Imágenes de una sola molécula de la movilidad lateral y la actividad del canal iónico en bicapas lipídicas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Summary

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía TIRF para rastrear canales iónicos individuales y determinar su actividad en las membranas lipídicas soportadas, definiendo así la interacción entre el movimiento de la membrana lateral y la función del canal. Describe cómo preparar las membranas, registrar los datos y analizar los resultados.

Abstract

Las técnicas de imagen de alta resolución han demostrado que muchos canales iónicos no son estáticos, sino que están sujetos a procesos altamente dinámicos, incluida la asociación transitoria de subunidades auxiliares y formadoras de poros, difusión lateral y agrupamiento con otras proteínas. Sin embargo, la relación entre la difusión lateral y la función es poco conocida. Para abordar este problema, describimos cómo la movilidad lateral y la actividad de los canales individuales en las membranas lipídicas soportadas pueden ser monitoreadas y correlacionadas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). Las membranas se fabrican sobre un sustrato de hidrogel ultrafino utilizando la técnica de bicapa de interfaz de gotas (DIB). En comparación con otros tipos de membranas modelo, estas membranas tienen la ventaja de ser mecánicamente robustas y adecuadas para técnicas analíticas altamente sensibles. Este protocolo mide el flujo de iones Ca 2+ a través de canales individuales observando la emisión de fluorescencia de un colorante sensible a Ca²⁺ muy cerca de la membrana. A diferencia de los enfoques clásicos de seguimiento de moléculas individuales, no se requieren proteínas de fusión fluorescentes o etiquetas, que pueden interferir con el movimiento lateral y la función en la membrana. Los posibles cambios en el flujo iónico asociados con cambios conformacionales de la proteína solo se deben al movimiento lateral de la proteína en la membrana. Los resultados representativos se muestran utilizando el canal de translocación de proteínas mitocondriales TOM-CC y el canal bacteriano OmpF. A diferencia de OmpF, la compuerta de TOM-CC es muy sensible al confinamiento molecular y a la naturaleza de la difusión lateral. Por lo tanto, las bicapas de interfaz de gotas compatibles son una herramienta poderosa para caracterizar el vínculo entre la difusión lateral y la función de los canales iónicos.

Introduction

El presente protocolo tiene como objetivo describir cómo estudiar la correlación entre la movilidad de la membrana y la permeabilidad del canal iónico de las proteínas de membrana en membranas de bicapa de interfaz de gotas (DIB) soportadas por polímeros ^1,2,3.

La presente técnica complementa una impresionante variedad de herramientas analíticas ópticas y de superficie avanzadas, como el seguimiento de partículas individuales^4,5, la espectroscopia de correlación de fluorescencia ^6,7 y la microscopía de fuerza atómica de alta velocidad 8,9,10. Estos proporcionan información valiosa sobre la composición dinámica y la estructura de las membranas que influyen en las reacciones basadas en la membrana^11,12,13. Mientras que el movimiento y la difusión lateral de las proteínas dependen de la densidad local de las proteínas en la membrana, las moléculas de proteínas individuales también pueden quedar atrapadas en balsas lipídicas¹⁴ y por interacciones proteína-proteína^15,16. Dependiendo de los dominios proteicos que sobresalen de la membrana hacia el entorno extracelular o citosol, la movilidad de las proteínas puede variar de altamente móvil a completamente inmóvil. Sin embargo, debido a la complejidad de la membrana y sus estructuras periféricas, a menudo es difícil descifrar la interacción entre la naturaleza de la movilidad lateral y la función de la proteína¹⁷.

Las membranas DIB han demostrado ser una plataforma eficiente para el análisis biofísico de moléculas individuales de proteínas de membrana 18,19,20,21,22. Se forman por autoensamblaje lipídico a través del contacto de gotitas acuosas con sustratos soportados por hidrogel en una fase lípido/aceite. Similar a las bicapas lipídicas soportadas (SLBs) comúnmente utilizadas1,23,24,25^, las DIB permiten el ajuste local de la movilidad lateral mediante la unión temporal o permanente de proteínas a la matriz polimérica cuando se funcionalizan con ligandos adecuados¹⁷. Este último puede servir como sistema modelo para procesos bioquímicos en membranas celulares con una distribución heterogénea^{de proteínas 10}.

El enfoque experimental descrito aquí se basa en la fluorescencia de colorantes sensibles a Ca 2+ para medir el flujo de iones Ca 2+ a través de canales individuales muy cerca de la membrana ^2,22 utilizando microscopía TIRF. Este enfoque óptico limita la iluminación de la muestra a una distancia cercana a la membrana, lo que, debido a las propiedades físicas de la luz de excitación evanescente, conduce a una reducción significativa del fondo de fluorescencia. Este último es un requisito previo si se requiere una alta resolución espacial y temporal para la detección de moléculas individuales. A diferencia de los métodos electrofisiológicos clásicos^26,27, no se requieren voltajes de membrana para estudiar el flujo de iones a través de canales individuales. Además, el método no requiere marcado con colorantes fluorescentes o moléculas que podrían interferir con el movimiento lateral de los canales en la membrana.

El método es particularmente útil para estudiar los canales de proteínas incrustados en la membrana a nivel de molécula única sin utilizar la electrofisiología clásica. Utilizando el canal conductor de proteínas mitocondriales TOM-CC de Neurospora crassa^28,29,30 y OmpF, que apoya la difusión de pequeñas moléculas hidrófilas a través de la membrana externa de Escherichia coli^17,31, ilustramos cómo se pueden estudiar y correlacionar las movilidades de membrana y las actividades de canal de las dos proteínas. Sugerimos que este enfoque, aunque optimizado para TOM-CC y OmpF, se puede aplicar fácilmente a otros canales de proteínas.

Protocol

1. Producción de proteínas

NOTA: Esta sección describe el procedimiento para aislar OmpF de Escherichia coli BE BL21(DE3) omp6^31,32, que carece de LamB y OmpC, y el complejo central TOM de Neurospora crassa (Figura 1)^28,29. Este último requiere mitocondrias aisladas de una cepa 28 de N. crassa que contiene una forma marcada con 6xHis de la subunidad TOM Tom22 (Figura 1A), que puede aislarse como se describe²⁸. Los siguientes protocolos generalmente producen 1-2 mg de N. crassa TOM-CC y 10 mg de E. coli OmpF. Si se va a ajustar la cantidad, es importante que las proporciones proteína/detergente se mantengan con precisión. A menos que se especifique lo contrario, todos los pasos deben realizarse a 4 °C.

1. Aislamiento del complejo central TOM
   1. Solubilizar mitocondrias purificadas de N. crassa (2 g de proteína) obtenidas por sedimentación diferencial a partir de hifas de aproximadamente 1,5 kg (peso húmedo), según Bausewein et al.30, a una concentración proteica de 10 mg/mL en 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 1% (p/v) DDM, 20% (v/v) de glicerol, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazol y 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante ³⁰ min a 4 °C.
      PRECAUCIÓN: El PMSF es tóxico. Use equipo de protección personal adecuado.
   2. Transfiera las mitocondrias solubilizadas a tubos de ultracentrífuga y separe las membranas no solubilizadas de las proteínas de membrana solubilizadas mediante ultracentrifugación a 130.000 x g durante 40 min a 4 °C y filtración con papel de filtro de grado estándar.
   3. Equilibre una columna de Ni-NTA preempaquetada (volumen de 5 ml) con aproximadamente 5 volúmenes de columna (CV) de tampón A1 (Tabla 1) utilizando un sistema automatizado de purificación de proteínas. Haga funcionar la columna de Ni-NTA a un caudal constante de 1 ml/min durante todos los pasos. Use una columna de volumen más bajo (1 ml) si las proteínas se han aislado de menos de 2 g de mitocondrias.
   4. Cargue la muestra de proteína solubilizada en la columna de Ni-NTA a un caudal de 1 ml/min.
   5. Lave la columna de Ni-NTA con 5 CV de tampón A1 (Tabla 1) para eliminar las proteínas no unidas.
   6. Eluir TOM-CC marcado con Tampón A2 al 30% (Tabla 1; imidazol 300 mM) y recoger el pico de proteína tal como aparece en el cromatograma de 280 nm (Figura 1B).
   7. Para una mayor purificación de TOM-CC, equilibre la columna de intercambio aniónico preempaquetada (1 ml) con 5 CV cada una de tampón B1, B2 y B1 (Tabla 1) utilizando el sistema automatizado de purificación de proteínas. Hacer funcionar la columna de intercambio aniónico a un caudal constante de 1 ml/min durante todos los pasos.
   8. Cargue la fracción de pico TOM-CC (paso 1.1.6) en la columna de intercambio aniónico (caudal de 1 ml/min).
   9. Eliminar las proteínas no unidas lavando la columna con 5 CV de tampón B1 (Tabla 1) y un gradiente lineal de sal de 0%-20% tampón B2 (Tabla 1).
   10. Eluya TOM-CC con un gradiente de sal lineal de 20%-35% tampón B2, y recoja la fracción pico de proteína tal como aparece en el cromatograma de 280 nm (Figura 1C).
   11. Evalúe la pureza de la muestra mediante SDS-PAGE (Figura 1D) y determine la concentración de proteína utilizando un ensayo de proteínas disponible comercialmente, de acuerdo con el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
   12. Congelar las muestras de proteínas en nitrógeno líquido y almacenarlas a -80 °C hasta su posterior uso.
       PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido debe manipularse en áreas bien ventiladas. Use equipo de protección personal adecuado.
        
2. Aislamiento de OmpF
   1. Recuperar la cepa de E. coli BE BL21(DE3) omp6, que carece de LamB y OmpC³², de una cepa de glicerol congelada en condiciones estériles, y rayar en una placa de agar Luria-Bertani (LB) (Tabla 2). Para hacer esto, extienda gradualmente la muestra uniformemente sobre toda la placa.
   2. Dejar que la muestra penetre en el agar durante 5 minutos, antes de invertir la placa con la tapa cerrada e incubar durante la noche a 37 °C.
   3. Seleccionar una sola colonia de E. coli , inocular 7,5 mL de medio LB (Tabla 2) con esta colonia única utilizando un palillo estéril, y dejar crecer durante la noche (14 h) con agitación (170 rpm) a 37 °C.
   4. Transfiera 2 x 1 ml de células de E. coli con pipetas estériles a 2 x 500 ml de medio LB (Tabla 2), y deje crecer durante la noche (~ 14 h) a 37 ° C con agitación (~ 170 rpm) en un agitador.
   5. Cosechar las células por centrifugación a 5.000 x g durante 20 min a 4 °C, congelar el pellet en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C hasta su uso posterior.
      NOTA: El peso húmedo del pellet celular es típicamente de 5 g por 1 L de cultivo. En este punto, el protocolo se puede pausar.
   6. Descongele y resuspenda las celdas (2 g) en 20 ml de tampón de lisis C1 (Tabla 2), y pase la suspensión tres veces a 1,000 psi a través de un sistema de interrupción de celda de alta presión preenfriado (4 ° C), con un volumen máximo de muestra de 35 ml, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      PRECAUCIÓN: El uso de una prensa francesa puede provocar lesiones graves. Nunca exceda el límite de presión de la celda utilizada. Use equipo de protección personal adecuado.
   7. Retire las células intactas del lisado por centrifugación a 4.000 x g durante 15 minutos y recoja el sobrenadante.
   8. Recoger las membranas por ultracentrifugación a 100.000 x g durante 1 h.
   9. Resuspender el pellet de membrana en 10 ml de tampón C2 (Tabla 2) y mezclar con un volumen igual de tampón SDS C3 (Tabla 2) utilizando un homogeneizador de vidrio con rodamiento de bolas.
      PRECAUCIÓN: El β-mercaptoetanol en el tampón C3 es tóxico. Siga todas las normas de seguridad pertinentes.
   10. Incubar la suspensión en un baño maría a 50 °C durante 30 min.
   11. Centrifugar la muestra a 100.000 g a 20 °C durante 1 h.
   12. Resuspender el pellet de membrana en 10 ml de tampón C4 de SDS (Tabla 2) utilizando un homogeneizador de vidrio con rodamiento de bolas, e incubar la suspensión en un baño de agua a 37 °C durante 30 min.
       NOTA: Si el pellet no se puede resuspender, agregue más tampón SDS C4 hasta un volumen de 20 ml.
   13. Centrifugar la muestra a 100.000 g a 20 °C durante 30 min, y recoger el sobrenadante.
   14. Mezclar el sobrenadante con polioxietileno octilo (octil POE) hasta obtener una concentración final de detergente del 0,5% (p/v) y dializar la muestra dos veces contra el tampón C5 (Tabla 2) a 4 °C durante 24 h. Para este propósito, use un tubo de diálisis con un corte de 20 kDa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y coloque la muestra en el tubo o dispositivo de diálisis.
       NOTA: El corte del tubo de diálisis debe ajustarse en caso de que las proteínas con otras masas moleculares se dialicen.
   15. Evalúe la pureza de la muestra mediante SDS-PAGE y determine la concentración de proteína utilizando un ensayo de proteína disponible comercialmente, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Tabla de materiales).
       NOTA: Las muestras calentadas a 95 °C muestran OmpF monomérico. Las muestras no calentadas muestran OmpF en su forma trimérica (Figura 1F).
   16. OmpF dializado por choque y congelación en alícuotas en nitrógeno líquido, y almacenar a -20 °C hasta su uso posterior.
       PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido debe manipularse en áreas bien ventiladas. Use equipo de protección personal adecuado.

2. Registro óptico monocanal de canales iónicos en membranas DIB

NOTA: Esta sección describe el procedimiento para preparar membranas DIB en cámaras microfabricadas de polimetacrilato de metilo (PMMA)² para monitorear el movimiento lateral de proteínas y el flujo iónico a través de canales iónicos individuales¹⁷. Las dimensiones y los dibujos exactos para la fabricación de la cámara se pueden encontrar en Lepthin et ^al.2. La figura 2 ofrece una visión general del montaje de la cámara 2 de PMMA^{y la} formación de las membranas DIB. A menos que se especifique lo contrario, todos los pasos se realizan a temperatura ambiente (RT). La Figura 3 muestra una representación esquemática de una membrana DIB y cómo el flujo de Ca²⁺ a través de una proteína de un solo canal se utiliza para monitorear tanto el movimiento en la membrana como el estado abierto-cerrado del canal.

1. Preparación de lípidos
   1. Extraer del congelador la solución madre lipídica que contiene 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (25 mg/ml de DPhPC) disuelta en cloroformo a -20 °C y calentarla a RT. Para este propósito, generalmente es suficiente calentar la muestra lentamente a mano durante unos minutos.
      PRECAUCIÓN: El cloroformo es tóxico. Use el equipo de protección personal adecuado y realice todos los procedimientos que involucren cloroformo debajo de una campana extractora.
   2. Transfiera 380 μL de solución madre de DPhPC (25 mg/ml de DPhPC) a un vial de vidrio. Evite las pipetas con sellados de goma. En su lugar, use jeringas de vidrio de microlitros con émbolos de acero inoxidable.
   3. Después de manipular la solución de reserva lipídica, cubra la solución de reserva lipídica con gas Ar o N₂ para evitar la oxidación lipídica. Utilice el flujo de gas más bajo posible para evitar la evaporación del disolvente orgánico en el que se disuelven los lípidos o las salpicaduras de los aerosoles de disolvente del vial. Asegúrese de que las tapas de los viales de vidrio que contienen lípidos con disolvente orgánico estén recubiertas con politetrafluoroetileno (PTFE) en el interior.
   4. Secar la muestra lipídica (paso 2.1.2) bajo una corriente de_N2 y extraer el disolvente orgánico restante de la muestra de lípidos durante la noche al vacío (2,0 mbar) utilizando una bomba de vacío exenta de aceite.
   5. Disuelva la película lipídica en una solución de aceite de hexadecano/silicona agregando volúmenes iguales de hexadecano y aceite de silicona (500 μL cada uno) utilizando una jeringa de vidrio de microlitros hasta una concentración lipídica final de 9,5 mg/ml.
      NOTA: La solución lipídica es estable en RT durante varias semanas.
2. Preparación de hidrogel de agarosa
   1. Prepare aproximadamente 1 ml de solución de agarosa de bajo punto de fusión (0,75% [p/v]) en agua desionizada doble, y caliente a 85 °C en un bloque de calentamiento durante 20 minutos para utilizarlo para recubrir el recubrimiento de vidrio por centrifugado.
      NOTA: La solución de agarosa se puede mantener en RT durante varias semanas y se puede recalentar varias veces.
   2. Preparar una solución de agarosa de bajo punto de fusión al 2,5% (p/v) en 0,66 M CaCl 2 y 8,8 mM HEPES (pH_7,2 ), y calentar a 85 °C en un bloque de calentamiento durante 20 min. Asegúrese de que la agarosa esté bien derretida.
      NOTA: La solución de agarosa se puede conservar durante varias semanas en RT y se puede recalentar varias veces, al igual que la agarosa (paso 2.2.1) utilizada para el recubrimiento por centrifugado.
3. Ensamblaje de la cámara de polimetacrilato de metilo (PMMA) y formación de monocapa lipídica en la interfaz hidrogel hexadecano/aceite de silicona
   1. Coloque algunos cubreobjetos de vidrio (40 mm x 24 mm x 0,13 mm) en un soporte de acero inoxidable y límpielos en un vaso de precipitados de vidrio durante 10 minutos con acetona en un limpiador ultrasónico. Use la acetona suficiente para sumergir los cubreobjetos y cubra el vaso de precipitados holgadamente con una placa de vidrio para crear un sistema cerrado y sin presión que minimice el escape de vapores durante el proceso de limpieza.
      PRECAUCIÓN: La acetona es un disolvente altamente inflamable con un bajo punto de inflamación. Las mezclas vapor/aire son explosivas. Opere el limpiador ultrasónico en un área bien ventilada. Use el equipo de protección personal adecuado y observe las precauciones de seguridad oficiales (por ejemplo, sin llamas abiertas ni chispas).
   2. Enjuague los cubreobjetos de vidrio con agua de doble desionización y séquelos bajo una corriente de N₂.
      NOTA: Los cubreobjetos limpiados de esta manera se pueden almacenar durante varias semanas.
   3. Limpie e hidrophilice aún más un cubreobjetos en un limpiador de plasma con oxígeno (0,5 mbar) durante 5 min.
      NOTA: Realice este paso inmediatamente antes del recubrimiento por centrifugado con solución de agarosa, ya que el efecto hidrófilo de la limpieza con plasma desaparece con el tiempo.
   4. Monte un cubreobjetos tratados con plasma en una recubridora de centrifugado (Figura 2, paso 1).
   5. Cubra el cubreobjetos con una película de agarosa de espesor submicrométrico añadiendo lentamente 140 μL de agarosa calentada de bajo punto de fusión al 0,75% (p/v) (paso 2.2.1) a 3.000 rpm durante 30 s, utilizando una pipeta de 200 μL (figura 2, paso 1).
      NOTA: El espesor de la película de agarosa puede determinarse mediante microscopía de fuerza atómica (AFM), como se describe¹⁷.
   6. Fije inmediatamente el cubreobjetos recubierto de centrifugado con la capa delgada del hidrogel de agarosa a la parte inferior de la cámara 2 de PMMA^. Asegúrese de que el hidrogel de agarosa apunte hacia arriba (Figura 2, paso 2).
   7. Fije los bordes del cubreobjetos al dispositivo micromecanizado de PMMA con cinta adhesiva transparente.
   8. Coloque el dispositivo de PMMA en una placa caliente calentada a 35 °C (Figura 2, paso 3).
   9. Vierta cuidadosamente 200 μL de solución de agarosa al 2,5% (paso 2.2.2) en la entrada de la cámara con una pipeta (Figura 2, paso 3), sin crear burbujas de aire para que el hidrogel delgado aplicado por recubrimiento de centrifugado pueda equilibrarse con el tampón de la solución de agarosa al 2,5% y permanecer hidratado. Asegúrese de que la solución de agarosa al 2,5% se extienda alrededor del hidrogel de agarosa recubierto por centrifugado, pero no sobre él (Figura 3A), lo que se puede evitar presionando suavemente la cámara de PMMA sobre la placa calefactora.
   10. Cubrir inmediatamente los pocillos de la cámara de PMMA (Figura 2, paso 4) con un total de 60 μL de solución lipídica/aceite (paso 2.1.5), para iniciar la formación de monocapa lipídica en la interfaz agarosa-aceite y evitar la deshidratación de la agarosa recubierta de espín en los pocillos de la cámara de PMMA. Mantener el dispositivo en una placa caliente a 35 °C durante aproximadamente 2 h.
       NOTA: Los pocillos circulares en la cámara de PMMA tienen un diámetro de 0,5 mm y una profundidad de 1,8 mm, según el trabajo publicado anteriormente².
4. Preparación de gotitas acuosas recubiertas de lípidos en solución de aceite de hexadecano/silicona
   1. Colocar 20 μL de solución lipídica de hexadecano/aceite de silicona (paso 2.1.5) en cada uno de los varios pocillos microfabricados en una cámara de incubación de gotitas (figura 2, paso 4). Los recipientes adecuados para la solución lipídica de hexadecano/aceite de silicona son pequeños huecos de 40 mm x 30 mm x 3,5 mm en una placa delgada de PMMA².
   2. Prepare una aguja de vidrio microcapilar con un diámetro de abertura de punta de 20 μm utilizando un extractor de micropipetas vertical u horizontal (por ejemplo, utilizado para hacer pipetas de parche o electrodos de vidrio afilados). Estimar el diámetro de apertura de la aguja de vidrio microcapilar bajo un microscopio estereoscópico binocular a bajo aumento, en un rango de zoom entre 7.5x y 35x.
      NOTA: Los ajustes para el modo de precalentamiento antes de tirar del capilar de vidrio, el modo de calentamiento para tirar y la fuerza de tracción deben determinarse experimentalmente de antemano, de acuerdo con las especificaciones del fabricante del dispositivo de tracción y el tipo de capilar.
   3. Llene la aguja de vidrio microcapilar con 5 μL de solución inyectable acuosa que contenga 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl y 30 nM TOM core complex, o alternativamente 20 nM OmpF utilizando una punta de pipeta microcapilar. Use solo agua doble destilada previamente tratada con una resina quelante que se une a iones metálicos multivalentes (Ca²⁺) para preparar la solución de inyección acuosa.
   4. Monte la aguja de vidrio microcapilar con la solución de inyección acuosa en un nanoinyector piezoeléctrico.
   5. Inyectar 100-200 nL de gotitas acuosas (Figura 2, paso 4) que contengan 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl y 30 nM TOM core complex (paso 1.1.12), o alternativamente 20 nM OmpF (paso 1.2.16) en los pocillos de la cámara de incubación de gotitas llena de solución lipídica de hexadecano/aceite de silicona (ver 2.1.5) utilizando el nanoinyector. Asegúrese de que las gotitas no se toquen entre sí colocándolas a varios milímetros (>10 mm) de distancia en los pocillos. De lo contrario, si las monocapas lipídicas aún no se han formado en la interfaz aceite/tampón, se fusionarán en gotas más grandes.
      NOTA: Si no se dispone de capilares de clase ni nanoinyectores, las gotitas pueden prepararse alternativamente manualmente con pipetas de microlitros de un solo canal para volúmenes entre 0,1 μL y 0,5 μL, como se describe². En este caso, sin embargo, los volúmenes de gotas no son tan precisos.
   6. Permitir la formación de una monocapa lipídica en la interfaz gota/aceite durante aproximadamente 2 h manteniendo las cámaras de incubación de PMMA y gotas (Figura 2, paso 4) en una placa caliente calentada a 35 °C.
5. Preparación e imagen de canales iónicos individuales en membranas DIB
   1. Transfiera manualmente gotitas acuosas individuales desde los pocillos de la cámara de incubación de gotas bajo un microscopio estereoscópico a los pocillos de la cámara de PMMA (Figura 2, paso 5), utilizando una pipeta de microlitro de un solo canal con una punta de polipropileno desechable de 10 μL. Permita que las gotitas se hundan en las monocapas lipídicas formadas en las interfaces hidrogel-aceite durante aproximadamente 5 minutos para formar una bicapa lipídica (Figura 3) entre las gotitas y el hidrogel de agarosa.
   2. Monte la cámara de PMMA con membranas DIB en el portamuestras de un microscopio de luz invertida y evalúe la formación de la membrana utilizando un objetivo de contraste de modulación Hoffman 10x (Figura 2, paso 6). La formación de membrana DIB está indicada por un anillo blanco transparente en la interfaz entre la gota y el hidrogel (Figura 4A). Las membranas DIB que se han roto no muestran este anillo (Figura 4B).
      NOTA: Alternativamente, las membranas DIB se pueden visualizar con un aumento de 10x mediante contraste de fase o microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC).
   3. Si se han formado membranas DIB, monte la cámara de PMMA en el portamuestras de un microscopio TIRF (Figura 2, paso 7) equipado con una fuente de luz convencional para iluminación de epifluorescencia, un láser de 488 nm (P_max = 100 mW) y una cámara CCD multiplicadora de electrones retroiluminada (512 x 512 píxeles; >95% QE) para lograr un tamaño de píxel de ~0.16 μm.
   4. Enfoque el borde de una membrana DIB con un objetivo de aumento de 10x bajo iluminación de epifluorescencia con una fuente de luz de alta intensidad utilizando un conjunto de filtros GFP.
   5. Enfoque fino del mismo borde de la membrana DIB a gran aumento con un objetivo TIRF de aceite apocromático 100x/N.A. 1.49, nuevamente bajo iluminación de epifluorescencia, con la fuente de luz de alta intensidad utilizando un conjunto de filtros GFP que permite visualizar la fluorescencia de fondo débil del colorante fluorescente Fluo-8 en la gota (Figura 4C).
   6. Cambie la configuración del filtro de GFP al conjunto de filtros TIRF de cuatro bandas.
   7. Encienda el láser de 488 nm y ajuste la intensidad del láser en la lente del objetivo a un valor entre 8 mW y 10 mW.
      NOTA: Dado que a menudo no hay información cuantitativa sobre la intensidad del láser en la lente del objetivo, los ajustes de intensidad del láser deben calibrarse de antemano en mediciones separadas en la lente, con un medidor de potencia láser óptico equipado con un sensor de fotodiodo, de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
      PRECAUCIÓN: Para garantizar el funcionamiento seguro del láser, el operador debe ser consciente de los posibles peligros de la radiación láser y las normas de prevención de accidentes.
   8. Para visualizar canales iónicos individuales, ajuste el ángulo TIRF y la ganancia de la cámara EMCCD (por ejemplo, ajuste del multiplicador de ganancia EM: 285) de modo que los canales iónicos abiertos en la membrana DIB aparezcan como puntos fluorescentes de alto contraste sobre un fondo oscuro (Figura 4D-G), y la relación señal-fondo, cuando se inspecciona visualmente, alcance un máximo. Asegúrese de que las manchas, correspondientes al flujo de Ca²⁺ a través de canales iónicos individuales, permanezcan enfocadas y tengan una forma redonda, con alta intensidad en el centro y disminuyendo gradualmente hacia la periferia. Las membranas sin canales muestran sólo fluorescencia de fondo (Figura 4C).
   9. Antes de registrar el movimiento y la actividad abierta-cerrada de los canales individuales a lo largo del tiempo, compruebe que los puntos fluorescentes están enfocados, para asegurarse de que los canales iónicos se han reconstituido en las membranas DIB y se mueven lateralmente en el plano de la membrana. Si este no es el caso, podría indicar que una molécula fluorescente está entrando y saliendo del campo evanescente generado por el láser cerca de la membrana.
   10. Grabe una serie de imágenes de membrana que permitan el seguimiento adecuado de la posición y el monitoreo del estado abierto-cerrado de los canales iónicos individuales. Para determinar el tipo de movilidad lateral (p. ej., movimiento libre vs anclaje transitorio [para referencia, véase¹⁶]) y el estado de actividad del canal (p. ej., abierto o cerrado), adquiera trayectorias suficientemente largas (p. ej., 30 s a 1 min) y bien muestreadas (p. ej., velocidad de fotogramas de 48 ^s-1).
       NOTA: La observación de la difusión canalizada, restringida o de salto¹⁶ requiere que la frecuencia de muestreo sea lo suficientemente rápida como para medir la difusión no restringida dentro de los límites de los límites. Además, asegúrese de que el tiempo de muestreo de datos sea lo suficientemente largo como para medir la transición de la difusión sin restricciones a la difusión restringida (para más detalles, véase Jacobson et ^al.16).
6. Tratamiento de imágenes y datos
   NOTA: Los paquetes de procesamiento de imágenes de código abierto³³ o las rutinas autoescritas¹⁷ basadas en paquetes de software comercial se pueden utilizar para analizar la dinámica espaciotemporal de canales iónicos individuales en DIB. Para poder correlacionar la movilidad lateral de la membrana con el flujo iónico a través de los canales individuales, no se deben aplicar algoritmos de filtro.
   1. Corregir series temporales de imagen para el blanqueo aplicando procedimientos estándar³⁴ utilizando rutinas escritas por él mismo, ajustando la intensidad media del fotograma de la imagen completa a , donde t es el índice de fotogramas (tiempo) y a k son los parámetros de ajuste. A continuación, corrija la serie temporal según , donde I(t) es la intensidad. Alternativamente, para los análisis de datos iniciales, realice correcciones de fondo utilizando software de código abierto con algoritmos de bola rodante^{implementados 33} y un radio de bola rodante, dependiendo del tamaño de punto y píxel de la cámara (por ejemplo, 50 píxeles).
   2. Determine las posiciones espaciales y amplitudes de un punto de fluorescencia dentro de una región de interés definida (ROI) (por ejemplo, 30 x 30 píxeles), ajustando I(t) en un momento dado t a una función gaussiana bidimensional con inclinación plana que tenga en cuenta posibles gradientes de iluminación local de acuerdo con . Aquí, x = (x, y) es el ROI con la información de intensidad de fluorescencia, A y σ son la amplitud y anchuras del gaussiano, p_k son parámetros que caracterizan la intensidad de fondo del ROI, y μ = (x 0, y₀) define la posición del gaussiano. El flujo de iones a través de un canal individual viene dado por el parámetro A. La trayectoria del canal viene dada por x, y permite determinar la movilidad lateral del canal. Alternativamente, es posible determinar las posiciones e intensidades de los puntos individuales utilizando plataformas de código abierto³³ y plug-ins como se describe^35,36. Estimar la precisión posicional³⁷ después de la conversión de la lectura de la cámara EMCCD en números de fotones³⁸.
   3. Trazar la amplitud de fluorescencia A frente al tiempo y la trayectoria correspondiente x para determinar una posible correlación entre la difusividad del canal y el flujo de iones a través del canal. Realice esto con cualquier software de gráficos. En caso de movimiento del canal lateral libre, determinar el coeficiente de difusión lateral D mediante regresión lineal del retardo de tiempo τ, y calcular el desplazamiento cuadrático medio de las manchas desde x de acuerdo con .
      NOTA: Los coeficientes de difusión típicos¹⁷ para TOM-CC y OmpF que se mueven libremente en membranas DIB oscilan entre 0,5 y 1,5 μm^{2 s-1}. Las moléculas cuya constante de difusión es inferior a 0,01 mm²·^s-1 se definen como inmovilizadas¹⁷.

Results

La grabación óptica de un solo canal sin electrodos en tiempo real revela la interacción entre el movimiento lateral de proteínas y la función de los canales iónicos individuales en las membranas DIB. La reconstitución del complejo del núcleo TOM mitocondrial (Figura 1A) en una membrana DIB (Figura 4D) ilustra una fuerte correlación temporal entre la movilidad lateral y la permeabilidad iónica (Figura 5A). La compuerta TOM-CC parece ser sensible al modo de movimiento lateral¹⁷. Los canales móviles muestran flujo de Ca²⁺ a través de sus poros y altas intensidades de puntos de fluorescencia. Las moléculas atrapadas que no se mueven muestran intensidades de fluorescencia bajas y medias. Para el poro general de importación de proteínas de las mitocondrias TOM-CC, este enfoque de molécula única reveló una fuerte correlación temporal entre la movilidad lateral y la permeabilidad a los iones, lo que sugiere que el canal TOM-CC tiene propiedades mecanosensibles¹⁷. Una parada lateral de moléculas TOM-CC que se mueven libremente se acompaña de un cierre parcial o completo del canal TOM-CC. Las imágenes de membranas DIB con OmpF (Figura 1E y Figura 4F), que está casi completamente incrustada en la membrana, no muestran efectos de parada y arranque (Figura 5B). Las paradas aleatorias de OmpF no están asociadas con un cambio en la intensidad y, por lo tanto, con el cierre de sus poros. Sobre la base de las señales de fluorescencia³⁸, la precisión posicional de los canales individuales puede estimarse en el rango entre 5 y 10 nm. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que esta precisión no se puede lograr si los canales se tambalean ligeramente debido al anclaje móvil con el hidrogel de agarosa, como se muestra, por ejemplo, para las moléculas TOM-CC en un estado intermedio con un desplazamiento medio de la raíz de 120 nm (Figura 5A).

Figura 1: Aislamiento de TOM-CC. (A) Estructura crioEM de N. crassa TOM-CC^30,39. Las mitocondrias de una cepa de N. crassa que contenía un Tom22 con una etiqueta 6xHis se solubilizaron en DDM y se sometieron a cromatografía de afinidad Ni-NTA (B) y cromatografía de intercambio aniónico (C). (D) SDS-PAGE de TOM-CC aislado. (E) Estructura cristalina (PDB, 1OPF) y (F) SDS-PAGE de E. coli OmpF purificada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diagrama de flujo del conjunto de la cámara de PMMA. Paso 1: Un cubreobjetos de vidrio se recubre con un hidrogel de agarosa. Paso 2: El cubreobjetos recubierto por centrifugado se monta en una cámara de microscopía de PMMA hecha a medida. Paso 3: Se agrega agarosa de bajo punto de fusión adicional en el puerto de entrada de la cámara de PMMA en una placa caliente de 35 ° C. Paso 4: Las monocapas lipídicas se forman alrededor de gotitas acuosas en una interfaz tampón/aceite (izquierda) y en la interfaz hidrogel/aceite de agarosa (derecha). Paso 5: Las gotitas acuosas individuales se pipetean en los pocillos de la cámara de PMMA para formar una bicapa lipídica al contacto de las dos monocapas lipídicas. Paso 6: La formación de las membranas DIB se valida mediante microscopía de contraste de modulación de Hofmann. Paso 7: Las imágenes de áreas seleccionadas de las membranas DIB con canales iónicos insertados se adquieren mediante microscopía TIRF. Verde: 0,75% de agarosa; amarillo: 2.5% de agarosa que contiene iones Ca²⁺ ; magenta: fase lípida/oleosa; azul oscuro: tampón de gotas acuosas que contienen colorante sensible al Ca²⁺ y proteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Configuración experimental. (A) Representación esquemática de una membrana DIB en un pozo de PMMA. La bicapa descansa sobre una película ultrafina de agarosa al 0,75% para permitir la obtención de imágenes TIRF del flujo de Ca 2+ a través de un canal iónico a lo largo del tiempo utilizando un colorante de fluorescencia sensible al Ca ²⁺ (Fluo-8) en trans. (B) El flujo de Ca²⁺ está controlado exclusivamente por la presión osmótica de cis a trans. Esto permite tanto la determinación de la posición en la membrana como el estado abierto-cerrado del canal. El canal que se muestra aquí es el canal conductor de proteínas TOM-CC de las mitocondrias³⁰ de N. crassa. (C) Trayectoria de un solo canal TOM-CC. Verde: canal móvil; Amarillo: canal inmóvil. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Obtención de imágenes de TOM-CC y OmpF en membranas DIB. (A) Membrana DIB fotografiada por microscopía de contraste de modulación de Hoffmann que muestra el área de contacto bicapa entre el hidrogel y la gota. (B) Membrana DIB rota fotografiada como en (A). Flecha, borde de la cámara de PMMA. (C) Membrana DIB fotografiada por microscopía TIRF sin canales de proteínas. (D) Membrana DIB con TOM-CC reconstituido, fotografiada por microscopía TIRF. Los cuadrados blancos marcan manchas de intensidad alta (S_H), intermedia (S_I) y baja (S_L). (E) El ajuste del perfil de intensidad de fluorescencia de los tres puntos marcados en (A) a funciones gaussianas bidimensionales revela la posición de los TOM-CC individuales y el flujo de Ca²⁺ a través del canal. (F) Membrana DIB con OmpF reconstituido. (G) Ajuste gaussiano de la mancha fluorescente marcada en (F). En contraste con el complejo proteico de dos poros β barriles TOM-CC, el OmpF de tres poros β barriles revela solo un estado de permeabilidad. Tamaño de píxel, 0,16 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: La actividad del canal se correlaciona con la movilidad lateral de TOM-CC. (A) La traza de amplitud fluorescente (arriba) y la trayectoria correspondiente (abajo) de TOM-CC indican que la actividad del canal abierto-cerrado de TOM-CC se correlaciona con la movilidad de la membrana lateral del complejo. La trayectoria muestra tres estados de permeabilidad. Verde: estado totalmente abierto; amarillo: estado de permeabilidad intermedio; rojo: estado de canal cerrado; estrella roja: TOM-CC en el estado intermedio se tambalea alrededor de su posición media en aproximadamente ±60 nm. Las precisiones posicionales³⁷ basadas en las señales de fluorescencia en los estados totalmente abierto e intermedio oscilan entre 5 nm y 10 nm. (B) Traza de amplitud fluorescente (arriba) y trayectoria correspondiente (abajo) de OmpF. OmpF revela solo un nivel de intensidad, independientemente de si está en movimiento o atrapado. Los segmentos de trayectoria correspondientes a los períodos de tiempo de las moléculas atrapadas están marcados en gris. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Búfer	Concentraciones de reactivos			Volumen
A1*	20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1 % (p/v) n-dodecil-β-D-maltósido (DDM), 10% (v/v) glicerol, 300 mM NaCl y 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)			100 ml
A2*	20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1% (p/v) DDM, 10% (v/v) glicerol, 1 M Imidazol y 1 mM PMSF			100 ml
B1*	20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (p/v) DDM, 2% (v/v) dimetilsulfóxido (DMSO)			100 ml
B2*	20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (p/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimetilsulfóxido (DMSO)			100 ml
* Desgasificarse y pasar a través de un filtro de 0,22 μm antes de su uso.

Tabla 1: Soluciones tampón para el aislamiento TOM-CC.

Búfer	Concentraciones de reactivos			Volumen
LB*	1% (p/v) de triptona, 1% (p/v) de NaCl y 0,5% (p/v) de extracto de levadura			1100 ml
C1	2 mM MgCl2, y ~750 unidades de DNAsa y 50 mM Tris-HCl pH 7.5			20 ml
C2	50 mM Tris-HCl, pH 7.5			50 ml
C3	4% (p/v) dodecil sulfato de sodio (SDS), 2 mM β-mercaptoetanol y 50 mM Tris-HCl pH 7.5			50 ml
C4	2% (p/v) SDS, 500 mM NaCl y 50 mM Tris-HCl pH 7.5			50 ml
C5	0,5% (p/v) de polioxietileno octilo (octilo POE), 1 mM EDTA y 20 mM Tris pH 8,5			1000 ml
* Esterilizar antes de usar.

Tabla 2: Soluciones tampón para el aislamiento de OmpF.

Discussion

El protocolo presentado aquí proporciona una introducción al uso de membranas DIB para estudiar la interacción entre el movimiento del canal iónico lateral y la función del canal utilizando microscopía TIRF de molécula única. Para obtener los mejores datos posibles, la preparación de membranas DIB estables con tantos canales bien separados como sea posible es crucial para obtener series temporales de partículas individuales, que puedan analizarse satisfactoriamente.

Los parámetros críticos que deben optimizarse incluyen la elección de lípidos, la concentración de lípidos en la fase oleosa y las concentraciones de proteínas y detergentes en las gotas acuosas. Los lípidos empleados son inusuales, ya que no muestran una transición de fase clara a bajas temperaturas. DPhPC es un lípido comúnmente utilizado para producir sistemas de membrana estables⁴⁰. En principio, cualquier lípido que mantenga su ambiente fluido a bajas temperaturas puede ser adecuado para esta aplicación. Además, el lípido no debe ser sensible a la oxidación. La concentración de detergente en las gotitas debe ser lo más baja posible para evitar la ruptura de la membrana. Las membranas estables y las buenas tasas de incorporación de proteínas generalmente se logran con concentraciones de detergente por debajo de la concentración crítica de micelas (cmc), dado que la proteína de membrana no precipita.

Si las membranas DIB no toleran detergentes específicos^21,41, o si las proteínas no se integran de la solución detergente baja en las membranas DIB, los canales de proteínas pueden reconstituirse primero en pequeñas vesículas lipídicas unilamelares (SUV), que luego se fusionan a las membranas DIB desde el lado de las gotas^, como se ha demostrado con éxito para E. coli MscL ⁴² . A veces, las membranas DIB no se forman porque la concentración de lípidos en la fase oleosa es demasiado baja. Para evitar que las membranas DIB se rompan, también se debe tener en cuenta que la presión osmótica entre el hidrogel y la gota debe equilibrarse con precisión sin afectar excesivamente el flujo de Ca ²⁺ de cis a trans. El grosor optimizado de agarosa y el tamaño de la malla parecen ser cruciales para observar la difusión de proteínas de membrana. Debe evitarse cualquier secado de la capa de agarosa. El espesor puede determinarse mediante microscopía de fuerza atómica¹⁷. Al variar la concentración, el volumen y la velocidad de rotación de agarosa durante el recubrimiento de centrifugado, se puede optimizar el tamaño de la malla y el grosor del hidrogel. Tenga en cuenta, sin embargo, que el grosor de la capa de hidrogel afecta el contraste de la imagen. Para capturar proteínas de membrana en DIB, el hidrogel de agarosa puede ser reemplazado por agarosa sintetizada, no reticulada, modificada con Ni-NTA y de bajo punto de fusión para atraparlas a través de una etiqueta His¹⁷. Un fondo de fluorescencia excesivamente alto a menudo es causado por la ruptura de las membranas DIB. Esto es particularmente un problema con las cámaras de pocillos múltiples, ya que el tinte sensible al Ca²⁺ se difunde en el hidrogel. En este caso, se deben evitar los pozos adyacentes. El blanqueamiento por fluorescencia del colorante sensible al Ca²⁺ por encima de la membrana no debe ser un factor limitante significativo, ya que es intercambiado por colorantes no excitados en la mayor parte de la gota (Figura 3A) fuera del campo evanescente TIRF. La precisión de localización de la proteína viene dada por la precisión del ajuste de las manchas y el tamaño de los píxeles.

Las señales de fluorescencia débiles pueden ser causadas por un bajo flujo de Ca²⁺ a través del canal. Las posibles razones incluyen: (i) ajustes inexactos de TIRF (por ejemplo, intensidad del láser), (ii) la presión osmótica de Ca 2+ a través de la membrana, o (iii) la permeabilidad intrínseca de Ca²⁺ de los canales es demasiado baja. Para hacer frente al primer problema, la intensidad del láser, el ángulo TIRF y la ganancia de la cámara deben optimizarse. Los dos últimos problemas pueden ser superados por la aplicación de un potencial eléctrico a través de la membrana ^2,43. Sin embargo, la aplicación de voltajes externos puede distorsionar el resultado, ya que los efectos eléctricos pueden influir en la apertura del canal de los canales iónicos dependientes de ligandos o mecanosensibles que en realidad no están controlados por voltaje. Ejemplos de tales canales son la proteína mitocondrial translocasa TOM-CC²⁷, y su subunidad formadora de canales Tom40 26,44,45,46. Finalmente, cabe señalar que, insertar proteínas de membrana en membranas DIB en una orientación específica para lograr una funcionalidad deseada es complicado, y los estudios cuantitativos son raros^47,48. En algunos casos, la orientación de las proteínas integradas es aleatoria. Este es un problema grave para el estudio de las proteínas de membrana, porque ciertas proteínas de membrana se activan en un solo lado de la membrana.

La microscopía TIRF es un método poderoso para abordar eventos de moléculas individuales en membranas planas soportadas⁴⁹. Los ejemplos incluyen el ensamblaje y la elucidación de la vía de plegamiento de proteínas del canal como α-hemolisina⁵⁰, perfringolisina O 51 y OmpG⁵². Estos estudios incluyeron FRET como una técnica adicional. Además, la activación del canal iónico mecanosensible MscL se ha estudiado previamente mediante estimulación mecánica de bicapas DIB⁴² soportadas utilizando mediciones de corriente. Sobre la base de este trabajo, los estudios futuros podrían combinar la plataforma descrita aquí con experimentos FRET de molécula única para abordar canales mecanosensibles a nivel de molécula única de manera óptica¹⁷. La inyección de tampón en la gota, el estiramiento de la monocapa DIB interna o la unión dirigida de canales individuales al hidrogel subyacente se pueden usar para estudiar más a fondo no solo el mecanismo físico de los canales activados mecánicamente, que responden a la tensión y / o curvatura de la membrana como se muestra para MscL y MscS, el dominio de dos poros K ⁺ canales, TREK-1, TREK-2, y TRAAK, y PIEZO (para revisión, ver⁵³), pero también unión local al citoesqueleto celular, como se muestra para el canal iónico sensible al tacto NOMPC^54,55.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dipitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti Lípidos polares	850356C
100x Objetivo de aceite Apocromático N.A. 1.49		Microscopio Nikon MRD01991 TIRF
10x objetivo de contraste de modulación Hoffmann NA 0.25	Nikon		para evaluar la formación de membranas DIB
Objetivo 10x N.A. 0.25		Microscopio Nikon MRL00102 TIRF
40x Objetivo de contraste de modulación Hoffmann NA 0.55	Microscopio Nikon		para evaluar la formación de membrana DIB
Láser de 488 nm, 100 mW	Microscopio Visitron		TIRF
Cinta
Ä KTA PURO	Sistema de purificación de proteínas	Cytiva
ensayo Bradford, Pierce	Thermo Fisher	23236
CaCl2	Roth	5239.2
Chelax 100 resina	Biorad	143-2832
Cloroformo	Sigma-Aldrich	MC1024452500
Casetes de diálisis Slide-A-Lyzer 20 k MWCO	Thermo Fisher	87735
Cámara DIB	Cámara de		a medida para membranas DIB Medidor
potencia digital y consola de energía	Thorlabs	PM100D	Medidor de potencia láser
Dimetilsulfóxido Roth		4720.1
Microscopio de contraste de modulación Hoffmann H2O de doble destilación
Eclipse TS 100	Nikon		para evaluar la formación de membranas DIB
EDTA	Roth	8042.2
Cámara EMCCD iXon Ultra 897	Andor		Microscopio TIRF
Etanol	Sigma-Aldrich	32205-M
Rotor de ángulo fijo Ti70	Beckman Coulter
Fluo-8, CalciFluorTM	Santa Cruz Biotechnology	SC-362561	Ca2+ sensible al colorante
Prensa francesa homogeneizador de disrupción de celdas	Igneus	Igneus 40000 psi
Filtro GFP	AHF		Filtro seeting utilizado para la excitación de membranas DIB por epifluorescencia con fuente de luz blanca
Capilares de vidrio	World Precision Instruments	4878
Cubreobjetos de vidrio 40 mm x 24 mm x 0,13 mm	Roth	1870.2
Glicerol	Roth	3783.2
Jeringa Hamilton 10 mL	Roth	X033.1
Jeringa Hamilton 100 mL	Roth	X049.1
Jeringa Hamilton 500 mL	Roth	EY49.1
Bloque calefactor	Eppendorf	Thermomixer comfort
Placa calefactora	Minitube	HT200
Hepes	Roth	9205.3
Hexadcane	Sigma-Aldrich	296317
su trampa HP 1 mL	Cytiva	29051021	Columna de Ni-NTA
Imidazol	Sigma-Aldrich	1.04716.1000
KCl	Honeywell	10314243
KLM spin coater	Schaefer Tec	SCV-10
Lista médica L/M-3P-A extractor de pipetas vertical	Artisan Technology Group	57761-1
Agarosa de bajo punto	de fusión Sigma-Aldrich	A9414
M8 Microscopio estereoscópico	Wild		Stereomicrosope
Matlab	MathWorks	R2022a
Metanol	Sigma-Aldrich	34860
Puntas de pipeta MicroFil	World Precision Instruments	MF34G-5
N2 gas
NaCl	Roth	3957.1
Nanolitro 2010 inyector	Nanolitro de World Precision	Instruments 2010
n-dodecil-b-D-maltósido	Glycon Biochemicals	D97002-C
Ni-NTA agarosa, no reticulado	Cubo Biotech	124115393	Hecho a medida
NIS-Elements Software AR	Nikon	MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930	Software de imagen
n-octil-polioxietileno	Sigma-Aldrich	40530
O2 gas
fluoruro de fenilmetilsulfonilo	Roth	6367.3
Sensor de fotodiodo  Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs	S130C	para medidor de potencia láser
Limpiador de plasma	Diener Electronics	Zepto
Ultracentrífuga preparativa Optima	Beckman Coulter
Filtro TIRF cuatribanda 446/523/600/677 HC	AHF		Ajuste de filtro utilizado para la excitación de membranas DIB con láser de 488 nm
Recurso Q 1 mL	Cytiva	17117701	Columna de intercambio aniónico
Aceite de silicio AR 20	Sigma-Aldrich	10836
Dodecil sulfato de sodio	Cámara Roth	2326.2
Super LoLux	JVC		Stereomicrosope
Thermoshaker	Gerhardt	THL 500/1
Ti-E Microscopio de fluorescencia	Nikon	MEA53100
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	9090.3
Tryptone	Roth	8952.2
Baño ultrasónico	Bandelin Sonorex	RK 100
Bomba de vacío	Vacuubrand	MD 4C NT
Fuente de luz blanca para iluminación de epifluorescencia (100 W)	Microscopio Nikon MBF72655 TIRF
Extracto de levadura	Roth	2363.2
β-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148