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Todos los organismos multicelulares de la tierra, incluidos los animales y las plantas, evolucionaron a partir de eucariotas unicelulares hace ~ 1.7 mil millones de años1. A diferencia de los procariotas primitivos, las células eucariotas tienen un núcleo unido a la membrana y muchos orgánulos encerrados en la membrana dentro de su citoplasma, incluidas las mitocondrias, el aparato de Golgi, el retículo endoplásmico (RE), los lisosomas y las vesículas. Estos orgánulos forman compartimentos en los que se localizan funciones biológicas especializadas y actividades metabólicas altamente eficientes. Debido a la resolución limitada de la microscopía óptica, la mayoría de los orgánulos intracelulares contienen estructuras funcionales que caen por debajo del límite de difracción de luz, lo que dificulta su visualización2. Las técnicas innovadoras de etiquetado microscópico y biológico están comenzando a permitir la visualización de alta resolución de arquitecturas ultrafinas y la dinámica in vivo de orgánulos. Esta colección reúne métodos recientes que han etiquetado y obtenido imágenes con éxito de diferentes orgánulos intracelulares en diferentes especies y, por lo tanto, han mejorado nuestra comprensión de la regulación espaciotemporal de la biología de los orgánulos.
En las últimas décadas, el desarrollo de sensores fluorescentes y el etiquetado de proteínas en células vivas han facilitado enormemente nuestra comprensión de la dinámica de las redes intracelulares, la transducción de señales y las interacciones célula-célula. Mediante el uso de métodos sintéticos inorgánicos avanzados, los nanocristales semiconductores fluorescentes con tamaño a nanoescala, también conocidos como puntos cuánticos o QD, se han inventado como una nueva clase de reporteros ópticos. Normalmente, las partículas QD tienen un tamaño de 2 a 10 nm y tienen alta fotosensibilidad, estabilidad y baja citotoxicidad para las células. Las partículas QD han surgido como alternativas a los colorantes orgánicos y las proteínas fluorescentes para obtener imágenes de procesos intracelulares en alta resolución. En el protocolo de Aishwarya et al., los autores describen el inmunomarcaje mediado por QD seguido de imágenes con microscopía electrónica de transmisión (TEM)3. Al realizar el etiquetado QD dirigido a anticuerpos y la obtención de imágenes bajo TEM a superresolución, los autores visualizaron con éxito la localización de Sigmar1 en múltiples orgánulos celulares en células cardíacas de ratones adultos y destacaron su enriquecimiento en los lisosomas y las membranas mitocondriales. Además de enfatizar la alta resolución y la alta sensibilidad de QD-TEM, los autores también mencionan varios inconvenientes de los métodos. Por ejemplo, el tetróxido de osmio utilizado en el inmunomarcaje mediado por QD destruye irreversiblemente las propiedades de la muestra, y la optimización de los pasos de fijación y desenmascaramiento de antígenos es un elemento clave pero desafiante para garantizar imágenes de alta calidad.
Además de QD, se han aplicado con éxito muchos otros colorantes diferentes para etiquetar orgánulos en células vivas. Estos métodos han facilitado la obtención de imágenes en vivo del proceso de transformación o translocación de orgánulos celulares in vivo. A veces, se utilizan múltiples colorantes específicos de orgánulos para visualizar diferentes tipos de orgánulos simultáneamente. En el protocolo de Liu, Li et al.4, los autores proporcionan un protocolo detallado para la tinción en vivo y la obtención de imágenes de mitocondrias y lisosomas en células de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) mediante el uso de dos colorantes diferentes: MitoTracker Green y LysoTracker Red4. En este estudio, ambos colorantes mostraron una alta sensibilidad fluorescente y estabilidad específica para mitocondrias y lisosomas, respectivamente. Además, los autores observaron y registraron con éxito el proceso celular crítico in vivo de la mitofagia inducida por cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) en células MEF utilizando el protocolo. En la discusión, los autores mencionan que el protocolo se puede aplicar con diferentes líneas celulares o células de tejidos optimizando la concentración de colorante y el tiempo de tinción.
Al hacer uso de construcciones reporteras compuestas de proteínas específicas de orgánulos fusionadas con etiquetas fluorescentes, se puede observar la dinámica y los patrones de expresión de orgánulos in vivo sin inmunomarcado. En el protocolo de Liu, Zhu et al.5, los autores proporcionan un protocolo detallado para obtener imágenes de la mayoría de los tipos de orgánulos subcelulares en la levadura viva en ciernes, Saccharomyces cerevisiae5. Para los principiantes que trabajan con levadura en ciernes, este protocolo es útil para aprender a identificar la localización subcelular de proteínas y rastrear orgánulos de interés mediante imágenes de lapso de tiempo. Una limitación del protocolo es que la mayoría de las construcciones utilizadas en el protocolo no se pueden usar para etiquetar orgánulos en otras especies. Para diferentes tipos de células eucariotas, los patrones específicos de orgánulos de proteínas fluorescentes aún tendrían que validarse mediante inmunotinción de anticuerpos.
Primero se desarrolló un ensayo de captación de anticuerpos para el etiquetado vivo específico de la señalización endosomal Notch / Delta en los precursores de órganos sensoriales de Drosophila notum6. Debido a la naturaleza sensible a la dosis de la señalización Notch / Delta, la expresión de una construcción reportera dentro de las células no es adecuada para visualizar la señalización Notch / Delta in vivo, ya que una copia adicional del gen fusionado con reportero interrumpiría la señalización normal y, a su vez, el destino celular. En el protocolo de Zhao y Guo7, los autores aplican el ensayo de captación de anticuerpos para obtener imágenes del tráfico endosómico Notch / Delta en los progenitores de la glía radial del cerebro del pez cebraen desarrollo 7. En el protocolo, después de microinyectar el anticuerpo conjugado anti-DeltaD-Atto647N con precisión en el ventrículo embrionario del rombencéfalo de 24 hpf (horas después de la fertilización), todo el proceso de tráfico endosómico se registra utilizando el anticuerpo anti-DeltaD-Atto647N internalizado a lo largo de la mitosis de los progenitores de la glía radial. En el estudio, se encontró que el ensayo de captación de anticuerpos no interfirió con la señalización Notch / Delta. Este protocolo se puede utilizar para visualizar otra señalización ligando-receptor de membrana, dado que se dispone de un anticuerpo contra el dominio extracelular de la proteína de interés.
Los desarrollos recientes en microscopía de expansión (ExM), que implican la expansión física de la muestra dentro de un hidrogel hinchable, han permitido que los microscopios confocales convencionales se utilicen para obtener imágenes de súper resolución. Desde su invención, ExM ha sido probado con muchos tipos diferentes de muestras biológicas8. Uno de los principales desafíos de ExM es la pérdida de señal fluorescente durante los pasos de polimerización y digestión. El ExM de retención de etiquetas recientemente desarrollado ha resuelto el problema con anclajes trifuncionales9. En el protocolo de Park et al.10, los autores describen cómo realizar ExM de retención de etiquetas (LR-ExM) con un conjunto de anclajes trifuncionales10. El protocolo mejora las imágenes de microscopía de expansión no solo al evitar la pérdida de señal, sino también al promover el etiquetado de alta eficiencia con etiquetas SNAP o CLIP. En su estudio, los autores demostraron con éxito LR-ExM multicolor para una variedad de estructuras subcelulares y lograron una resolución molecular única al combinar LR-ExM con microscopía de reconstrucción óptica estocástica de superresolución (STORM).
Con el rápido desarrollo de la microscopía de superresolución y el advenimiento de nuevas técnicas de etiquetado fluorescente, podemos anticipar nuevas mejoras en los métodos y protocolos para visualizar orgánulos intracelulares con una resolución sin precedentes. Estos esfuerzos están preparados para traer nuevos avances en la comprensión de la dinámica y las funciones de los orgánulos intracelulares.