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Las interacciones biomoleculares son actores clave en los procesos biológicos y, por lo tanto, un aspecto fundamentalmente importante de las ciencias de la vida. Las técnicas de fluorescencia se han convertido en algunos de los métodos más poderosos y ampliamente aplicados para investigar y comprender estos procesos. Los enfoques de fluorescencia in vitro ofrecen el potencial para la detección en tiempo real de interacciones moleculares extracelulares e intracelulares, lo que constituye una gran ventaja sobre otros enfoques. Esto se ha utilizado para una variedad de interacciones proteína-proteína, proteína-ácido nucleico y proteína-membrana, que juegan un papel crucial en la regulación de los procesos celulares.
Esta colección ofrece una visión general de varias técnicas y aplicaciones basadas en fluorescencia para el estudio de las interacciones biomoleculares y amplía nuestra comprensión de los procesos celulares.
Reiser et al.1 describen un método de alto rendimiento para analizar la cinética celular de células individuales a través de la adquisición y el procesamiento automatizados de imágenes (Live Cell Imaging on Single Cell Arrays [LISCA]). Usando esta técnica, los reporteros fluorescentes proporcionan una lectura resuelta en el tiempo de varios procesos biológicos independientes, como la expresión génica de una sola célula después de la transfección, la respuesta celular en cascadas de señalización, eventos apoptóticos o diferenciación de células madre. Los autores realizan imágenes en matrices de células aisladas utilizando microscopía de lapso de tiempo de barrido, lo que lleva a cientos de trayectorias de células individuales y suficientes datos para el análisis estadístico. Los rastros de tiempo de fluorescencia de una sola célula ayudarán a los investigadores a comprender mejor los mecanismos de administración de genes y resolver la heterogeneidad celular, un sello distintivo de los sistemas biológicos complejos normalmente dictados por fluctuaciones intrínsecas.
Konate et al.2 informan de un método biofísico para caracterizar la interacción, perturbación y/o permeabilización de péptidos que interactúan con la membrana. En su protocolo, describen con precisión los diferentes pasos para formular y purificar liposomas y caracterizar la fuga de fluorescencia. El método se aplica con un péptido penetrante en células (CPP) llamado WRAP en asociación con un pequeño ARN interferente (siRNA) o combinado con un potente péptido terapéutico (iCAL36) y se compara con el conocido CPP, penetratina. Esta técnica presenta múltiples ventajas. Es rápido y sencillo de implementar. Permite un control estricto de la composición de la membrana lipídica para imitar diferentes tipos de membranas celulares. Los fluoróforos se pueden adaptar según el péptido de interés y sus propiedades de fuga de membrana. Finalmente, la muestra es extremadamente estable después de la preparación. La versatilidad de la técnica la convierte en un enfoque útil para sondear diversas cuestiones biológicas relacionadas con el daño celular o la administración de fármacos.
La presencia de fosfatidilserina (PS) en las membranas celulares de los mamíferos es importante en diferentes procesos de señalización como la apoptosis celular o en el reclutamiento de proteínas para la reparación de membranas. La transferencia y los cambios en la distribución de PS en la superficie de las membranas plasmáticas son una cuestión clave que Ikhlef et al.3 abordan con su artículo. Describen un protocolo para medir en tiempo real el transporte e intercambio de lípidos PS y PI-4-P por la proteína de levadura recombinante Osh6p. El método utiliza sensores fluorescentes para detectar si una proteína de transferencia de lípidos (LTP) extrae o transfiere lípidos en membranas artificiales a lo largo de un gradiente entre vesículas lipídicas. Este protocolo permite trabajar con lípidos no marcados para permitir la correcta unión de los lípidos a la LTP. Además, se logra una mejor resolución temporal en comparación con los métodos convencionales, como los ensayos basados en radiactividad o la espectrometría de masas. Este método ayudará a los investigadores a comprender mejor la extracción y el intercambio de lípidos entre diferentes orgánulos y membranas.
La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) es un método poderoso para estudiar sistemas biomoleculares. Esta técnica se puede aplicar a moléculas individuales (por ejemplo, smFRET) y permite medir distancias absolutas dentro de biomoléculas. Abdelhamid et al.4 presentan un protocolo paso a paso sobre cómo realizar smfBox, una configuración confocal recientemente desarrollada capaz de medir la eficiencia de FRET entre dos colorantes en moléculas individuales de difusión libre. Muestran cómo implementar y utilizar la técnica smFRET desde la preparación de la muestra hasta la configuración, alineación, adquisición de datos y análisis del instrumento. Además, describen cómo determinar los factores de corrección necesarios para mediciones precisas de distancia derivadas de FRET. Aquí, el método se aplica a dúplex de ADN de difusión libre y se puede extender a una amplia gama de aplicaciones, como el estudio de cambios conformacionales de proteínas o interacciones proteína-ADN.
Los procesos biológicos implican interacciones biomoleculares muy diversas y numerosas que dejan un amplio espacio para el desarrollo de nuevos ensayos o sensores basados en fluorescencia. Esta colección ofrece a los investigadores una visión general de las innovaciones y desarrollos en los métodos basados en fluorescencia. Cada artículo arroja luz sobre un método diferente basado en la fluorescencia, destacando cuán importantes y versátiles se han vuelto los ensayos fluorescentes. La colección describe estos métodos y, por lo tanto, fomenta su uso generalizado entre diferentes grupos y áreas de investigación.