Se presenta un sistema para adquirir datos de sesiones de comportamiento individual autoiniciadas dentro de un entorno de jaula de colonia social. La eficacia de este sistema se demuestra utilizando una evaluación automatizada de alcance experto, que permite la caracterización de las alteraciones motoras posteriores al accidente cerebrovascular, las posibles alteraciones del comportamiento relacionadas con la motivación, las variaciones circadianas y otras variables dependientes innovadoras.
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Artículo de método
Recopilación de datos de comportamiento de ratas autoiniciadas para caracterizar los déficits posteriores a un accidente cerebrovascular
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Resumen
Resumen
Las pruebas de comportamiento en modelos de ratas se utilizan con frecuencia para diversos fines, incluida la investigación psicológica, biomédica y conductual. Muchos enfoques tradicionales implican sesiones de prueba individuales e individuales entre un solo investigador y cada animal en un experimento. Esta configuración puede llevar mucho tiempo para el investigador, y su presencia puede afectar a los datos de comportamiento de formas no deseadas. Además, el enjaulamiento tradicional para la investigación con ratas impone una falta de enriquecimiento, ejercicio y socialización que normalmente sería típica de la especie, y este contexto también puede sesgar los resultados de los datos de comportamiento. Superar estas limitaciones puede valer la pena para varias aplicaciones de investigación, incluido el estudio de la lesión cerebral adquirida. Aquí, se presenta un método de ejemplo para entrenar y probar automáticamente el comportamiento individual de ratas en una jaula de colonia sin la presencia de humanos. La identificación por radiofrecuencia se puede utilizar para adaptar las sesiones a cada rata. La validación de este sistema se produjo en el contexto del ejemplo de medición del rendimiento motor de las extremidades anteriores antes y después de un accidente cerebrovascular. Se miden las características tradicionales de las alteraciones conductuales posteriores a un accidente cerebrovascular y las nuevas medidas habilitadas por el sistema, incluida la tasa de éxito, varios aspectos de la fuerza de tracción, el análisis de combates, la tasa y los patrones de inicio, la duración de la sesión y los patrones circadianos. Estas variables se pueden recopilar automáticamente con pocas limitaciones; Aunque el aparato elimina el control experimental de la exposición, el tiempo y la práctica, la validación produjo una consistencia razonable en estas variables de un animal a otro.
Introducción
El entrenamiento conductual y las pruebas con modelos de ratas son importantes en innumerables áreas de investigación, desde la exploración de los procesos cognitivos hasta los estados de enfermedady más. Por lo general, este entrenamiento y pruebas se llevan a cabo con animales individuales en sesiones individuales, con un investigador retirando manualmente al animal de su jaula doméstica y colocándolo temporalmente en algún tipo de aparato. Desafortunadamente, existen varias dificultades y limitaciones con este enfoque. En primer lugar, las pruebas de comportamiento pueden llevar una gran cantidad de tiempo para los investigadores, y cuando es necesaria la formación, ese requisito de tiempo se vuelve aún mayor. En segundo lugar, este enfoque afecta automáticamente -o incluso potencialmente confunde- a los datos adquiridos, como se ha establecido en otro lugar2. Estos factores de confusión son especialmente notables cuando se consideran las variables relacionadas con el enriquecimiento. Específicamente, las ratas de laboratorio se alojan tradicionalmente en jaulas pequeñas que son lo suficientemente grandes para una o dos ratas, y si no se les proporcionan ruedas para correr, pueden pasar toda la vida sin oportunidades significativas para hacer ejercicio. Además, la vivienda aislada puede ser una fuente importante de estrés en una especie social como la rata4. Es probable que algunos de estos inconvenientes relacionados con el bienestar afecten a la fisiología de las ratas 5,6, lo que puede impedir el desarrollo de la expresión conductual típica de la especie4 e impactar en la calidad de los modelos de roedores aplicados a contextos humanos.
Los investigadores han buscado varios tipos de soluciones a estos problemas en los últimos años. El tipo de solución más simple ha sido automatizar las pruebas de comportamiento y el entrenamiento 7,8,9,10, eliminando así el requisito de que un solo investigador atienda a un solo animal. Una solución adicional ha sido automatizar la transferencia de animales a las cámaras experimentales11,12, eliminando aún más la necesidad de la participación humana. Por último, se han explorado varias configuraciones que permiten alojar a los animales en jaulas en colonias con otros animales y con más espacio para la exploración y el enriquecimiento13. A pesar de estas ventajas, estas configuraciones de colonias pueden limitar o complicar los esfuerzos para recopilar datos de comportamiento diferenciados individualmente (aunque véanse los esfuerzos para usar la visión artificial)14,15. Si se requieren datos de comportamiento individual, puede ser más difícil o complejo identificar y recuperar animales de las jaulas de las colonias para las sesiones de comportamiento. En la actualidad, existen pocos sistemas para recolectar datos de comportamiento individual de colonias (enriquecidas) que albergan 16,17,18.
Estos inconvenientes pueden afectar específicamente la investigación sobre los efectos conductuales de las lesiones cerebrales adquiridas. En primer lugar, está claro que la presencia y/o el sexo de los humanos, así como las prácticas de manipulación, afectan el comportamiento de los roedores 2,19, y estas variables pueden afectar diferencialmente el comportamiento de las ratas antes de frente a las ratas 2,19. después de un derrame cerebral. En segundo lugar, los resultados del comportamiento humano después de un accidente cerebrovascular pueden empeorar si disminuyen voluntariamente el compromiso con la dosis recomendada de ejercicios de rehabilitación20. Actualmente, los experimentos con roedores tienden a no modelar este tipo de contexto, porque las ratas no son libres de elegir participar o abstenerse de sesiones de comportamiento.
Este artículo presenta un protocolo diseñado para facilitar las pruebas de comportamiento individual en el marco del enjaulamiento en colonias enriquecidas. Este enfoque no solo aborda las limitaciones de las prácticas actuales, sino que también abre vías para la exploración de medidas innovadoras. Se ha desarrollado un torniquete para una rata (ORT) que se puede fijar a la jaula de una colonia, lo que permite a los animales entrar en las cámaras de comportamiento de forma independiente e iniciar sus propias sesiones de entrenamiento y pruebas. El sistema es asequible; cada ORT se puede ensamblar a bajo costo (dado acceso a una impresora 3D). En el pasado, la validación de este sistema se llevó a cabo utilizando una cámara operante básica, demostrando que los animales podían ser entrenados consistentemente para realizar una simple presión de palanca operante sin la presencia de un experimentador16. Sin embargo, la cuestión de si esta configuración es aplicable a otros escenarios sigue sin resolverse. El objetivo es validar la efectividad de la configuración de jaula de colonias ORT, que se estableció previamente, para entrenar y cuantificar el comportamiento de alcance hábil relevante para el deterioro motor después de un accidente cerebrovascular. La configuración se utilizó para generar nuevas variables que normalmente no se exploran en la investigación del ictus. Estas variables incluyen métricas de rendimiento para la tarea de alcance calificado y mediciones de autoiniciación, que podrían ser pertinentes para la motivación y la toma de decisiones. Además, se detectaron eficazmente los cambios inducidos por el accidente cerebrovascular en los patrones circadianos de autoinicio diario a lo largo de todo el período de 24 horas.
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Protocolo
Todos los procedimientos y el cuidado de los animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Norte de Texas (IACUC) y se adhirieron a la guía de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Las ratas Long-Evans macho y hembra adultas (400-800 g, 1,5 años de edad), utilizadas en el presente estudio, se alojaron en jaulas de colonia.
1. Preparación del equipo
- Obtenga o ensamble el torniquete de una rata (ORT) de acuerdo con los archivos de diseño y las instrucciones de construcción (consulte el Archivo Complementario 1 y el Archivo de codificación Suplementario 1). Consulte Butcher et al.16 para obtener más detalles.
NOTA: Las ORT son específicas para el tamaño de la rata, por lo que una jaula de colonia debe incluir animales que tengan aproximadamente el mismo tamaño. Si uno no desea autoensamblar los ORT, se pueden comprar preensamblados (ver Tabla de Materiales). - Obtener y conectar un lector de identificación por radiofrecuencia (RFID, ver Tabla de Materiales) y obtener e inyectar a los animales etiquetas RFID.
NOTA: Al inyectar etiquetas RFID full duplex (FDX), la orientación debe ser perpendicular a la antena RFID a medida que la rata camina a través del ORT. En esta validación, los papillos se implantaron por vía subcutánea entre el omóplato en un plano paralelo a la columna vertebral. - Fije la antena RFID al tubo del ORT.
- Construir y/o obtener el/los aparato(s) conductual(es) y la jaula de colonias apropiadas para la pregunta experimental. En este ejemplo, se utilizó una jaula de colonia21,22 hecha a medida junto con cámaras operantes disponibles comercialmente (ver Tabla de Materiales), aunque teóricamente se podría usar cualquier equipo.
NOTA: Se debe considerar la competencia de los animales alojados en colonias para acceder a los aparatos conductuales a través de la ORT. Anticipe la necesidad de un aparato de comportamiento ORT + por cada 4 a 6 animales. - Coloque la(s) ORT(s) entre el aparato conductual y la jaula de la colonia.
- Corta un agujero de portal en el aparato conductual y en la jaula de las colonias con una herramienta rotativa Dremel (consulta la Tabla de materiales) o un instrumento similar. El diámetro interno debe ser igual al diámetro exterior del túnel ORT construido.
NOTA: La ORT debe elevarse unas pulgadas para funcionar, por lo que se necesitará una pequeña plataforma o soporte para alinear las alturas de la jaula de la colonia y del aparato. - Instalar un sistema RFID para leer a los animales a su paso por la ORT y, si se desea, integrarlo con el aparato conductual.
2. Entrenamiento conductual prequirúrgico
- Obtenga una cohorte de ratas del mismo tamaño e introdúzcalas en la jaula de la colonia.
NOTA: Los animales que han sido criados o alojados extensamente en aislamiento o con pocos congéneres pueden tener más problemas para explorar la cámara, especialmente cuando implica atravesar áreas sociales de la jaula de la colonia. Los animales deben ser expuestos a jaulas grupales temprano en la vida para evitar este escollo. - Elimine el acceso a cualquier manipulanda dentro del aparato de comportamiento y configure la cámara para que entregue recompensas automáticamente cada 60 s, en promedio, cuando esté ocupada.
NOTA: Este estudio utilizó agua de sacarosa (30% a 40%) como recompensa, pero la leche condensada azucarada también es efectiva. - Entrene a todas las ratas para que ingresen regularmente a los aparatos conductuales a través de la ORT.
- Al menos una vez al día, verifique los datos para asegurarse de que todos los animales ingresen a la TRO. Si los animales no están entrando, inserte un objeto del tamaño de un bolígrafo en el mecanismo de bloqueo para evitar que se bloquee temporalmente y permitir que los animales exploren más libremente. Si los animales aún no ingresan, retire el torniquete y coloque una pared lateral temporal para permitir el acceso libre del túnel a la cámara.
- Una vez que todos los animales ingresen regularmente a la cámara, devuelva la cerradura (y el torniquete) y vuelva a evaluar.
NOTA: Los animales también pueden ocupar la ORT y la cámara como un respiro temporal de otras ratas. Una forma de evitar este tipo de monopolización de la cámara es conectar un ORT adicional que se conecte a una cámara de aislamiento simple. - Introduzca el manipulándum (el tirador, en este caso de ejemplo) y ajústelo a la sensibilidad más alta. Inserte el asa justo dentro de la caja (hasta 2 cm) o justo fuera de la caja.
NOTA: La cinta de pintor puede evocar intentos de alcance si se coloca en la parte posterior del mango, justo fuera de su alcance. - Reduzca la frecuencia con la que la recompensa (es decir, 30% de agua con sacarosa) se administra automáticamente (por ejemplo, cada 90-120 s). Recuerde que se puede utilizar cualquier recompensa que se adapte a las necesidades del experimentador y a las preferencias de los animales.
- Verifique los datos diariamente para asegurarse de que todos los animales hayan aprendido a activar la palanca. Ceba la palanca y/o cambie el nivel de inserción hasta que todos los animales estén tirando.
- Suspenda la entrega automática de recompensas para que solo estén disponibles a través de la activación de la manija de extracción.
- Si se ha insertado previamente, retraiga la palanca cada día (siempre que todas las ratas continúen tirando a ese nivel de retracción) de 0,25 mm a 0,5 mm hasta que la palanca esté en su posición final, de 1 cm a 1,25 cm fuera de la cámara.
NOTA: La posición exacta de la palanca depende del tamaño de las ratas. Asegúrese de elegir una posición que dé como resultado la topografía de alcance deseada. - Inicie un percentil u otro programa de entrenamiento para aumentar progresivamente las fuerzas de tracción requeridas para activar el mango.
NOTA: En este estudio se utilizó un programa de percentiles que establece el criterio de refuerzo en el cuartil superior de las 15 respuestas anteriores. Alternativamente, se pueden utilizar aumentos escalonados del criterio de atracción7. - Una vez que los animales alcancen de manera confiable el rango de criterio final de 120 g de tirones, retire el programa de entrenamiento de percentiles y fije el criterio para la activación del mango en una constante de 120 g.
- Recopile datos de referencia en este requisito de fuerza hasta que las tasas de éxito hayan sido estables (sin tendencia) durante aproximadamente una semana.
3. Inducción de un accidente cerebrovascular
- Inducir quirúrgicamente el accidente cerebrovascular en todos los animales enjaulados de la colonia al mismo tiempo.
NOTA: Para inducir el accidente cerebrovascular se utilizó un modelo endoteliano-1 de accidente cerebrovascular, que se ha descrito en otro lugar23. - Permita que los animales se recuperen en jaulas tradicionales, aislados individualmente, durante 3-7 días.
4. Pruebas conductuales postquirúrgicas
- Después de la recuperación, regrese a los animales a la jaula de la colonia con el aparato de alcance experto conectado a ORT.
- Realice la prueba de comportamiento, manteniendo los requisitos de tracción al final de 120 g (siga el paso 2) hasta que se recopilen datos suficientes para evaluar los déficits posteriores al accidente cerebrovascular (de uno a varios días).
- Implemente cualquier variable independiente relacionada con el accidente cerebrovascular o la recuperación durante los días posteriores mientras los animales acceden a la cámara.
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Resultados
Los animales fueron entrenados y probados con cuatro ratas hembras en una jaula de colonia y cuatro ratas macho en una jaula de colonia separada. Todas las ratas aprendieron a pasar a través de las ORT en cuatro días o menos. Las cuatro ratas hembras alcanzaron un >85% de éxito en los combates con el requerimiento de fuerza de 120 g en aproximadamente 6 semanas de entrenamiento y las ratas macho alcanzaron el mismo criterio en 10 semanas (en comparación con aproximadamente 3 semanas con el entrenamiento estándar con r...
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Discusión
Este protocolo tiene múltiples usos. En primer lugar, y en términos más generales, la ORT se desarrolló con el propósito de permitir el entrenamiento conductual automatizado de un solo sujeto y la recopilación de datos en el contexto de la vivienda social enriquecida. Si bien este estudio probó la idea de recopilar medidas conductuales típicas y elaborarlas en el contexto del accidente cerebrovascular, se puede hacer lo mismo con otras aplicaciones y tareas conductuales. Incluso las medidas recogidas en esta validación t...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado en parte por la Fundación Beatrice H. Barrett para la investigación de las relaciones neurooperantes de la Universidad del Norte de Texas (UNT). Agradecemos el aporte y la asistencia de todos los miembros del Laboratorio de Neuroplasticidad y Reparación, especialmente a Valerie Rojas, Mary Kate Moore, Cameron Scallon y Hannah McGee.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Impresora 3D | Consulte con el espacio de fabricación local | ||
| perno | Boltdepot | 1346 | 6-32 o 8-32 by 0.5" |
| bolt Boltdepot | 1348 | 6-32 o 8-32 by 0.75" | |
| bisagra de puerta | XJS (Amazon) | 43398-16234 | Gabinete de 1" juego de bisagras de puerta de acero inoxidable; Opcional (si no está impreso "bisagra perfecta") |
| taladro | Cualquier taladro eléctrico funciona | ||
| muelle de extensión | Nieko (Amazon) | 50456A | Elija y ajuste el muelle en función del tamaño de la ORT y la tensión deseada |
| tuercas de seguridad de | |||
| cinta métrica | |||
| microcontrolador | Arduino | A000066 | Arduino Uno |
| microinterruptor | Sparkfun | KW4-Z5F | mini microinterruptor (palanca de rodillo SPDT) |
| Rat Turnstile (ORT) | Vulintus | Póngase en contacto con la empresa para solicitar un presupuesto si no se autoensambla | |
| Cámaras operantes como se desee para la evaluación del comportamiento: Para este experimento utilizamos cámaras de tracción isométricas automatizadas de Vulintus | Vulintus | No cat #: contacta con Vulintus | Contacta con Vulintus para cotizar |
| filamento PLA | OVERTURE (Amazon) | el Reino Unido | |
| plexiglás | Lesnlok (Amazon) | B09P74K7BR | transparente, 1/8" de grosor, cortado a medida |
| plexiglás | |||
| programa python | Software Python Software Foundation | disponible bajo pedido | |
| Lector RFID | Prioridad 1 Diseño | RFIDRW-E-USB | Con antena |
| Etiqueta RFID | Dispositivos de información unificados | UC-1485-10 | |
| varilla | Boltdepot | 23632 | cortado a > 3.5 " |
| Herramienta | utilizada para perforar agujeros en aparatos y jaulas de colonias para ORT; cualquier hardware utilizable | ||
| papel de lija | HSYMQ (Amazon) | TOMPOL-1118-1915-11 | |
| juego | tubo Cualquier juego de llaves de tubo funciona | ||
| soldador | |||
| super pegamento | 234790 | ||
| alambre | Plusivo (Amazon) | EAN0721248989789 |
Referencias
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