solvente solo como paso de control. Se pueden considerar controles alternativos dependiendo de la preparación de los diferentes inductores.
  5. Añadir los 80 ml de cultivo del matraz no inducido a 720 ml de LB estéril y añadir inmediatamente la solución de parada (5 % [v/v] de fenol helado, pH 4,3, etanol al 95 % [v/v]) utilizando un volumen que sea el 20 % del volumen de cultivo (160 ml), e incubar en hielo durante un mínimo de 30 minutos y no más de 2 h para estabilizar los transcritos de ARN12. 26,27. Esta es la muestra no inducida.
  6. Inducir los cultivos restantes en siete matraces de 250 mL (Figura 3) con la CMI de un agente inductor apropiado (en este caso, 25 mg·mL−1 de norfloxacino, preparado en ácido acético glacial al 1% [p/v], utilizado a una concentración final de 1 μg·mL−1), mezclar bien e incubar a 37 °C y con agitación a 180 rpm durante 1 h.
    NOTA: Este paso obligará al cultivo de lisógeno a un estado más coordinado de replicación lítica. La mayoría de las células en el cultivo comenzarán a experimentar la producción lítica de partículas de fagos infecciosos.
  7. Permita que las células se recuperen añadiendo 80 mL de cultivo del matraz inducido a 720 mL de LB estéril, lo que diluye eficazmente el agente inductor. Recoja las células bacterianas de cada matraz cada 10 minutos desde el tiempo 0 hasta 1 h añadiendo una solución de parada, como se menciona en el paso 3.5.
    NOTA: La solución de parada estabiliza el ARN hasta por 2 h. Sin embargo, para mejorar la estabilidad de la muestra, realice todos los pasos adicionales a 4 °C.
  8. Cosechar por centrifugación a 10.000 x g durante 15 min a 4 °C lo antes posible, no superando las 2 h post-tratamiento para evitar la degradación del ARN.
  9. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente los gránulos bacterianos en el líquido residual con una pipeta automática ajustable antes de transferir cada muestra a un tubo de microfuga de 1,5 ml.
  10. Centrifugar los tubos de microfuga a alta velocidad (13.000 x g) en una microfuga a 4 °C durante 1 min, y desechar el sobrenadante residual.
  11. Congele rápidamente los gránulos sumergiendo cada tubo de microfuga sellado en nitrógeno líquido. Esto ayudará a la lisis eficiente de las células para la extracción de ARN.
  12. Agregue TRIzol (1 mL) a cada gránulo congelado y homogeneice la suspensión mediante pipeteo (no haga vórtice). Almacenar a -80 °C hasta que esté listo para realizar la extracción de ARN de todas las muestras.
    NOTA: El protocolo se puede pausar en este punto.
  13. Repita los pasos 3.1 a 3.13 con tres réplicas biológicas.

4. Aislamiento de ARN a partir de cultivos de lisógeno inducidos y no inducidos

CRÍTICO: Todos estos pasos deben realizarse en un entorno libre de RNasa28. Los bancos de trabajo deben limpiarse con NaClO al 10% o con inactivadores de ARNasa patentados. El material de laboratorio debe tratarse con inhibidores de la ARNasa, como el tratamiento con DPC, y se debe usar agua libre de nucleasa en todas las reacciones.

  1. Descongele los gránulos congelados tratados con TRIzol del paso 3.12 en hielo y agregue 400 μL de cloroformo de grado de biología molecular.
  2. Agitar bien los viales por inversión durante 10 s para completar la lisis de todas las células ( no hacer vórtice). A continuación, incubar a temperatura ambiente (21 °C) durante 2-5 min.
  3. Separar la capa acuosa de la mezcla TRIzol/cloroformo mediante centrifugación utilizando un microfugo refrigerado de sobremesa a 4 °C y 13.000 x g durante 15 min.
  4. Recoja la fase acuosa (~ 500 μL, capa superior) con una pipeta de 1.000 μL, teniendo cuidado de no alterar la fase intermedia u orgánica (capa inferior). Transfiera a un nuevo tubo de microfuga de 1,5 ml.
  5. Añadir 450 μL de isopropanol de grado de biología molecular a la fase acuosa separada, mezclar bien por inversión ( no hacer vórtice) e incubar a temperatura ambiente (21 °C) durante 30 min.
  6. Recuperar el ARN por centrifugación utilizando una centrífuga refrigerada a 4 °C y 13.000 x g durante 30 min.
  7. Deseche el sobrenadante sin alterar el gránulo de ARN y lave el gránulo dos veces con 800 μL de etanol al 70 % preparado con agua sin nucleasa (no pipetear hacia arriba y hacia abajo). Asegure la estabilidad del gránulo de ARN repitiendo el paso de centrifugación durante 5 minutos después de cada lavado.
  8. Deseche el etanol y seque al aire el gránulo.
    NOTA: Aspire el etanol alrededor del gránulo con cuidado con una micropunta de 10 μL y seque el gránulo invirtiendo el tubo sobre papel secante limpio. La bolita de ARN debe volverse incolora y los bordes deben aparecer ondulados y visibles. Secar muy poco puede dejar etanol residual que puede afectar los procesos posteriores, y secar demasiado el gránulo puede dificultar la resuspensión.
  9. Resuspender el ARN en agua libre de nucleasas (50 μL) incubando a 65 °C en un agitador térmico con mezcla intermitente (cada 30 s) durante un total de 3-5 min.
    CRÍTICO: El grupo 2'-OH del ARN es capaz de catalizar la autoescisión de las hebras de ARN a una temperatura alta por encima de 65 °C y un pH alto. Las temperaturas inferiores a 65 °C retrasarán la resuspensión del ADN residual, limitando así la cantidad de ADN que debe digerirse en una etapa posterior con la digestión de la DNasa I. Por lo tanto, mantener la temperatura a 65 °C es fundamental para obtener las mejores muestras.
    NOTA: El protocolo se puede pausar en este punto y las muestras se pueden almacenar a -80 °C.

5. Eliminación del ADN contaminante del ARN mediante tratamiento con DNasa

  1. Para eliminar el ADN contaminante del ARN total antes de la síntesis de ADNc de la primera cadena, agregue un volumen 0,1 de tampón de DNasa 10x y 1 μL de enzima DNasa a 10 μg de ARN total. Mezclar el tubo suavemente e incubar a 37 °C durante 30 min.
  2. Vuelva a suspender el reactivo de inactivación de la DNasa y añada un mínimo de 2 μL o un volumen del 10% del volumen total de la reacción. Mezclar bien e incubar las muestras durante 5 min a temperatura ambiente (21 °C) durante la redispersión del reactivo de inactivación de la DNasa.
  3. Granular los reactivos de DNasa por centrifugación con una microcentrífuga de sobremesa a 10.000 × g durante 1,5 min.
  4. Transfiera el sobrenadante que contiene el ARN a un tubo nuevo sin alterar el gránulo.
    NOTA: Verifique la calidad del ARN utilizando un espectrofotómetro UV a escala de 1 μL y un analizador informático de ácido nucleico basado en microfluídicos según las instrucciones del fabricante; El ARN total purificado puede almacenarse a -80 °C. En el caso de la QRT-PCR, el ARN podría utilizarse directamente en este punto. Para procesos posteriores más sensibles, como la secuenciación de ARN, que requieren una calidad de muestra estricta, se debe alcanzar una relación A260/230 de ε 2.0 para continuar.
  5. Aumente el volumen de la solución de ARN libre de ADN a 500 μL utilizando agua libre de nucleasa.
  6. Añadir 50 μL de acetato sódico 3 M libre de nucleasa (pH 5,3) y 495 μL de isopropanol. Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
    NOTA: Este paso precipitará el ARN.
  7. Recuperar el ARN por centrifugación a 13.000 x g y 4 °C durante 30 min.
  8. Lavar el gránulo de ARN tres veces con etanol al 70% helado centrifugando las muestras a 13.000 x g y 4 °C durante 5 minutos después de cada lavado para eliminar completamente las sales.
  9. Verifique la calidad del ARN utilizando un espectrofotómetro UV a escala de 1 μL y un analizador informático de ácidos nucleicos de base microfluídica según las instrucciones del fabricante; El ARN total purificado puede almacenarse a -80 °C.
    NOTA: La guía29 se utilizó para alcanzar los estándares de calidad del ARN. Si la relación A260/230 es <2,0, repita los pasos 5,5 a 5,9.

6. Análisis cualitativo y cuantitativo del ARN libre de DNasa

  1. Validar la eficacia del tratamiento con DNasa para cada muestra mediante la realización de una PCR cuantitativa utilizando cebadores de ARNr 16S (Tabla 2) con 1 μg de ARN total, y confirmar que no se produce ningún producto de amplificación.
    NOTA: Los cebadores ideales para evaluar la contaminación por ADNg serían los cebadores diseñados para recocer en las uniones intrón-exón o en las regiones reguladoras de los procariotas o en los sitios transcripcionalmente inactivos30,31.
  2. Determine el número de integridad del ARN (RIN) utilizando un analizador informático de ácidos nucleicos basado en microfluídica según las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Las muestras que muestren un RIN ≥ 9 deben utilizarse para la síntesis de la primera cadena. Las muestras que muestren un RIN < 9 deben descartarse y se deben repetir los pasos de aislamiento (1.1-5.4).
  3. Cuantifique la concentración total de ARN utilizando el kit de ensayo de ARN HS y un fluorímetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

7. Síntesis de ADNc de primera cadena

  1. Prepare una mezcla de cebadores de ARN para cada muestra mezclando 1 μg de ARN total con 1 μL de hexámeros aleatorios (50 ng·μL−1) y 1 μL de mezcla de dNTP de 10 mM. A continuación, ajuste el volumen total a 10 μL utilizando agua sin nucleasas.
  2. Incubar la reacción a 65 °C durante 5 min y colocar en hielo durante 1 min.
  3. Prepare una mezcla de síntesis de ADNc para cada muestra añadiendo 2 μL de tampón RT 10x; 4 μL de 25 mM MgCl2; 2 μL de TDT de 0,1 M; 1 μL de inhibidor de la ARNasa (40 U·μL−1); y 1 μL del reactivo de transcripción inversa (200 U·μL−1) en el orden indicado.
  4. Agregue la mezcla de síntesis de ADNc a la mezcla de ARN / cebador. Mezcle suavemente y centrifugue las muestras brevemente para recoger los componentes en la parte inferior del tubo.
  5. Prepare la mezcla incubando las muestras durante 10 minutos a 25 °C, seguidos de 50 minutos a 50 °C. Finalice las reacciones incubando a 85 °C durante 5 minutos y enfríe en hielo.
  6. Añadir 1 μL de RNasa H a cada tubo e incubar a 37 °C durante 20 min para eliminar el ARN del híbrido ADN:ARN.
  7. Por último, diluir la reacción de síntesis de ADNc hasta un volumen total de 80 μL y almacenarla a -80 °C hasta su uso posterior.
    NOTA: El protocolo se puede pausar en este punto.

8. Curva estándar y PCR cuantitativa (q) para determinar los niveles de expresión de genes marcadores que indican diferentes etapas de replicación de fagos

  1. Identificar un conjunto de genes diana que puedan actuar como marcadores para cada etapa de replicación del fago de interés. En nuestro caso, estos fueron los que se detallan en la Tabla 2.
  2. Amplificar cada uno de los genes diana a partir del ADN genómico molde utilizando cebadores pertinentes y mediante PCR con las siguientes condiciones de amplificación: desnaturalización inicial a 95 °C durante 2 min; desnaturalización a 95 °C durante 30 s; recocido a la temperatura óptima de recocido en función de las imprimaciones (aquí se utilizó 58 °C) durante 30 s; extensión a 72°C durante 1 min; y extensión final a 72 °C durante 5 min.
  3. Purifique cada amplicón utilizando un kit de purificación de PCR y clónelos en un vector de clonación de TA según las instrucciones del fabricante. Verifique la secuencia de cada producto clonado mediante secuenciación de Sanger.
    NOTA: El protocolo se puede pausar en este punto.
  4. Calcule el número de copias de plásmidos individuales utilizando la siguiente ecuación20:
    figure-protocol-3
  5. Prepare una plantilla estándar para cada gen marcador diluyendo en serie el ADN plasmídico de 109 copias/μL a 10 2 copias/μL en H2 O estéril libre de nucleasa de grado molecular.
  6. Realizar una PCR cuantitativa de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el sistema de qPCR preferido con 1 μl de ADNc (a partir del paso 7.7) para cada muestra por triplicado, junto con los respectivos patrones de plásmidos por triplicado; realizar la PCR en una placa de 96 pocillos para cada objetivo.
  7. Trace el número de copias de ADN logarítmico (eje x) frente al umbral del ciclo (eje y, Ct) y utilice una plataforma adecuada, como Excel o R, para realizar un cálculo de regresión lineal para mostrar el coeficiente de determinación (R2) y una ecuación lineal.
    NOTA: El coeficiente de determinación debe ser superior a 0,98.
  8. Estime el número de copias para cada objetivo utilizando la ecuación lineal (y = mx + b) derivada de la regresión lineal (paso 8.7), donde y es el Ct estimado; x es el número de copia logarítmica de ADN; m es la pendiente de la recta, que define el cambio en el Ct con respecto al número de copias de ADN; y b es la intersección del eje y que representa el Ct estimado para una copia de ADN32.
  9. Para cada gen marcador, calcule la eficiencia de la amplificación de PCR (E) utilizando los parámetros de la regresión lineal de la curva estándar y la siguiente ecuación, donde m es la pendiente derivada de los pasos 8.7 y 8.8:
    figure-protocol-4
  10. Valide todos los cebadores en términos de su eficiencia porcentual utilizando la siguiente ecuación:
    NOTA: La eficiencia debe estar en el rango del 90% al 110%.
    figure-protocol-5
  11. Calcule el número absoluto de copias del ADN utilizando la siguiente fórmula:
    figure-protocol-6
    donde Ct (paso 8.8) es el umbral del ciclo, b es la intersección (paso 8.8), m es la pendiente (paso 8.8) y E es la eficacia de la amplificación por PCR (paso 8.9).
    CRÍTICO: Cuando se compara la amplificación de dos o más dianas por q-PCR, se debe calcular la eficiencia de la PCR para cada diana con el fin de comparar el número absoluto de copias de ADN.
  12. En este estudio, se utilizaron los genes 16S rRNA, proC y rpoD como controles internos generales, y gyrB como control de inducción33,34,35.
    NOTA: Al elegir controles internos a partir de los datos de secuenciación de ARN, es mejor seleccionar controles internos que no cambien en los niveles de expresión para las condiciones probadas. La consideración cuidadosa de los controles apropiados siempre es importante para la interpretación significativa de los resultados.

Resultados

En este trabajo, se utilizó la enumeración temporal directa de la producción de fagos a partir de un cultivo de lisógeno PAO1 LESΦ2 cultivado en condiciones no inductoras para determinar el impacto de la inducción espontánea de LESΦ2. La densidad de fagos se encontraba en su punto más bajo con una media de ~2,61 x 106 unidades formadoras de placa (UFP)·mL−1 2 h después del subcultivo en medio fresco durante la fase exponencial temprana de crecimiento, lo que sugiere que la lisoggenia fue el estado dominante. El título de LESΦ2 aumentó rápidamente a una media de ~2,4 x 108 UFP·mL− 1 en 4 h y alcanzó la densidad más alta después de 6 h (media de ~5,83 x 109 UFP·mL−1; Figura 4).

Se observó una inducción espontánea mínima durante la fase logarítmica temprana del crecimiento del lisógeno (después de 2 h). Sin embargo, la presencia medible de fagos en el medio de cultivo fue el resultado de muchos eventos previos, incluidos los siguientes: el empaquetamiento de ácidos nucleicos en cabezas de proteínas, el ensamblaje de proteínas en partículas de fagos y la expresión de genes de fagos tardíos, genes de fagos en etapa intermedia y genes de fagos reguladores tempranos. Era importante atrapar las células infectadas antes de la expresión de los eventos de replicación asociados a los fagos; Por lo tanto, se eligieron 90 minutos para dejar que el cultivo creciera antes de la inducción. Para capturar el perfil de expresión génica de la PAO1, se recolectaron muestras de lisógeno LESΦ2 de un cultivo antes y después de la inducción durante un período de 90 minutos, como se menciona en el paso 3.4. Este punto de tiempo de 90 minutos es mucho antes de que se detecten altos niveles de inducción espontánea del profago residente mediante el ensayo de placa del paso 2.3.2. Dado que la densidad celular bacteriana era baja durante el crecimiento exponencial temprano, los volúmenes de cultivo se ampliaron hasta 800 ml para garantizar un amplio material para los estudios de expresión génica. Las muestras se recogieron del cultivo no inducido y de los cultivos inducidos cada 10 min, y se extrajo ARN para mapear el perfil de expresión de los marcadores clave para la lisogenia y la replicación lítica durante el crecimiento bacteriano. El ARN total se purificó y validó para detectar la ausencia de ADN genómico mediante ensayos de qPCR dirigidos al gen 16S rRNA (paso 6.1). Las muestras que alcanzaron un RIN ≥ 9 pasaron el control de calidad y se convirtieron en ADNc.

Se examinó el genoma anotado de LESΦ2 para identificar genes que son bien conocidos en los ciclos de replicación lisogénica y lítica de los fagos templados. Estos genes identificados se utilizaron para validar la qRT-PCR para el perfil de expresión de los genes restringidos al ciclo lisógeno y asociados al ciclo lítico de cultivos inducidos y no inducidos. Se cuantificó el número absoluto de copias de ADN y se realizó una prueba de rango con signo de Wilcoxon utilizando R36 para comparar los niveles de expresión en cultivos inducidos y no inducidos (Figura 5). Se observó un marcado aumento en la expresión del gen cro (un marcador temprano de replicación lítica) de ~2,31 x 109 copias en cultivos no inducidos a ~3,02 x 1011 copias 30 min después de la inducción (prueba de rango con signo de Wilcoxon: p < 0,01). De manera similar, las proteínas O y las proteínas P, que son marcadores de etapa intermedia de la replicación lítica (y se predice que están involucradas en la replicación del genoma del fago), también mostraron una regulación positiva significativa de ~ 1.74 x 108 a ~ 1.25 x10 10 copias (prueba de rango con signo de Wilcoxon: p < 0.01) y de ~ 6.05 x 102 a ~ 5.68 x 105 copias (prueba de rango con signo de Wilcoxon: p < 0,01), respectivamente. Finalmente, los genes estructurales asociados a la cola se utilizaron como marcadores tardíos del ciclo de replicación lítica. Una vez más, observamos un aumento significativo en la expresión de ~2,31 x 106 copias en cultivos no inducidos a ~4,38 x 108 copias 30 min después de la inducción (prueba de rangos con signo de Wilcoxon: p < 0,01). Por lo tanto, los datos cuantitativos de RT-PCR confirmaron que la expresión génica de genes marcadores bien establecidos para la replicación lítica siguió la tendencia esperada, con los marcadores tempranos, medios y tardíos mostrando una expresión diferencial múltiple en el orden predicho (Figura 5). Dado que la expresión de los marcadores para la replicación lítica se reguló al alza 30 min después de la recuperación, se considera un punto de tiempo representativo apropiado para estudiar el paisaje transcriptómico de fagos templados activos y sus huéspedes bacterianos durante el ciclo lítico.

Observamos cierta expresión de genes líticos en condiciones no inducidas, lo que confirma que siempre se produce alguna inducción espontánea, incluso en cultivos optimizados en los que el número de lisógenos se representa con la mayor proporción de UFC a PFU liberada en la fase logarítmica temprana. Esto significa que siempre habrá algún nivel de "ruido" en los datos transcriptómicos, lo que refuerza la importancia de los controles cuidadosamente preparados, incluidos los cultivos inducidos y no inducidos. La elección apropiada de los genes de control interno para determinar los cambios de pliegue en la expresión se basa en un examen cuidadoso de los datos transcriptómicos para identificar los genes que se expresan al mismo nivel tanto en las muestras no inducidas como en las inducidas. Nuestros resultados preliminares sugieren que rpoD fue el gen de control más confiable probado y tuvo la expresión más estable (~ 1,71 x 10 5 copias antes de la inducción y ~ 3,33 x 105 copias 30 min después de la inducción; Prueba de rango con signo de Wilcoxon: p = 0,3594) en comparación con los genes 16S rRNA o proC (Figura 5). La variabilidad de la expresión de los controles internos llevó a la medición del número absoluto de transcripciones. El examen futuro de los datos transcriptómicos apoyará la elección de controles internos apropiados para una mayor validación.

El gen cI se utilizó en nuestro ejercicio de perfil genético, ya que es un marcador bien reconocido de lisogenia. En comparación con los marcadores de replicación lítica, la expresión del gen cI fue relativamente estable (Figura 5), pero el número de copias de este gen fue tranquilizadoramente alto en los cultivos no inducidos en comparación con los de los marcadores de replicación lítica. Estos datos concuerdan con los bajos números de PFU en las mismas muestras, lo que confirma que la alta expresión de represores se asoció con niveles más bajos de producción de fagos. Los datos reportados aquí demuestran que la expresión de la transcripción cI para este fago en particular no está significativamente regulada a la baja después de la inducción, como se ve en los fagos Stx11,17. La actividad represora normalmente se controla tanto a nivel transcripcional como postraduccional, por lo que el gen represor puede transcribirse, pero la proteína resultante se somete inmediatamente a la autoescisión. Se requiere más experimentación para validar los controles transcripcionales y postraduccionales. Además, a partir de nuestra curva estándar, el límite mínimo de detección de qPCR parece ser de ~102 copias.

En conjunto, nuestros hallazgos de los ensayos de placa y qRT-PCR validan nuestra estrategia para el cultivo y la preparación de muestras de ARN para generar una entrada bien controlada para los experimentos de RNA-Seq. Los cultivos no inducidos en la fase exponencial temprana exhibieron bajos niveles de inducción espontánea y expresión génica lítica, lo que sugiere el predominio de la lisogenia. Por el contrario, los cultivos aislados 30 min después de la inducción mostraron aumentos significativos en la expresión de genes marcadores que indican la dominancia de la replicación lítica.

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Figura 1: Protocolo para crear el host indicador resistente a la rifampicina (Creado con BioRender.com). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Diseño experimental para enumerar la UFP y la UFC de un lisógeno a partir de la misma muestra. (Creado con BioRender.com) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Diseño experimental para el muestreo de cultivos inducidos y no inducidos para el aislamiento de ARN. (Creado con BioRender.com) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Enumeración temporal de la inducción espontánea. Enumeración temporal de la producción espontánea de profagos de EEI utilizando la UFP del lisógeno PAO1 Φ2 con la UFC concurrente, n = 8 (dos réplicas biológicas y cuatro técnicas); Las barras de error representan la desviación estándar. Los puntos rojos oscuros indican la UFC·mL−1 en LB; los puntos de color azul oscuro indican la UFP·mL−1 en LB. La liberación espontánea del fago infeccioso φ2 por los lisógenos se encuentra en el nivel más bajo medible a las 2 h después de la inoculación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Número absoluto de copias de los genes marcadores diana. El número absoluto de copias de los genes marcadores de fagos confirma los patrones de expresión predichos, derivados mediante RT-qPCR, de los genes que se espera que desempeñen un papel importante en la lisogenia y los ciclos líticos. Los puntos representan tres réplicas biológicas y tres técnicas (n = 9). (A) El recuadro rojo representa el marcador de lisogenia, cI; (B) el verde representa el marcador lítico temprano, cro; (C,D) el azul representa los marcadores líticos medios, los genes de replicación del ADN; (E) magenta representa el marcador lítico tardío, genes estructurales de la cola; El gris (F-H) representa los marcadores del huésped que se utilizaron como controles internos, y (I) el blanco representa la ADN girasa B, que se utilizó como control de inducción. Las líneas horizontales continuas muestran la mediana de la distribución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Imprimaciones diseñadas en este estudio. Se proporcionan las secuencias de cebadores específicos para los genes marcadores y los controles internos utilizados en este estudio, junto con sus correspondientes identificaciones de acceso al NCBI. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Eficiencia de los cebadores utilizados en este estudio calculada mediante la curva estándar de qPCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

La creación de un huésped indicador seleccionable, utilizado anteriormente en ensayos de placa para cuantificar con mayor precisión la inducción espontánea del fago Stx de E. coli MC1061 37,38,39, se ha descrito aquí para el fago LESΦ2 de P. aeruginosa. Esta intervención tiene el beneficio adicional de reducir los pasos y el tiempo de procesamiento de la muestra, lo que permite la evaluación simultánea de las tasas de inducción espontánea en múltiples condiciones de cultivo. Existe el riesgo de generar otras mutaciones durante la creación de variantes resistentes a la rifampicina40; Sin embargo, en este trabajo, la cepa evolucionada solo se utilizó como hospedero indicador para la enumeración de placas de cultivos de interés y no se incluyó en el análisis transcriptómico. Mientras la cepa indicadora seleccionable siga siendo igualmente susceptible a la infección por el fago de interés, no hay preocupación por otras mutaciones adquiridas. Sin embargo, no se detectaron diferencias en los perfiles de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción mediante el análisis de electroforesis en gel de campo de pulsos (PFGE) de PAO1WT y PAO1RIF (datos no mostrados).

Al elegir células huésped, es raro encontrar una cepa indicadora que no albergue ya profagos. Por ejemplo, la PAO1 alberga el profago filamentoso Pf4. Los controles experimentales para este estudio se diseñaron para poder examinar directamente la expresión génica de fagos específicos (en este caso, el profago 2 del EEI) y los efectos que este fago tiene sobre la expresión génica bacteriana. En la comparación de los transcritos de PAO1 portadores del profago 2 del EEI y que carecen del profago 2 del EEI (tanto el lisógeno como el no lisógeno portan la Pf4 endógena), que sirven como controles internos para excluir el impacto de la Pf4 en el huésped. Además, se ha demostrado que Pf4 generalmente no causa lisis en su célula huésped41 y, por lo tanto, no es capaz de confundir los resultados de estos experimentos.

Está bien establecido que un control de calidad cuidadoso es crucial en la preparación de las muestras para producir datos ómicos significativos42. Sin embargo, como se describió anteriormente11, la caracterización cuidadosa de la actividad de los profagos en la preparación de cultivos de lisógenos para tales estudios rara vez se realiza. Aquí, detallamos nuestros protocolos sistemáticos para preparar un conjunto bien controlado y optimizado de cultivos para estudios transcriptómicos con el fin de explorar mejor las interacciones entre bacterias y fagos templados. La sincronicidad de la población se controló sometiendo el cultivo a al menos cuatro duplicaciones antes de tratarlo con el antibiótico inductor norfloxacino. Al determinar la CMI de norfloxacino para la cepa en el estudio, pudimos asegurar que la concentración del agente inductor estaba justo por encima de la CMI para el tratamiento de "inducción". A continuación, las células tratadas se diluyeron 1:10 para reducir la concentración de norfloxacino por debajo de la CMI después del tratamiento de 1 h con el fin de permitir que las células se recuperaran y completaran el proceso de replicación del fago, terminando en la lisis de la célula y la liberación de la progenie del fago infeccioso. Las células solo entran en el ciclo de replicación lítica después del estímulo de inducción una vez que la concentración de norfloxacino se ha reducido por debajo de la CMI durante el período de recuperación. En este caso, ir por encima de 1 μg·mL−1 de norfloxacino significa que el fármaco no podría diluirse eficazmente por debajo de la CIM, ya que la CMI de norfloxacino para PAO1 es de 0,19 μg·mL−1. El nivel de dilución del inductor debe equilibrarse con la necesidad de recuperación de lisógeno y la retención de la densidad de cultivo para la recolección del ARN. Los datos discutidos aquí demuestran que es posible sincronizar cultivos para crear muestras en las que domina la lisogenia, reduciendo así el ruido de la inducción espontánea y permitiendo la detección de verdaderos cambios en la expresión génica impulsados por la lisogenia. Dado que el estado lisogénico es predominante en la fase inicial y exponencial del crecimiento, cuando la densidad celular bacteriana es baja, sugerimos escalar los cultivos para recolectar suficiente ARN para estudios posteriores de expresión génica, como RNA-Seq.

El uso de norfloxacino como agente inductor para forzar los cultivos en el ciclo lítico está bien reportado43,44; sin embargo, esto también afectará la expresión de otros genes bacterianos en el proceso45,46. Para mitigar esto, las bibliotecas de ARN de cultivos de tipo salvaje de control cultivados en las mismas condiciones de inducción y no inducción deben incluirse en los experimentos de RNA-Seq. El uso de controles internos y genes marcadores clave para validar las etapas de replicación de fagos mediante qRT-PCR también es crucial para realizar comparaciones precisas. El perfil cuantitativo de RT-PCR no puede interpretarse comparando el número absoluto de transcritos de cada gen en varios momentos; Lo que importa es la forma del perfil. En primer lugar, solo se ha muestreado una pequeña región en la transcripción de cualquier gen, por lo que se desconoce si se trata de un elemento de vida corta o más larga27. Ciertamente, el mapeo de RNA-Seq de las transcripciones muestra que la densidad de los datos de mapeo varía significativamente a lo largo de la longitud de un gen. En segundo lugar, es la forma del perfil de expresión génica la que debe interpretarse para un gen marcador asociado con el ciclo lítico o el estilo de vida lisogénico o incluso desacoplado de los circuitos reguladores de fagos11. La inducción espontánea es un problema real en el cultivo de lisógenos y siempre dará lugar a la expresión de genes asociados al ciclo lítico. Sin embargo, el perfil muestra que los genes asociados con el ciclo de replicación lítica están suprimidos en su expresión antes de la inducción (al menos dos pliegues logarítmicos) y regulados al alza después de la inducción.

Los análisis transcriptómicos realizados previamente de las interacciones de los fagos Stx con E. coli apoyan una comprensión profunda de los genes de los fagos involucrados en el mantenimiento de la lisogía y en el desencadenamiento del ciclo lítico11,17. En la actualidad, se han anotado los fagos del EEI de P. aeruginosa, pero sus funciones génicas clave son menos conocidas. Los estudios transcriptómicos permitirán la reanotación de los prófagos del EEI y mejorarán nuestra comprensión de los genes implicados en la lisogenia y el ciclo lítico. La vinculación de la secuencia génica con la función representa un reto importante en el estudio de nuevos profagos, lo que pone de relieve la necesidad de realizar más estudios para confirmar las funciones de los genes de los fagos para la producción de mejores herramientas de anotación47. La aplicación y adaptación más amplia de los protocolos y las medidas de control de calidad adicionales que se detallan en este artículo de vídeo podrían ayudar a desvelar varias funciones de los profagos y, por lo tanto, mejorar los canales de anotación y transformar nuestra comprensión de la biología de los fagos y las bacterias.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
FAGOS PAO16
LESB586
LESInducidos y purificados a partir de LESB58 utilizando Norfloxacina.Este estudio
Lisogenia Caldo (LB)Merck1.10285.500
LB AgarMerck1.10283.500
Agar AgarFisherA/1080/53
Top Agar0.4 g Agar Agar + 2.5 g LB Caldo en 100 mL de agua; autoclave y uso.-
RifampicinaSigma (Stock: 50 mg/mL en Metanol- Mezclar bien y usar 0.22µ Filtro M para esterilizar y almacenar en -20 grados; C hasta su uso)R3501
Ácido Acético GlacialFisher 1% (v/v) en agua10060000
NorfloxacinaSigma (Stock: 25 mg/mL de Ácido Acético Glacial al 1%-Mezclar bien y usar 0.22µ Filtro M para esterilizar y almacenar en -20 grados; C hasta su uso; Para evitar los ciclos de congelación y descongelación, almacene como pequeñas alícuotas)N9890
Fenol saturado con tampón de citrato pH 4.3SigmaP-4682
Grado de biología molecular EtanolFisher16695992
TRIzolInvitrogen12044977
CloroformoFisher11398187
IsopropanolFisher 17150576
H2O sin nucleasasInvitrogen10526945
10X TURBO DNasaAmbionAM1907
Qubit RNA HS, BR KitInvitrogenQ10210
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent5067-1511
SuperScriptIII kit de síntesis de primera cadenaInvitrogen
Bioline Mytaq Red 2XBIO-25043
Reactivos qPCRSensifast SYBR Hi RoxBIO-92020
Kit de purificación de PCRIsolate II Kit de PCR y GelBIO-52060
Kit de clonación TAKit de clonación TA, con vector pCR 2.1, sin células competentesK202040
Sistema de PCR en tiempo real StepOneThermo Fisher Scientific4376600
Reactivos de PCR 18080051

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