Method Article

Flujo de trabajo "Cell Surface Capture" para la cuantificación sin etiquetas del proteoma de la superficie celular

DOI:

10.3791/64952

⸱

March 24th, 2023

 ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco, 2Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay, 3Deptartment of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, 4Chan Zuckerberg Biohub

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, describimos un flujo de trabajo de proteómica para la caracterización del proteoma de la superficie celular de varios tipos de células. Este flujo de trabajo incluye el enriquecimiento de proteínas en la superficie celular, la posterior preparación de muestras, el análisis mediante una plataforma LC-MS/MS y el procesamiento de datos con software especializado.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durante la última década, la proteómica basada en espectrometría de masas ha permitido una caracterización en profundidad de sistemas biológicos en una amplia gama de aplicaciones. El proteoma de la superficie celular ("surfaceoma") en las enfermedades humanas es de gran interés, ya que las proteínas de la membrana plasmática son el objetivo principal de la mayoría de las terapias clínicamente aprobadas, así como una característica clave para distinguir diagnósticamente las células enfermas de los tejidos sanos. Sin embargo, la caracterización enfocada de las proteínas de membrana y superficie de la célula ha seguido siendo un desafío, principalmente debido a la complejidad de los lisados celulares, que enmascaran las proteínas de interés por otras proteínas de alta abundancia. Para superar esta barrera técnica y definir con precisión el proteoma de la superficie celular de varios tipos de células utilizando la proteómica de espectrometría de masas, es necesario enriquecer el lisado celular para las proteínas de la superficie celular antes del análisis en el espectrómetro de masas. Este artículo presenta un flujo de trabajo detallado para el etiquetado de proteínas de la superficie celular de células cancerosas, el enriquecimiento de estas proteínas a partir del lisado celular y la posterior preparación de muestras para el análisis de espectrometría de masas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las proteínas sirven como las unidades fundamentales por las cuales se llevan a cabo la mayoría de las funciones celulares. Caracterizar la estructura y función de las proteínas relevantes es un paso esencial para comprender los procesos biológicos. Durante la última década, los avances en la tecnología de espectrometría de masas, el software de análisis y las bases de datos han permitido la detección y medición precisas de proteínas a escala de todo el proteoma1. La proteómica basada en espectrometría de masas se puede utilizar en una amplia gama de aplicaciones, desde el análisis científico básico de las vías bioquímicas, hasta la identificación de nuevos objetivos farmacológicos en un entorno traslacional, hasta el diagnóstico y seguimiento de enfermedades en la clínica2. A la hora de seleccionar nuevas dianas farmacológicas, la caracterización del proteoma de la superficie celular es especialmente importante, ya que más del 65% de los fármacos humanos actualmente aprobados se dirigen a las proteínas de la superficie celular3. El campo de la inmunoterapia contra el cáncer también depende totalmente de los antígenos de superficie celular específicos del cáncer para dirigirse y eliminar específicamente las células tumorales4. Por lo tanto, la proteómica basada en espectrometría de masas puede servir como una herramienta prometedora para identificar nuevas proteínas de la superficie celular destinadas a intervenciones terapéuticas.

Sin embargo, existen varias limitaciones cuando se utilizan métodos proteómicos convencionales para estudiar las células tumorales en busca de nuevos objetivos de proteínas de la superficie celular. Una preocupación principal es que las proteínas de superficie constituyen una fracción muy pequeña del total de moléculas de proteínas en una célula. Por lo tanto, los fragmentos de estas proteínas están enmascarados por una gran abundancia de proteínas intracelulares cuando se realiza el análisis de espectrometría de masas del lisado de células completas5. Esta limitación dificulta la caracterización precisa del proteoma de la superficie celular con un flujo de trabajo de proteómica tradicional. Para hacer frente a este desafío, es necesario desarrollar formas de enriquecer las proteínas de la superficie celular a partir del lisado de la célula completa, antes del análisis en el espectrómetro de masas. Uno de estos métodos implica la oxidación y el marcaje de biotina de las proteínas de la superficie celular glicosiladas en las células intactas, y el posterior enriquecimiento de estas proteínas biotiniladas del lisado con un pulldown de neutravidina, un proceso que se ha denominado "captura de superficie celular"6. Dado que se cree que ~85% de las proteínas de la superficie celular de los mamíferos están glicosiladas7, esto sirve como un método eficaz para enriquecer el proteoma de la superficie celular a partir del lisado de toda la célula. Este artículo describe un flujo de trabajo completo, comenzando con células cultivadas, de etiquetado de biotina en la superficie celular y posterior preparación de muestras para el análisis de espectrometría de masas (Figura 1). A lo largo de varias réplicas, este método proporciona una cobertura robusta del proteoma de la superficie celular de una muestra en particular. La utilización de este método para caracterizar el proteoma de la superficie celular tanto de células tumorales como sanas puede facilitar el descubrimiento de nuevos antígenos de superficie celular para identificar posibles dianas inmunoterapéuticas8.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Se utilizaron células de plasmocitoma AMO1 para este experimento de proteoma de superficie celular. El mismo protocolo también podría usarse para otros tipos de células, incluida una amplia gama de líneas celulares en suspensión y adherentes9, así como varios tipos de muestras primarias10. Sin embargo, el número de células (material de partida para el experimento) normalmente tiene que ser optimizado para una cobertura de proteoma equivalente. Para obtener detalles relacionados con materiales y equipos, consulte la Tabla de materiales. Para obtener más información sobre los tampones y las soluciones de reactivos y su composición, consulte la Tabla 1.

1. Marcaje de la superficie celular con biotina

  1. Cuente las células cultivadas y el pellet aproximadamente 3,5 × 107 células vivas por centrifugación (5 min a 500 × g, 24 °C).
    NOTA: Las células de plasmocitoma AMO1 se sometieron a medios frescos cada 3 días antes de la recolección.
  2. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet añadiendo 1 mL de solución salina fría (4 °C) tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) (sin calcio, sin magnesio) y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
  3. Vuelva a granular las celdas (como en el paso 1.1) y repita el paso de lavado (paso 1.2) una vez más (dos lavados en total).
  4. Después del segundo lavado, granule las células (como en el paso 1.1) y vuelva a suspenderlas en 990 μL de D-PBS frío pipeteando suavemente.
  5. Prepare previamente una solución madre de 160 mM de metaperiodato de sodio (NaIO4). Dividir en alícuotas de 50 μL y almacenar a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Añadir 10 μL de 160 mM de solución de metaperiodato de sodio a la suspensión celular en el paso 1.4, mezclar bien e incubar en un rotor de extremo a extremo durante 20 min a 4 °C.
  6. Una vez completada la incubación, granule las células (como en el paso 1.1), decante el sobrenadante y vuelva a suspender en 1 ml de D-PBS frío. Repita este paso de lavado dos veces (tres lavados en total). Después del tercer lavado, vuelva a suspender las células en 989 μL de D-PBS.
  7. Prepare previamente una solución madre de hidrazida de biocitina 100 mM. Divida en alícuotas de 50 μL y almacene a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Añadir 1 μL de anilina y 10 μL de hidrazida de biocitina 100 mM a la suspensión celular en el paso 1.6, mezclar bien e incubar en un rotor de extremo a extremo durante 60 min a 4 °C.
  8. Una vez completada la incubación, granule las células (como en el paso 1.1), decante el sobrenadante y vuelva a suspender en 1 ml de D-PBS frío. Repita este paso de lavado dos veces (tres lavados en total).
  9. Después del tercer lavado, aspire el sobrenadante con cuidado con una pipeta y congele a presión el pellet de celda colocando el tubo en el líquido N2. Coloque el pellet congelado a -80 °C, hasta que esté listo para proceder con la lisis y la extracción.

2. Lisis celular y extracción de biotina

  1. Descongele el pellet de celda congelado en hielo.
  2. Agregue 500 μL de tampón de lisis 2x al pellet, mezcle bien y vórtice durante 30 s.
    NOTA: Es posible que se requiera un pipeteo vigoroso y un vórtice para lisar completamente el pellet. Algunos residuos insolubles (es decir, ADN) son aceptables, ya que se eliminan en la siguiente etapa de sonicación.
  3. Sonicar el lisado celular en hielo (tres ráfagas, 20 s cada una, 60% de ciclo de trabajo).
  4. Centrifugar el lisado para pellet los restos restantes (10 min a 17.200 × g a 4 °C).
  5. Mientras se centrifuga el lisado, agregue 100 μL de perlas de resina de neutravidina y agarosa a una columna de filtración. Conecte la columna a un colector de vacío, aplique una aspiradora suave y lave las perlas haciendo fluir 3 mL de tampón de lavado 1 sobre ellas.
  6. Retire la columna de filtración del colector de vacío, tape la parte inferior y agregue el lisado celular clarificado a la columna con las perlas. Tapar la parte superior de la columna e incubar el lisado con las perlas en un rotor de extremo a extremo durante 120 min a 4 °C.
    NOTA: Al tapar la parte superior de la columna, sostenga firmemente la tapa inferior en su lugar, de lo contrario, puede desprenderse y el lisado celular puede filtrarse durante la incubación.
  7. Prepare los tampones de lavado 1, 2 y 3 (aproximadamente 5 mL de cada tampón de lavado por muestra, consulte la Tabla 1) y colóquelos en un baño de agua a 42 °C
  8. Una vez que el lisado haya terminado la incubación, vuelva a colocar la columna de filtración en el colector de vacío, aplique un vacío suave y lave las perlas haciendo fluir 5 mL de tampón de lavado 1 sobre ellas.
    NOTA: Se pueden utilizar más de 5 ml de los tampones de lavado para el lavado; El lavado adicional puede reducir la unión no específica del fondo a las cuentas.
  9. Repita el paso de lavado con 5 ml de tampón de lavado 2.
  10. Repita el paso de lavado con 5 ml de tampón de lavado 3.
  11. Una vez que el tampón de lavado final haya fluido completamente a través de las perlas, retire la columna del colector. Añada 100 μl de solución "Lyse" a las perlas y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 mL con una pipeta. Gire brevemente el tubo para asentar las perlas y retire 50 μL de la solución sin alterar las perlas asentadas.
    NOTA: Los reactivos de este paso y de todos los pasos posteriores utilizan un kit de preparación de muestras de proteómica disponible en el mercado. El kit proporciona un flujo de trabajo de preparación de muestras optimizado y simplificado. Sin embargo, estos pasos también se pueden realizar independientemente del kit, utilizando un flujo de trabajo de proteómica tradicional como se describe en Verma et al.9. Si las cuentas permanecen pegadas al costado o a la parte inferior de la columna, permita que las cuentas que se han transferido al tubo se asienten y use una solución "Lyse" adicional en el tubo para transferir las cuentas restantes.
  12. Coloque el tubo en un bloque de calor/agitador a 65 °C y agite a 1.000 rpm durante 10 min.
    NOTA: Este paso es necesario para la reducción y alquilación de los residuos de cisteína antes de la digestión.

3. Digestión de proteínas

  1. Vuelva a suspender la tripsina seca (tubo "Digest" en el kit, almacenado a -20 °C) añadiendo 210 μL de la solución "Resuspend". Pipetea la solución hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurarte de que toda la tripsina seca se vuelva a suspender.
  2. Una vez completada la incubación, agregue 50 μL de la solución de tripsina resuspendida a las perlas. Incubar el tubo a 37 °C, agitando a 500 rpm durante al menos 90 minutos para digerir la proteína.
  3. Una vez completada la digestión, transfiera la solución que contiene las perlas a una columna de centrifugación e inserte la columna en un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 mL. Girar el tubo (500 × g durante 5 min a temperatura ambiente [RT]) para separar la solución peptídica digerida de las perlas.
    NOTA: En esta etapa, el tratamiento con PNGasa se puede realizar en las perlas una vez que se separan de la solución peptídica, para eluir los fragmentos de péptidos biotinilados de las perlas de estreptavidina. Esta muestra de péptidos se puede transportar a través del resto del flujo de trabajo como una muestra de péptido secundaria separada que se puede analizar y comparar con la muestra primaria de la tripsinización en cordón. Es probable que el enfoque PNGase proporcione datos complementarios a la tripsinización en perlas, dada la especificidad adicional para las asparaginas N-glicosiladas capturadas basadas en la modificación de la cadena lateral detectable por MS12. Sin embargo, el inconveniente de este enfoque de elución secuencial es el requisito de dos veces el tiempo del instrumento del espectrómetro de masas por análisis de muestra.
  4. Añadir 100 μL de la solución "Stop" para detener la reacción de digestión y acidificar la solución peptídica.

4. Desalinización de péptidos

  1. Con un adaptador de tubo, coloque una columna de desalinización en un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 mL. Agregue toda la solución de péptido acidificado a la columna. Gire la columna (3.800 × g durante 3 minutos) para que la solución fluya a través de la columna. Los péptidos ahora están unidos a la columna; Deseche el flujo.
  2. Añadir 200 μL de solución "Wash 1" a la columna y centrifugar (3.800 × g durante 3 min, RT). Deseche el flujo.
  3. Añadir 200 μL de solución "Wash 2" a la columna y centrifugar (3.800 × g durante 3 min, RT). Deseche el flujo.
  4. Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 mL, etiquetado. Añadir 100 μL de solución "Elute" a la columna y centrifugar (3.800 × g durante 3 min, RT). Añadir otros 100 μL de solución "Elute" a la columna y centrifugar (3.800 × g durante 3 min, RT). Los péptidos ahora se eluyen de la columna al tubo.
  5. Coloque la solución peptídica en una centrífuga al vacío y deje que se seque durante la noche. Coloque los péptidos secos a -80 °C hasta que estén listos para cuantificar y analícelos en el espectrómetro de masas.

5. Resuspensión y cuantificación de péptidos

  1. Vuelva a suspender los péptidos secos en 20 μL de disolvente A (0,1% de ácido fórmico, 2% de acetonitrilo).
  2. Centrifugar los péptidos resuspendidos (17.200 × g durante 10 min) para pellet cualquier residuo insoluble.
  3. Preparar patrones de péptidos para el ensayo de cuantificación colorimétrica de péptidos.
    1. Coloque 5 μL de solución madre peptídica de 1,000 mg/mL en un pocillo de una placa de 96 pocillos.
    2. Realice una dilución en serie de siete pasos en la placa con agua desionizada (DI), de la siguiente manera, con 5 μL de cada patrón por pocillo: 1.000 mg/mL, 500 mg/mL, 250 mg/mL, 125 mg/mL, 62,5 mg/mL, 31,25 mg/mL y 15,625 mg/mL. Coloque 5 μL de agua desionizada en un octavo pozo para el blanco.
  4. Coloque 4 μL de agua desionizada en tres pocillos separados de la placa de 96 pocillos. Agregue 1 μL de la solución de péptido resuspendido a cada pocillo, para un volumen total de 5 μL.
    NOTA: Al pipetear la solución peptídica para la cuantificación, pipetee cuidadosamente desde la parte superior de la solución para evitar alterar los residuos sedimentados.
  5. Calcule la cantidad de reactivo de trabajo que se necesita (se requieren 45 μL por pocillo). Prepare el volumen requerido del reactivo de trabajo del ensayo colorimétrico; vórtice el reactivo de trabajo para asegurar la mezcla adecuada de los componentes.
  6. Añada 45 μL del reactivo de trabajo a cada uno de los pocillos patrón y de muestra.
    NOTA: Realice los patrones por duplicado y utilice una pipeta multicanal para garantizar una diferencia mínima en el momento en que se añade el reactivo a los pocillos.
  7. Cubrir la placa con papel de aluminio e incubar a 37 °C durante 15 min.
  8. Analice la placa en un lector automático de placas. Utilice los valores de absorbancia registrados para las muestras estándar para generar una curva estándar lineal. Determine la ecuación de la curva estándar y el valor R2. Si el valor de R2 es razonable (≥0,95), utilice la curva estándar para determinar la concentración de péptidos resuspendidos, teniendo en cuenta la dilución quíntuple en la placa de ensayo colorimétrico.

6. Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) análisis de los péptidos digeridos

  1. Ajuste la concentración de las muestras de péptidos a 0,2 μg/μL añadiendo el disolvente A y transfiera 10 μL a un tubo de baja unión a proteínas de 0,6 mL.
  2. Coloque el tubo en el muestreador automático LC.
  3. Establezca los parámetros LC y MS/MS, de acuerdo con Figura 2 y Figura 3.
  4. Inyecte 5 μL (1 μg) de la muestra peptídica en la configuración LC-MS/MS para su análisis.
    NOTA: Los ajustes de LC-MS/MS que se muestran aquí solo son representativos de las ilustraciones. Dependiendo de la disponibilidad de los instrumentos LC y MS, los usuarios pueden modificar la configuración del gradiente LC y los parámetros MS/MS para obtener una cobertura profunda del proteoma. Para este trabajo, el análisis de datos de MS se realizó utilizando MaxQuant https://www.maxquant.org/, el análisis de datos secundarios se realizó utilizando Perseus https://maxquant.net/perseus/ y el análisis de vías utilizando https://reactome.org/.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para este experimento, caracterizamos el proteoma de la superficie celular de una línea celular tumoral marcando proteínas de membrana N-glicosiladas de células intactas con biotina, y enriqueciendo estas proteínas marcadas del lisado de toda la célula con un pulldown de neutravidina (Figura 1). Además, realizamos análisis de proteoma utilizando LC-MS/MS para caracterizar las proteínas de la superficie celular enriquecidas. A diferencia del análisis del proteoma de células completas...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La proteómica basada en espectrometría de masas es una herramienta poderosa que ha permitido la caracterización imparcial de miles de proteínas desconocidas a una escala previamente imposible. Este enfoque nos permite identificar y cuantificar las proteínas, así como obtener una variedad de conocimientos sobre las capacidades estructurales y de señalización de células y tejidos, mediante la caracterización de la variedad de proteínas presentes en una muestra en particular. Más allá del perfil global de proteínas en una m...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al Dr. Kamal Mandal (Departamento de Medicina de Laboratorio, UCSF) por su ayuda en la configuración de la carrera LC-MS/MS, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) por su ayuda con el análisis de datos, y a la Dra. Audrey Reeves (Departamento de Medicina de Laboratorio, UCSF) por su ayuda con el análisis de datos. El trabajo relacionado en el laboratorio de A.P.W. cuenta con el apoyo de la CA226851 R01 de los NIH y el Chan Zuckerberg Biohub. La Figura 1 y la Figura 2B se realizaron utilizando BioRender.com.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
96X Kit de preparación de muestras iSTPreOmicsP.O.00027Kit de preparación de muestras de proteómica. Incluye reactivos para la reducción, alquilación y digestión. También incluyen columnas de desalinización y reactivos.
Pierce Ensayo de péptidos colorimétricos cuantitativosThermo23275Kit de cuantificación de péptidos. Incluye estándares de péptidos y componentes de reactivos de trabajo.
Reactivos
AcetonitriloFisherA955-1
Bicarbonato de amonioMillipore Sigma09830-1KG
Hidrazida de biocitinaBiotium90060
D-PBS (sin sales de calcio y magnesio)Instalación de cultivo celular de UCSFCCFAL003-225B01
Ácido fórmicoHoneywell94318
Halt Inhibidor de la proteasa y la fosfatasa cóctel de un solo usoThermo1861280
resina de agarosa de neutravidina de alta capacidadThermo29204
solución salina tamponada con fosfatoInstalación de cultivo celular UCSFCCFAL001-22J01
Tampón de lisis RIPA, 10xMillipore Sigma20-188
Cloruro de sodioFisherBP358-212
Metaperiodato de sodioAlfa Aesar13798
Tinción azul de tripano (0,4%)Gibco15250-061
Ultrapuro 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575-038
Urea (grado proteómico)VWRM123-1KG
fuerte>Equipo
TC20 Contador de células automatizadoBio-Rad1450102
PrismR MicrocentrífugaLabnet InternationalC2500-R-230V
SonicadorVWRBranson Sonifier 240
PromegaPromega Vac-Man
Bloque de calor de agitaciónEppendorfEppendorf Thermomixer C
Rotador de extremo a extremoLabnetRevólver Rotador
LCThermoUltimate 3000 HPLC y UHPLC
Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Espectrómetro de masas ThermoIQLAAEGAAPFALGMBDK
Lector de microplacasBiotekBiotek Synergy 2 
Concentrador de vacíoLabconco7810010
Suministros
1,5 mL Tubos LoBind deEppendorf22431081
1,7 mL Tubos
Columnas de filtraciónBio-Rad7326008
Columnas de centrifugaciónThermo69725
<ajustable proteínas de microcentrífuga

References

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