Este protocolo describe cómo realizar una edición eficiente de la base de adenina sin limitación de PAM para construir un modelo preciso de la enfermedad del pez cebra utilizando zSpRY-ABE8e.
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Artículo de método
Edición de base eficiente sin PAM para el modelado de peces cebra de enfermedades genéticas humanas con zSpRY-ABE8e
En este artículo
Resumen
Resumen
La tecnología CRISPR / Cas9 ha aumentado el valor del pez cebra para modelar enfermedades genéticas humanas, estudiar la patogénesis de enfermedades y la detección de fármacos, pero las limitaciones del motivo adyacente del protoespaciador (PAM) son un obstáculo importante para crear modelos animales precisos de trastornos genéticos humanos causados por variantes de un solo nucleótido (SNV). Hasta ahora, algunas variantes de SpCas9 con amplia compatibilidad con PAM han demostrado eficiencia en el pez cebra. La aplicación del editor de base de adenina (ABE) mediado por SpRY optimizado, zSpRY-ABE8e y el ARNg modificado sintéticamente en el pez cebra ha permitido una conversión eficiente de la base de adenina-guanina sin restricción de PAM. Aquí se describe un protocolo para la edición eficiente de la base de adenina sin limitación de PAM en peces cebra que usan zSpRY-ABE8e. Al inyectar una mezcla de ARNm de zSpRY-ABE8e y ARNg modificado sintéticamente en embriones de pez cebra, se construyó un modelo de enfermedad del pez cebra con una mutación precisa que simulaba un sitio patogénico del factor de maduración del ribosoma TSR2 (tsr2). Este método proporciona una herramienta valiosa para el establecimiento de modelos de enfermedad precisos para estudiar los mecanismos y tratamientos de la enfermedad.
Introducción
Las variantes de un solo nucleótido (SNV) que causan mutaciones sin sentido o sin sentido son la fuente más común de mutaciones en el genoma humano1. Para determinar si un SNV en particular es patógeno y para arrojar luz sobre su patogénesis, se requieren modelos animales precisos2. El pez cebra son buenos modelos de enfermedades humanas, exhibiendo un alto grado de homología fisiológica y genética con los humanos, un ciclo de desarrollo corto y una fuerte capacidad reproductiva, lo que es ventajoso para la investigación de características y mecanismos patogénicos, así como para el cribado de drogas3
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Protocolo
Este estudio se realizó en estricto cumplimiento de las directrices del Comité de Cuidado y Uso de la Universidad Normal del Sur de China.
1. Preparación de ARNg modificado sintéticamente y ARNm de zSpRY-ABE8e
- Diseñar el ARNg según publicaciones anteriores37,38.
- Seleccione preferentemente NRN como la secuencia PAM, ya que zSpRY-ABE8e muestra una mayor preferencia por NRN PAM que NYN PAM (donde R es A o G, e Y es C o T)18. Asegúrese de que el nucleótido de adenina objetivo esté en la ventana de edición altamente activa (tercer....
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Resultados
Se ha descrito que la mutación de TSR2 causa anemia de Diamond Blackfan (DBA)42. Aquí, se construyó un modelo de pez cebra DBA con una mutación tsr2 (M1V) utilizando la estrategia i-Silence. La adenina del codón de inicio del pez cebra tsr2 se convirtió con éxito en guanina utilizando zSpRY-ABE8e (Figura 3).
El análisis EditR de los resultados de la secuenciación de Sanger mostró que había una superposición A/G en.......
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Discusión
Este protocolo describe la construcción de un modelo de enfermedad del pez cebra utilizando el editor base zSpRY-ABE8e. En comparación con la vía HDR tradicional para la sustitución de bases, este protocolo puede lograr una edición de base más eficiente y reducir la aparición de indeles. Al mismo tiempo, este protocolo implica la implementación de la estrategia de eliminación de genes i-Silence recientemente propuesta en el pez cebra. En conjunto, zSpRY-ABE8e mejorará la aplicación de modelos de pez cebra en la investiga.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a Barbara Garbers, PhD, de Liwen Bianji (Edanz) por editar el texto en inglés de un borrador de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación y Desarrollo del Área Clave de la Provincia de Guangdong (2019B030335001), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2019YFE0106700), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32070819, 31970782) y el Programa del Fondo de Investigación del Laboratorio Provincial Clave de Biología Patogénica y Epidemiología para Animales Acuáticos Económicos de Guangdong (PBEA2020YB05).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarosa | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarosa utilizada para hacer una placa de inyección |
| Capilares de vidrio de borosilicato | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Placas de cultivo celular | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra Kit de clonación de un solo paso | Vazyme | C115 | Kit para clon de infusión |
| Servicio de optimización de codones | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Longitud:32 mm, capacidad:0.5 μ L |
| Servicio de ARNg EasyEdit | |||
| Instrumento científico fino | 11254-20 | Se utiliza para romper meedle | |
| Tirador de micropipetas flameado/marrón | Instrumento de tartamudez | P-97 | Se utiliza para extraer los capilares de vidrio |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Se utiliza para la reacción de PCR |
| Caja de clima artificial inteligente | TENLIN | PRX-1000A | Se utiliza para cultivar embriones de pez cebra |
| Metilcelulosa | Sigma-Aldrich | M0512 | Se utiliza para fijar el pez cebra al fotografiar |
| las puntas de pipeta del microcargador nbsp; | Kit Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE | |||
| Mut Express II Kit de mutagénesis rápida V2 | Vazyme | C214-01 | Kit para mutagénesis dirigida al sitio |
| Microinyector neumático | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit para purificación de ARN |
| Sanger Servicio de secuenciación Sangon | Biotech | ||
| Hidróxido de sodio, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH utilizado para la extracción del genoma |
| Microscopio estereoscópico | Olympus | SZX10 | Utilizado para la fotografía del fenotipo |
| Microscopio estereoscópico con zoom de la serie SZ | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 | mMESSAGE Ambion | AM1348 | Kit para transcripción in vitro |
| TIANprep Mini Kit de Plásmidos | TIANGEN | DP103-03 | Kit para extracción de plásmidos |
| TIANquick Mini Kit de Purificación TIANGEN | DP203-02 | Kit para la purificación de plásmido linealizado | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Utilizado para anestesiar el pez cebra |
| Tris (hidroximetil) aminometano | Sangon | A600194-0500 | Componente de Tris· HCl utilizado para la extracción del genoma |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Endonucleasa de restricción utilizada para la linealización de plásmidos |
Referencias
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017....
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Reimpresiones y permisos
