No aplicable
Artículo de método
14 de julio de 2023
No aplicable
Cubriendo ~ 40% del cuerpo humano, el músculo esquelético es un órgano importante que apoya funciones críticas desde el movimiento hasta la respiración y el metabolismo. Es importante destacar que tiene una capacidad única para autorrepararse después de una lesión y con esta capacidad regenerativa garantiza una recuperación funcional y estructural completa de daños graves en menos de un mes. Varios tipos de células se han implicado en esta notable capacidad de reparación, y las células madre musculares tienen un papel central.
Los investigadores musculares de todo el mundo han desarrollado varios ensayos para analizar el músculo esquelético a nivel funcional, molecular y celular. Cada técnica tiene sus propias fortalezas, y las pruebas in vivo en modelos animales representan la opción con mayor relevancia para los humanos y la complejidad de los organismos vivos. Las contrapartes in vitro y ex vivo están ganando terreno a medida que los grupos de investigación de todo el mundo se esfuerzan por minimizar la investigación con animales en vista del principio de Reemplazo-Reducción-Refinamiento (3R) reconocido internacionalmente. Esta colección de métodos tenía como objetivo proporcionar modelos in vivo y ex vivo para estudios musculares moleculares, celulares y funcionales en todas las especies.
Montandon et al.1 describen técnicas para caracterizar rápidamente los fenotipos de regeneración muscular en pez cebra de genotipos control y mutantes. Primero, los embriones se genotipan utilizando material que se sacude de animales anestesiados. Esta es una perspectiva emocionante ya que la mayoría de los protocolos que involucran el genotipado de embriones modificados genéticamente requieren un sacrificio simultáneo del embrión. A continuación, la regeneración se induce apuñalando una región específica de la musculatura de la larva del pez cebra. Gracias a las propiedades ópticas del sarcómero, la integridad del músculo lesionado se puede evaluar mediante imágenes posteriores a la lesión. Este protocolo es de gran interés para los científicos que estudian la regeneración muscular, ya que es un método rápido y potencialmente de alto rendimiento para investigar diferentes mutantes en busca de defectos regenerativos.
Hüttner et al.2 y Pegoli et al.3 presentan un método que permite estudios celulares y moleculares de células madre musculares, la población celular en el núcleo de la regeneración muscular. El método es muy interesante para los investigadores que se centran en estudios de activación temprana e interacciones célula-nicho. El método de cultivos de miofibras individuales permite cultivar y estudiar células madre musculares hasta 96 h mientras aún están asociadas con las fibras musculares, recibiendo señales de este nicho endógeno próximo. La técnica es particularmente difícil de establecer debido a los muchos pasos delicados que Hüttner et al.2 explican cuidadosamente (por ejemplo, disección y disociación muscular suave). Yendo un paso más allá, los autores detallan la orientación del ARNip para los análisis funcionales de los factores que pueden influir en el comportamiento de las células madre, y subrayan la importancia de comparar las células transfectadas con ARNip con las transfectadas de control del mismo ratón y músculo. Paralelamente, Pegoli et al.3 describen cómo se puede ajustar este método para estudiar las células madre musculares en el contexto de la distrofia muscular de Emery-Dreifuss y la vida postnatal temprana, centrándose en los desafíos relacionados con la fragilidad muscular en este contexto. Para aumentar la eficiencia del protocolo, guían a los lectores con imágenes de fibras con buena y mala supervivencia y destacan la necesidad de "validar empíricamente" el tiempo de digestión.
Zaidan et al.4 describen un sistema de cultivo ex vivo del músculo esquelético que favorece la producción de células de reserva de tipo quiescente, al tiempo que mantiene una serie de otros tipos de células, ambos presentando desafíos bajo sistemas de cultivo alternativos. Por lo tanto, este método puede ser útil para investigadores orientados a estudios de inactividad o interacciones de nicho-células madre, incluso en condiciones que modifican las vías moleculares utilizando fármacos, siRNAs o vectores. El protocolo implica una disección rápida de los músculos de las extremidades posteriores, seguida de digestión enzimática y filtración. Posteriormente, las células se colocan en cultivo, con la aparición de células de reserva en una semana. El protocolo permite la amplificación a gran escala de estas células de reserva, con la posibilidad de obtener imágenes de células vivas utilizando ratones marcados genéticamente, como Pax7nGFP.
Park et al.5 demuestran cómo se pueden medir el nitrato y el nitrito en el músculo esquelético, uno de los principales órganos de almacenamiento de nitrato. El método descrito es de particular interés para los investigadores que estudian la fisiología del ejercicio y los trastornos neuromusculares o metabólicos relacionados con el ciclo del óxido nítrico. Aunque existe un desarrollo tecnológico significativo para facilitar las mediciones de nitratos y nitritos, hay varios parámetros que pueden afectar el resultado final y son cuidadosamente descritos y comparados por los autores (por ejemplo, método de homogeneización, tamaño de la biopsia, tipo de músculo).
Hessel et al.6 describen con gran detalle un procedimiento para tomar biopsias del músculo tibial anterior de pacientes humanos con el fin de obtener fibras de longitud suficiente para experimentos mecánicos. Los autores enfatizan que se deben excluir los pacientes con daño reciente en el músculo. Una vez que se toma el consentimiento informado de los pacientes elegibles, se utiliza la ecografía para evaluar el mejor sitio del músculo para la recolección de la biopsia. Después de discutir la ruta de inyección ideal, el equipo realiza la biopsia con una aguja especializada. Finalmente, se detallan los métodos de procesamiento de tejidos y atención postoperatoria del paciente. Este método es de particular interés para los médicos-científicos, que desean estandarizar la recolección de tejido de los pacientes para estudios mecánicos de las fibras musculares.
En esta Colección de Métodos, se presentan estudios mecánicos de Brightwell et al.7 y Corona et al.8. Estos artículos discuten métodos para medir la fuerza en modelos animales pequeños y grandes. La enfermedad o lesión neuromuscular afecta negativamente la fuerza muscular; por lo tanto, el ejercicio, la nutrición y las intervenciones terapéuticas tienen como objetivo restaurarlo. Brightwell et al.7 detallan un método para evaluar la función del músculo cuádriceps en ratones de manera análoga a los métodos utilizados en pacientes humanos. Primero, proporcionan pasos para preparar el equipo y el software necesarios para el experimento. A continuación, se anestesia el ratón y se coloca en posición para evaluar la función extensora. Los electrodos se colocan en la parte distal del cuádriceps para la inducción de la contracción, se evalúa una corriente óptima y se registran y analizan las mediciones del par tetánico isométrico máximo. Utilizando un modelo animal más grande, Corona et al.8 evalúan el torque isométrico en el músculo dorsiflexor de las extremidades posteriores de cerdo, mostrando la configuración paso a paso del equipo y el protocolo de medición de la fuerza. Cabe destacar que muestran frentes de onda de alta y baja calidad para garantizar una adquisición óptima de resultados. Reconocen las fortalezas de esta técnica no invasiva que permite análisis longitudinales del mismo animal, pero también discuten en detalle los pasos críticos (por ejemplo, estimulación nerviosa, alineación mecánica) y las limitaciones del método.
Todavía hay muchas preguntas pendientes en el campo de la investigación del músculo esquelético: qué genes son cruciales para la regeneración muscular, cómo las células satélite mantienen el potencial regenerativo a lo largo de la vida de tantos organismos diferentes y cómo se ve afectada la función muscular en diferentes enfermedades. Esta colección muestra una serie de técnicas modernas para investigar la función y reparación muscular a nivel molecular y mecánico, utilizando una amplia gama de sistemas modelo. Al proporcionar protocolos detallados, los autores de estos artículos ya han ayudado a aumentar la consistencia y la transparencia para la investigación básica y aplicada del músculo esquelético.
Los autores no tienen nada que revelar.
Ningún financiamiento externo apoyó este trabajo.
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