El objetivo de este protocolo es determinar los niveles autofágicos en el cáncer de páncreas y las células acinares pancreáticas a través de la inmunofluorescencia LC3 y la cuantificación de puntos LC3.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Evaluación de los niveles de autofagia en dos modelos diferentes de células pancreáticas utilizando inmunofluorescencia LC3
En este artículo
Resumen
Resumen
La autofagia es un proceso catabólico especializado que degrada selectivamente los componentes citoplasmáticos, incluidas las proteínas y los orgánulos dañados. La autofagia permite a las células responder fisiológicamente a los estímulos de estrés y, por lo tanto, mantener la homeostasis celular. Las células cancerosas pueden modular sus niveles de autofagia para adaptarse a condiciones adversas como hipoxia, deficiencia de nutrientes o daño causado por la quimioterapia. El adenocarcinoma pancreático ductal es uno de los tipos de cáncer más mortales. Las células de cáncer de páncreas tienen una alta actividad de autofagia debido a la regulación transcripcional positiva y la activación postraduccional de las proteínas de autofagia.
Aquí, la línea celular PANC-1 se utilizó como modelo de células de cáncer de páncreas humano, y la línea celular acinar pancreática AR42J se utilizó como modelo fisiológico de células de mamíferos altamente diferenciadas. Este estudio utilizó la inmunofluorescencia de la cadena ligera 3 de la proteína asociada a microtúbulos (CL3) como un indicador del estado de activación de la autofagia. La CL3 es una proteína de autofagia que, en condiciones basales, muestra un patrón difuso de distribución en el citoplasma (conocido como LC3-I en esta condición). La inducción de autofagia desencadena la conjugación de CL3 a fosfatidiletanolamina en la superficie de los autofagosomas recién formados para formar LC3-II, una proteína unida a la membrana que ayuda en la formación y expansión de autofagosomas. Para cuantificar el número de estructuras autofágicas etiquetadas, se utilizó el software de código abierto FIJI con la ayuda de la herramienta "3D Objects Counter".
La medida de los niveles autofágicos tanto en condiciones fisiológicas como en células cancerosas nos permite estudiar la modulación de la autofagia en diversas condiciones como la hipoxia, el tratamiento de quimioterapia o el derribo de ciertas proteínas.
Introducción
La macroautofagia (comúnmente conocida como autofagia) es un proceso catabólico especializado que degrada selectivamente los componentes citoplasmáticos, incluidas las proteínas y los orgánulos dañados 1,2. La autofagia permite a las células responder fisiológicamente a los estímulos de estrés y, así, mantener la homeostasis celular3. Durante la autofagia, se forma una vesícula de doble membrana: el autofagosoma. El autofagosoma contiene las moléculas de carga y las conduce al lisosoma para su degradación 1,4.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación celular
- Remoje los cubreobjetos redondos de 12 mm en etanol absoluto y colóquelos verticalmente en los pocillos de una placa de 24 pocillos.
- Retire la cubierta y exponga la placa de pocillos múltiples a la radiación ultravioleta durante 15 minutos.
- Coloque los cubreobjetos horizontalmente y lávelos con el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco.
- Sembrar un número bajo de células pancreáticas. La cantidad debe ajustarse para obtener una confluencia del 50%-75% el día de la fijación16.
NOTA: Se recomienda sembrar 2.5 × 10 4 PANC-1 o 4 × 104 células AR42J p....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Este protocolo realiza inmunofluorescencia de CL3 en líneas celulares pancreáticas para determinar los niveles de autofagia en diferentes condiciones. El resultado de este experimento fue la obtención de imágenes celulares de los canales rojo y azul, correspondientes a LC3 y DAPI. Las imágenes de LC3 indican la distribución celular de esta proteína, mientras que la DAPI muestra la localización nuclear. La Figura 2A muestra una imagen representativa de la inmunofluorescencia de LC3 y su fusió.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El método descrito en este protocolo permite visualizar la distribución endógena de CL3 en la célula y cuantificar los niveles autofágicos en diferentes condiciones. Otro método similar utilizado para analizar la distribución de CL3 y determinar la activación de la autofagia implica la transfección de LC3 marcada con fluorescencia (como RFP-LC3)19. La transfección RFP-LC3 tiene las ventajas de no necesitar fijación (lo que permite aplicar este método en imágenes de células vivas2.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No se declararon conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por becas de la Universidad de Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), el Consejo Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; y PUE 22920170100033) y la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (PICT 2019-01664).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| cubreobjetos redondos de 12 mm | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 pocillos placa de cultivo celular | Sorfa | 220300 | |
| Etanol absoluto | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Burro anti-conejo IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Microscopio de barrido láser confocal | Zeiss | LSM 800 | |
| Dexametasona | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Suero fetal bovino | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Tecnología de señalización celular | 3868S | |
| Metanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (película de sellado de laboratorio) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Tripsina EDTA | Gibco | 11570626 |
Referencias
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146(2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36<....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
