Method Article

Exploración de las funciones del tejido adiposo

DOI:

10.3791/64957

⸱

March 3rd, 2023

 , 
1Team Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity and Diabetes, C3M, Université Côte d'Azur, Inserm

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ARTÍCULOS DISCUTIDOS:

Cho, D. S., Doles, J. D. Preparación de células progenitoras adiposas a partir de tejidos adiposos del epidídimo de ratón. Revista de Experimentos Visualizados. (162), doi: 10.3791/61694 (2020).

Peics, J. et al. Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos. Revista de Experimentos Visualizados. (162), doi: 10.3791/61610 (2020).

Estrada-Gutierrez, G. et al. Aislamiento de adipocitos viables y fracción vascular estromal de tejido adiposo visceral humano adecuado para análisis de ARN y fenotipado de macrófagos. Revista de Experimentos Visualizados. (164), doi: 10.3791/61884 (2020).

Gilleron, J. et al. Explorando la estructura del tejido adiposo mediante la limpieza de metilsalicilatos e imágenes 3D. Revista de Experimentos Visualizados. (162), doi: 10.3791/61640 (2020).

Czepielewski, R. S. et al. Análisis linfático y de redes sanguíneas durante la obesidad. Revista de Experimentos Visualizados. (165), doi: 10.3791/61814 (2020).

Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. Un modelo de cultivo de células adipocitos para estudiar el impacto de la modulación de proteínas y micro-ARN en la función de los adipocitos. Revista de Experimentos Visualizados. (171), doi: 10.3791/61925 (2021).

Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Aislamiento, proliferación y diferenciación de células madre derivadas del tejido adiposo de macaco rhesus. Revista de Experimentos Visualizados. (171), doi: 10.3791/61732 (2021).

Batista Jr., M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Cultivo tridimensional de adipocitos como modelo para estudiar la remodelación del tejido adiposo blanco inducida por la caquexia. Revista de Experimentos Visualizados. (167), doi: 10.3791/61853 (2021).

Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares derivadas de adipocitos humanos mediante filtración y ultracentrifugación. Revista de Experimentos Visualizados. (170), doi: 10.3791/61979 (2021).

Discussion

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Caracterizada por un aumento en la masa del tejido adiposo (AT) y la remodelación proinflamatoria de las células inmunes AT, la obesidad se ha convertido en un importante problema de salud pública mundial, ya que aumenta drásticamente el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, diabetes tipo 2 y enfermedades hepáticas. Por lo tanto, explorar la estructura y función de la TA se ha convertido en un desafío clínico importante. En esta colección de métodos, presentamos varios métodos de vanguardia desarrollados para investigar la estructura y función de la TA en condiciones fisiológicas y patológicas.

La TA es un tejido heterogéneo compuesto por varias poblaciones celulares, incluidos los adipocitos maduros, las células progenitoras adiposas (APC), los progenitores fibroinflamatorios (FIP), las células endoteliales y las células inmunitarias. Por lo tanto, para caracterizar este tejido, se puede realizar un fenotipado de células individuales. En sus artículos, Cho et al. y Peics et al. proporcionan protocolos para aislar y caracterizar APC residentes en AT blanco de ratón mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)1,2. Este paso es fundamental no solo para contar el número de APC residentes, que es un factor importante para determinar la capacidad de expansión de AT, sino también para explorar más a fondo la función de estas células a nivel de una sola célula. Peics et al. también proporcionan un método para aislar FIP2 residentes en AT blanco de ratón, células productoras de colágeno no adipogénicas que pueden contribuir al desarrollo de un fenotipo proinflamatorio que se sabe que desempeña un papel en la disfunción de AT. De manera similar, Estrada-Gutiérrez et al. describen un protocolo para aislar simultáneamente adipocitos maduros viables y células de fracción vascular estromal de biopsias de AT visceral humana3. En conjunto, estos protocolos son el estándar de oro para generar una suspensión de una sola célula a partir de AT humano y de ratón, que es el primer paso crítico para contar y fenotipar funcionalmente las diferentes subpoblaciones de células AT.

La relación entre la estructura y la función es muy relevante en TA. Un sello distintivo de la disfunción de la TA durante la obesidad está relacionado con el aumento del tamaño de los adipocitos y una profunda remodelación de la TA. Esta remodelación afecta no solo a las poblaciones de adipocitos y células inmunes, sino también a la red linfática y de vasos sanguíneos. Para apreciar estas alteraciones en todo el TA, Gilleron et al. desarrollan un protocolo de aclarado de TA muy simple, económico y rápido4. Este protocolo sencillo visualiza tridimensionalmente la morfología de las biopsias de TA de ratón completo y de AT humano grande. Esto incluye las redes neuronales y vasculares, los adipocitos y la distribución innata y adaptativa de las células inmunitarias, que son parámetros importantes para estudiar en la obesidad y sus patologías asociadas. Para caracterizar el impacto de la obesidad en los vasos linfáticos y sanguíneos de AT, Czepielewski et al. proporcionan un método in vivo para teñir simultáneamente la arborización linfática y los vasos sanguíneos mediante la inyección de lectinas conjugadas con fluorocromo5. Este protocolo proporciona una forma de analizar la morfología in vivo de ambas redes, incluida su densidad, volumen y ramificación. Curiosamente, la combinación de esta estrategia de etiquetado con un procedimiento de limpieza de AT4 permite un mapeo de alta resolución de todo el AT del mouse en tres dimensiones (3D) 5. En conjunto, estos enfoques pueden caracterizar la estructura de la TA en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas, obteniendo información sobre la correlación entre la estructura y la función de la TA.

Debido a su alta heterogeneidad y tremenda capacidad de remodelación, analizar la función de los adipocitos dentro de AT in vivo no es simple, por lo que se han desarrollado varios sistemas de cultivo. La principal ventaja de todos estos sistemas de cultivo celular es el alto nivel de control sobre la población celular y el microambiente. Jager et al. desarrollan un protocolo simple para manipular la expresión de ARN en adipocitos maduros diferenciados 3T3-L16. Aunque este sistema de cultivo está lejos de las condiciones fisiológicas ideales, los adipocitos 3T3-L1 siguen siendo funcionales con respecto a la señalización de insulina, la captación de glucosa, la lipogénesis y la lipólisis. Por lo tanto, este protocolo proporciona una poderosa herramienta para manipular la expresión de proteínas y ARN no codificante y estudiar su papel en las funciones de los adipocitos. Para acercarse a las condiciones fisiológicas ideales, Poret et al. describen un método para generar adipocitos maduros funcionales mediante el uso de células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) obtenidas del macaco rhesus AT7. Este protocolo explica cómo aislar las ADSC primarias y cómo inducir su proliferación y diferenciación. Los autores sugieren además que este procedimiento puede adaptarse a otras especies. Aunque este sistema de cultivo está más cerca de las condiciones fisiológicas ideales en comparación con la línea celular 3T3-L1, los adipocitos maduros derivados de las ADSC primarias se cultivan en 2D, que es diferente de in vivo. Para hacer frente a este problema, Batista Jr. et al. proporcionan un protocolo eficiente para un sistema de cultivo de tejidos de impresión tridimensional8. En este trabajo, los autores generan adiposferoides a partir de células de fracción vascular estromal de ratón y diferencian los precursores de adipocitos directamente dentro de este sistema de cultivo 3D. Este enfoque está irrevocablemente más cerca de las condiciones fisiológicas ideales que el método de cultivo 2D, pero se debe tener en cuenta la falta de vasos que puedan llevar nutrientes a los adipocitos en el centro de los esferoides. La modulación de la expresión de proteínas y ARN no codificantes, como se describe6, dentro de estos sistemas de cultivo puede conducir a una mayor comprensión del papel funcional de estos objetivos en adipocitos fisiológicamente más relevantes. Sin embargo, aún no se ha establecido un sistema tan complejo. El mayor interés de estos sistemas de cultivo ex vivo/in vitro es el alto nivel de control sobre el microambiente, que también incluye los factores secretados por las células. En este sentido, el protocolo de Akbar et al. aísla y caracteriza las vesículas extracelulares (EV) secretadas por los adipocitos humanos9. Recientemente, se descubrió que los vehículos eléctricos son importantes reguladores metabólicos; este método es obligatorio para analizar el impacto metabólico de estas VE derivadas de adipocitos en diferentes situaciones metabólicas.

En la presente colección de métodos, ofrecemos una descripción general de los protocolos de vanguardia que cubren varios aspectos del análisis de TA, incluidos los sistemas de cultivo ex vivo e in vitro , la exploración de tejidos completos en 3D y el análisis de células individuales. Aunque ningún sistema de cultivo es perfecto, es importante elegir el sistema de cultivo que se adapte a la cuestión biológica. Por lo tanto, esta colección de métodos proporciona una gran caja de herramientas de procedimientos para aislar, diferenciar y manipular adipocitos in vitro. La combinación de todos los diferentes métodos descritos aquí conducirá a una comprensión de la morfología y la función de AT.

Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgements

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Los autores agradecen a Jean-François Tanti y Mireille Cormont por su apoyo científico y sus aportaciones. Este trabajo ha contado con el apoyo del INSERM, de la Université Côte d'Azur, y de subvenciones de la Agencia Nacional de Investigación (ANR) a través de las Inversiones para el Futuro Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), el programa UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01), y el Programa de Jóvenes Investigadores a J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON) y a J.J. (ANR-20-CE14-0010-01).

References

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  1. Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. Journal of Visualized Experiments. (162), e61694(2020).
  2. Peics, J., et al. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (162), e61610(2020).
  3. Estrada-Gutierrez, G., et al. Isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for RNA analysis and macrophage phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (164), e61884(2020).
  4. Gilleron, J., et al. Exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3D imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).
  5. Czepielewski, R. S., et al. Lymphatic and blood network analysis during obesity. Journal of Visualized Experiments. (165), e61814(2020).
  6. Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. An adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-RNA modulation on adipocyte function. Journal of Visualized Experiments. (171), e61925(2021).
  7. Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61732(2021).
  8. Batista, M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Three-dimensional adipocyte culture as a model to study cachexia-induced white adipose tissue remodeling. Journal of Visualized Experiments. (167), e61853(2021).
  9. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).

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