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Enfoques basados en espectrometría de masas para el análisis de la estructura de orden superior de proteínas

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DOI:

10.3791/64979

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3 de marzo de 2023

 , 
1Biologics Development, Bristol Myers Squibb, 2Eli Lilly and Company

En este artículo

Resumen

ARTÍCULOS DISCUTIDOS:

Espino, J. A., Jones, L. M. Huella de proteínas de radicales hidroxilo in vivo para el estudio de las interacciones proteicas en Caenorhabditis elegans. Revista de Experimentos Visualizados. (158), E60910 (2020).

Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Caracterización de proteínas celulares con oxidación fotoquímica rápida de proteínas en la célula. Revista de Experimentos Visualizados. (157), E60911 (2020).

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Enfoques de espectrometría de masas para estudiar la estructura y las interacciones de proteínas en polvos liofilizados. Revista de Experimentos Visualizados. (98), E52503 (2015).

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. Una plataforma de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) para investigar enzimas biosintéticas peptídicas. Revista de Experimentos Visualizados. (159), E61053 (2020).

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Marcaje covalente con dietilpirocarbonato para el estudio de la estructura de orden superior de proteínas mediante espectrometría de masas. Revista de Experimentos Visualizados. (172), E61983 (2021).

Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Incubadora de plataforma con etapa XY móvil: Una nueva plataforma para implementar la oxidación fotoquímica rápida de proteínas en la célula. Revista de Experimentos Visualizados. (171), E62153 (2021).

Haupt, C. et al. Combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteínas intactas para estudiar la arquitectura de ensamblajes de proteínas de múltiples subunidades. Revista de Experimentos Visualizados. (129), E56747 (2017).

Lento, C. et al. Espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio por ionización por electrospray resuelta en el tiempo para estudiar la estructura y dinámica de proteínas. Revista de Experimentos Visualizados. (122), E55464 (2017).

Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Huella de proteínas de radicales hidroxilo libres de láser para realizar análisis estructurales de alto orden de proteínas. Revista de Experimentos Visualizados. (172), E61861 (2021).

Misra, S. K., Sharp, J. S. Habilitación de la compensación en tiempo real en oxidaciones fotoquímicas rápidas de proteínas para la determinación de cambios en la topografía de proteínas. Revista de Experimentos Visualizados. (163), E61580 (2020).

Chaihu, L. et al. Intercambio de hidrógeno/deuterio basado en electroforesis capilar para la caracterización conformacional de proteínas con espectrometría de masas de arriba hacia abajo. Revista de Experimentos Visualizados. (172), E62672 (2021).

Editorial

La estructura de orden superior (HOS) es un aspecto importante de la caracterización de proteínas, ya que está estrechamente relacionada con la función de las proteínas. La espectrometría de masas (MS) es uno de los métodos clave para evaluar la proteína HOS1. Aunque los enfoques basados en MS no pueden resolver la estructura de la proteína con resolución atómica, tienen las ventajas de una resolución espacial media a alta, alta especificidad, bajos requisitos de cantidad de muestra, alto rendimiento y capacidades proteómicas.

Los enfoques de huella de proteínas basados en MS evalúan el HOS de la proteína mediante el análisis de la superficie accesible al solvente de la proteína y, por lo general, se combinan con diferentes enfoques de etiquetado químico. El etiquetado reversible, como el intercambio hidrógeno-deuterio (HDX), se dirige a los hidrógenos amida de la columna vertebral en la proteína 1,2. El etiquetado irreversible utiliza productos químicos que se dirigen a residuos de aminoácidos específicos3 o radicales que marcan una variedad de residuos diferentes con mayor velocidad de reacción1. La reticulación química también forma parte de la categoría de etiquetado irreversible, pero su característica bivalente permite determinar las limitaciones espaciales entre dos sitios reticulados, lo que ofrece una visión topológica única 4,5. Todos estos enfoques se pueden combinar para formar una "caja de herramientas", lo que convierte a la EM en una herramienta valiosa para dilucidar el HOS de proteínas.

Organizamos esta colección de métodos para presentar los avances recientes en el campo del análisis HOS de proteínas basado en MS. El primer conjunto de artículos presenta enfoques basados en HDX. Habibi y Thibodeaux6 describen un enfoque HDX-MS continuo y ascendente relativamente clásico. Con el intercambio hidrógeno-deuterio (H/D) en solución en múltiples tiempos de intercambio seguido de la digestión de pepsina en columna, el nivel de absorción de deuterio se puede determinar a nivel de péptido. Al realizar experimentos diferenciales (es decir, estados unidos versus no unidos), los péptidos que muestran niveles de absorción de deuterio aumentados o disminuidos representan áreas que experimentan cambios en HOS. Los autores utilizan lanthipéptidos sintetasas para demostrar muy bien el flujo de trabajo HDX-MS.

Además del enfoque ascendente, HDX-MS también se puede realizar de arriba hacia abajo, lo que permite a los analistas aplicar diferentes estrategias de separación a nivel de proteína intacta. Chaihu et al.7 utilizan electroforesis capilar para separar diferentes estados proteicos o proteoformas que coexisten en la solución. Las proteínas se someten al intercambio H/D durante la electroforesis mientras migran en el capilar en la solución electrolítica de fondo deuterada, y esto es seguido por un análisis de MS de arriba hacia abajo y fragmentaciones en fase gaseosa para evaluar los niveles de absorción de deuterio tanto a nivel global como de fragmentos. Por último, también hay otros dos métodos en esta colección que destacan diferentes métodos de intercambio H/D, a saber, el intercambio por potencia liofilizada8 y el intercambio después de la ionización por electrospray9.

El segundo grupo de artículos cubre el método de etiquetado irreversible. Entre ellos, la oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) utiliza radicales como especies de etiquetado para marcar la superficie de la proteína 10,11. En la práctica, el peróxido de hidrógeno se fotoactiva a través de un láser para producir radicales hidroxilo, que sirven como especie de etiquetado activo. Misra y Sharp12 presentan una estrategia para la dosimetría radical en la que se utiliza la adenina como indicador de la concentración de radicales y se utiliza un sistema de dosimetría radical en línea para monitorear la respuesta de la adenina. Esto permite la compensación en tiempo real de las concentraciones de radicales hidroxilo y, por lo tanto, la normalización de las condiciones de reacción para ofrecer una lectura precisa. Posteriormente, Weinberger y Chea colaboraron con el grupo Sharp para desarrollar una plataforma FPOP13 sin láser. Al reemplazar el peligroso láser con una fuente de luz de plasma y combinarla con la dosimetría radical en línea y un sistema automatizado de recolección de muestras, desarrollan y proporcionan una solución integrada para los investigadores que necesitan caracterizar la proteína HOS.

Los tres artículos del grupo de Jones 14,15,16 exploran la posibilidad de llevar FPOP y huella de proteínas a estudios in vivo. La ventaja de este enfoque no tiene precedentes, ya que permite analizar la proteína HOS en el entorno nativo. La aplicación exitosa de la huella en las células14 y en Caenorhabditis elegans15 abre nuevas posibilidades para rastrear el HOS de todo el proteoma en su estado nativo, lo que permite una comprensión profunda de la proteína HOS que no se puede lograr a través de otras herramientas.

Otro método importante de etiquetado irreversible utiliza reactivos químicos que se dirigen a residuos de aminoácidos específicos3. Kirsch et al.17 informan de un flujo de trabajo bien utilizado de huella proteica a través del etiquetado covalente. Utilizando dietilpirocarbonato como reactivo de etiquetado, los autores investigan los cambios en el HOS de la proteína marcando algunos tipos de residuos de aminoácidos en la superficie de la proteína. A través de experimentos diferenciales seguidos de digestión proteolítica y análisis de MS de abajo hacia arriba, el flujo de trabajo permite identificar cambios en la accesibilidad de los disolventes, que se relacionan directamente con los cambios en HOS.

Por último, la reticulación química es otro enfoque importante que utiliza reactivos químicos bivalentes para marcar proteínas 4,5. Los reticulantes químicos se utilizan para reticular dos proteínas que están espacialmente cerca una de la otra y, a menudo, forman un complejo estructural. Haupt et al.18 informan de un protocolo en el que demuestran el uso de reticulantes químicos para comprender la arquitectura de los complejos proteicos. El complejo proteico reticulado se puede analizar en dos niveles diferentes. A través de la digestión proteolítica seguida de la identificación de MS, los dipéptidos reticulados revelan los sitios de interacción del complejo proteico. Al analizar la muestra reticulada a través de la masa intacta, la información estequiométrica sobre las subunidades de proteínas dentro del complejo está fácilmente disponible.

En resumen, hemos sido testigos de un desarrollo sustancial en las herramientas basadas en MS para el análisis de HOS de proteínas durante las últimas tres décadas. La huella irreversible y reversible junto con el análisis de MS se complementan entre sí y juntos contribuyen significativamente a la caracterización de HOS de proteínas. Los trabajos incluidos en esta colección de métodos representan métodos de vanguardia en el campo del análisis de HOS de proteínas basado en MS; estos estudios son un recurso valioso para los investigadores que intentan utilizar enfoques basados en la EM para responder preguntas críticas. Desde una perspectiva más amplia, la incorporación de datos de huellas en las predicciones estructurales es fundamental para romper el límite de la resolución espacial en los métodos basados en MS. Existen trabajos pioneros que demuestran la viabilidad de tal enfoque19,20. Además, la integración de la plataforma también es crucial, ya que estos enfoques son complementarios entre sí y proporcionan información desde diferentes perspectivas21,22. Los métodos informados en esta colección demuestran el poder de dicha integración, y habrá un desarrollo continuo en esta dirección. Con todos estos avances, el enfoque basado en la EM ha crecido más allá de la determinación del peso molecular, y se verá un crecimiento continuo en este campo en las próximas décadas.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores no tienen agradecimientos.

Referencias

  1. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: Fundamentals and applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2020).
  2. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224-1234 (2011).
  3. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing protein structure by amino acid-specific covalent labeling and mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (5), 785-815 (2009).
  4. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein–protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
  5. Leitner, A. Cross-linking and other structural proteomics techniques: How chemistry is enabling mass spectrometry applications in structural biology. Chemical Science. 7 (8), 4792-4803 (2016).
  6. Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes. Journal of Visualized Experiments. (159), e61053(2020).
  7. Chaihu, L., et al. Capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e62672(2021).
  8. Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass spectrometric approaches to study protein structure and interactions in lyophilized powders. Journal of Visualized Experiments. (98), e52503(2015).
  9. Lento, C., et al. Time-resolved electrospray ionization hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
  10. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  11. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  12. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61580(2020).
  13. Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins. Journal of Visualized Experiments. (172), e61861(2021).
  14. Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (157), e60911(2020).
  15. Espino, J. A., Jones, L. M. In vivo hydroxyl radical protein footprinting for the study of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e60910(2020).
  16. Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Platform incubator with movable XY stage: A new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (171), e62153(2021).
  17. Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e61983(2021).
  18. Haupt, C., et al. Combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies. Journal of Visualized Experiments. (129), e56747(2017).
  19. Biehn, S. E., Lindert, S. Accurate protein structure prediction with hydroxyl radical protein footprinting data. Nature Communications. 12 (1), 341(2021).
  20. Biehn, S. E., Lindert, S. Protein structure prediction with mass spectrometry data. Annual Review of Physical Chemistry. 73, 1-19 (2022).
  21. Zhang, M. M., et al. Epitope and paratope mapping of PD-1/nivolumab by mass spectrometry-based hydrogen-deuterium exchange, cross-linking, and molecular docking. Analytical Chemistry. 92 (13), 9086-9094 (2020).
  22. Zhang, M. M., et al. An integrated approach for determining a protein–protein binding interface in solution and an evaluation of hydrogen–deuterium exchange kinetics for adjudicating candidate docking models. Analytical Chemistry. 91 (24), 15709-15717 (2019).

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