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Históricamente, los científicos se han basado en gran medida en estudios en animales para determinar si un producto médico (es decir, un medicamento o dispositivo médico) es seguro antes de probarlo en humanos. Si bien la experimentación con animales todavía está justificada en muchas situaciones, encontrar alternativas es muy deseable. Con los recientes avances en ciencia e ingeniería, el desarrollo de alternativas a la experimentación con animales es más factible que nunca. Un enfoque renovado en el desarrollo de métodos alternativos in vitro humanos para la evaluación de la seguridad cardíaca es atribuible, al menos parcialmente, a los avances en la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Las células cardíacas humanas se pueden generar en un laboratorio utilizando una simple muestra de sangre o piel de un paciente, lo que produce cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC-CM) adecuados para pruebas sólidas de alto rendimiento. El progreso en la bioingeniería de tejidos 3D, las tecnologías de matriz de microelectrodos, las imágenes de células vivas y otras tecnologías también han sido fundamentales para el desarrollo de los protocolos incluidos en esta colección.
El protocolo de Gerges et al.1 aplica un método óptico no invasivo (MyoBLAZER) para evaluar los cambios en la contractilidad en cardiomiocitos ventriculares primarios humanos adultos. Las células tienen un ritmo eléctrico y el análisis de imágenes mide el acortamiento del sarcómero en varias células en paralelo. Este método puede recopilar curvas de concentración-respuesta cada 30 minutos por compuesto por dispositivo y proporciona datos de relación estructura-actividad. Este método óptico no invasivo ayuda a preservar la fisiología y la farmacología de los cardiomiocitos humanos adultos durante el cribado de alto rendimiento. Además, el uso de cardiomiocitos adultos humanos puede proporcionar una pieza traslacional crítica para predecir la contractilidad.
La metodología de Lickiss et al.2 presenta una tecnología híbrida de contractilidad e impedancia/potencial de campo extracelular (EFP), que agrega características significativas de pro-maduración a una plataforma de 96 pocillos estándar de la industria mediante el uso de un sustrato de cultivo celular blando, flexible y basado en silicio. El enfoque demostró ser exitoso al restablecer la respuesta inotrópica fisiológica positiva al isoproterenol en hiPSC-CM sanos disponibles comercialmente, que está ausente a sabiendas en el cultivo estándar (sustrato rígido) sin la necesidad de un sistema 3D. El sistema híbrido permite la medición directa de la fuerza de contracción (mN/mm2), la frecuencia de batido, así como la densidad e integridad de la monocapa celular. También aborda los desafíos de un sistema 3D tradicional (es decir, bajo rendimiento, necesidades de capacitación considerables), lo que reduce el tiempo y los costos necesarios para completar el ensayo.
La colección también incluye el trabajo de Feaster et al.3, quienes demuestran un método in vitro, de alto rendimiento y no invasivo para evaluar la terapia de modulación de la contractilidad cardíaca (CCM) en cardiomiocitos de células madre humanas 2D colocados en un colchón flexible Matrigel, utilizando microscopía basada en video sin sonda. Los autores destacan los efectos agudos de la CCM sobre las propiedades contráctiles de las hiPSC-CM sanas y enfermas. Esta herramienta ofrece un método de bajo costo para comprender la seguridad o eficacia de los CCM, y podría reducir la dependencia de los estudios en animales y ayudar en la toma de decisiones regulatorias de los dispositivos médicos de electrofisiología cardíaca.
El protocolo refinado de Schaefer et al.4 describe una nueva extensión del sistema estándar de matriz de microelectrodos (MEA) que normalmente registra el potencial de campo extracelular en hiPSC-CM, lo que permite registros de potencial de acción intracelular mediante la apertura de membranas celulares con pulsos de rayos láser de nanosegundos. Este dispositivo no solo incluye ventajas estándar de MEA (es decir, monitoreo de propagación de señales, experimentos agudos y crónicos), sino que también permite una visión de la forma del potencial de acción intracelular sin el uso de fuertes pulsos de campo eléctrico para la electroporación celular.
El protocolo de Berry et al.5 describe una nueva plataforma que permite la fabricación reproducible de tejidos musculares diseñados en 3D (EMT) para mediciones directas de la fuerza de contractilidad. El instrumento puede detectar cambios de micronewton en la fuerza de contractilidad, lo que lo convierte en una poderosa herramienta para el cribado de compuestos dependientes de la dosis. La contractilidad en el tejido cardíaco basado en hiPSC, así como en los tejidos del músculo esquelético, se puede registrar en hasta 24 tejidos simultáneamente, y los datos se pueden analizar longitudinalmente durante semanas o meses. Por lo tanto, se requieren habilidades o capacitación adicionales mínimas para los investigadores.
Finalmente, la publicación de Zhao et al.6 describe una serie de ensayos funcionales (potencial de campo extracelular, potencial de acción, contractilidad y calcio) optimizados para su uso con cardiomiocitos que pueden ser generados internamente por los laboratorios de los usuarios. Esto se puede hacer utilizando protocolos de diferenciación publicados previamente e iPSC disponibles en el Biobanco del Instituto Cardiovascular de la Universidad de Stanford (https://med.stanford.edu/scvibiobank/request-cells.html), que proporcionan una amplia gama de células "enfermas" y de control. Este es un conjunto completo de métodos para los principales registros de contractilidad cardíaca y electrofisiología, incluidos los enfoques estándar (pinza de parche, matrices de microelectrodos, sondas de fluorescencia sensibles al calcio y mediciones de contractilidad basadas en video).
En conclusión, si bien la colección de métodos actual no pretende ser completa (y continúa creciendo), ya es un conjunto relativamente completo de métodos que ilustra muchos desafíos actuales en contractilidad y registros electrofisiológicos en cardiomiocitos humanos. Incluye protocolos para cardiomiocitos humanos primarios1, hiPSC-CM disponibles comercialmente derivados de donantes sanos 2,3,4, así como protocolos optimizados para células portadoras de una característica de cardiopatía congénita 3,6. Estos métodos abarcan diversas condiciones de cultivo celular, desde células individuales para experimentos de pinza de parche6, hasta monocapas 2D de hiPSC-CM convencionales en sustratos rígidos 1,4, monocapas de cardiomiocitos 2D en sustratos blandos y flexibles 2,3 y, finalmente, tejidos cardíacos diseñados en 3D5. Los métodos incluidos utilizan diferentes enfoques para el registro de los parámetros de fisiología cardíaca más relevantes, como la contractilidad (medida indirectamente con ensayos basados en video 1,3,6 o directamente con la fuerza contráctil 2,5), el potencial de acción (en una sola célula usando patchclamp 6, un potencial de campo extracelular sustituto con un MEA 4,6, o mediante el uso de un enfoque novedoso para que las células registren registros similares al potencial de acción con el sistema MEA estándar4) y transitorios de calcio (utilizando sondas sensibles al calcio6). En conjunto, estos métodos proporcionan no solo protocolos detallados que se pueden reproducir en otros laboratorios, sino que también ilustran algunos de los desafíos con los métodos cardíacos in vitro humanos, tales como: inmadurez de hiPSC-CM, especialmente cuando se usa un cultivo 2D estándar en sustrato rígido; efectos no deseados de las sondas fluorescentes sensibles al voltaje o al calcio; bajo rendimiento de los registros de potencial de acción convencional; dificultades en la interpretación de los registros de duración potencial de campo estándar; y falta de ensayos para la evaluación de dispositivos médicos (p. ej., frente a medicamentos). Es inspirador ver cuántos laboratorios están trabajando para mejorar estos métodos, lo que inevitablemente conducirá a una amplia adaptación de estos métodos en el futuro.