El ojo contiene medios transparentes que carecen de vasos sanguíneos, incluida la córnea, el cristalino del ojo y el vítreo. La luz debe pasar a través de estos medios antes de llegar a los fotorreceptores en la parte posterior de la retina. Específicamente, la córnea, el cristalino del ojo y el vítreo carecen de vasos sanguíneos para evitar la absorción de la luz y la distorsión de las imágenes1. Los vasos sanguíneos de la retina están organizados en tres capas: la capa superficial, que se extiende desde el disco óptico hasta la periferia dentro de la capa de fibras nerviosas; la capa intermedia, que se encuentra dentro de la capa plexiforme interna; y la capa profunda, que se distribuye a través de la capa plexiforme externa. Esta red vascular suministra sangre a la retina interna, mientras que los fotorreceptores se suministran por difusión desde los vasos sanguíneos coroideos. La nutrición de las retinas internas y externas está estrictamente controlada por las barreras hematorretinianas internas y externas (BRB). Las células endoteliales de la retina, los pericitos y las células gliales constituyen el BRB interno. Por otro lado, las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR), las células endoteliales coroideas y la membrana de Bruch forman el BRB externo. Los cambios patológicos en los vasos sanguíneos de la retina son las características distintivas de varias enfermedades de la retina, como la retinopatía diabética, la degeneración macular relacionada con la edad y la retinopatía del prematuro. Estos cambios patológicos incluyen, entre otros, inflamación vascular, descomposición del BRB, degeneración capilar, cambios en el flujo sanguíneo de la retina y neovascularización retiniana patológica (RNV)2,3,4. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos efectivos para estudiar estos cambios tanto in vivo utilizando animales de experimentación como in vitro mediante el cultivo de diversas células de la retina en condiciones similares al entorno biológico y bioquímico en las enfermedades humanas. Los investigadores pueden utilizar varios enfoques experimentales para diseccionar los mecanismos moleculares y celulares subyacentes de las enfermedades vasculares de la retina. El objetivo de esta colección de métodos es compartir con otros investigadores la experiencia de los científicos de la visión y los oftalmólogos en términos de métodos para estudiar el desarrollo vascular normal y las anomalías vasculares en diversas enfermedades de la retina.
El artículo de Damsgaard et al. presenta un método de ultrasonido mejorado por flujo que permite a los investigadores obtener imágenes de las vasculaturas oculares en tres dimensiones sin el uso de agentes de contraste5. Este método supera las limitaciones de otros métodos debido a su estabilidad en la obtención de imágenes del ojo detrás de la retina pigmentada. Aunque el método se ha demostrado en peces dorados, se puede aplicar a todas las demás especies experimentales con glóbulos rojos nucleados. Este método es valioso para visualizar los vasos sanguíneos oculares en condiciones normales y patológicas y podría ser útil para estudiar el flujo sanguíneo ocular. Sin embargo, este método está limitado por la falta de glóbulos rojos nucleados en los mamíferos. Por lo tanto, en comparación con las especies con glóbulos rojos nucleados, el ultrasonido de flujo mejorado solo produce contraste de flujo sanguíneo en mamíferos. Además, este método es sensible al ruido de movimiento, como los movimientos respiratorios, que pueden crear imágenes y artefactos borrosos. Este ruido de movimiento se puede ajustar mediante una activación prospectiva o retrospectiva. Tanto para las adquisiciones 2D como para las 3D, es crucial limitar los artefactos de movimiento causados por el movimiento del animal debido a una anestesia inadecuada o por una configuración inestable del transductor. El desarrollo de esta técnica allana el camino para el examen in vivo no invasivo de las redes vasculares profundas en el ojo en la gran mayoría de los vertebrados que poseen eritrocitos nucleados.
El método presentado por Macouzet-Romero et al. evalúa la contribución relativa de los vasos retinianos a la densidad de perfusión macular utilizando tomografía de coherencia óptica (OCT)-angiografía6. Este método caracteriza la proporción de un área con circulación de vasos dilatados. Cabe destacar que la dilatación vascular puede ser una respuesta a condiciones patológicas. Este enfoque puede delinear indirectamente la vasodilatación e identificar indirectamente la baja oxigenación en enfermedades vasculares de la retina, como la retinopatía diabética (RD), la oclusión de la vena central o la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE). Utilizando este método, los principales hallazgos de Macouzet-Romero et al.6 fueron que la contribución de los vasos más grandes que los capilares de la retina a la circulación retiniana fue del 18,2% en sujetos sanos. Por lo tanto, este porcentaje podría usarse como referencia para identificar cambios tempranos en la densidad de perfusión debido a enfermedades vasculares de la retina. Por ejemplo, la contribución porcentual fue del 2,6% en pacientes con hipertensión arterial y del 16,4% en pacientes con diabetes, lo que sugiere que este método podría usarse potencialmente para evaluar la progresión de enfermedades de la retina asociadas con anomalías vasculares.
El método presentado por Subirada et al. evalúa diferentes parámetros de alteraciones vasculares (extensión de la degeneración capilar [áreas avasculares], neovascularización patológica de la retina [áreas neovasculares], dilatación y tortuosidad de las arteriolas retinianas) en modelos experimentales de retinopatías isquémicas, como la retinopatía inducida por oxígeno (OIR) y la diabetes experimental7. Cabe destacar que la OIR reproduce la retinopatía del prematuro y algunos aspectos de la retinopatía diabética proliferativa. La capacidad de cuantificar el alcance de la neovascularización de la retina (RNV) o la degeneración capilar en modelos experimentales es fundamental para estudiar los mecanismos moleculares y celulares subyacentes, así como para probar los posibles efectos terapéuticos de las intervenciones farmacológicas o moleculares. En resumen, este artículo presenta técnicas clásicas, bien establecidas y reproducibles para cuantificar algunos de los parámetros vasculares más relevantes considerados en la práctica clínica.
El artículo de Vaglienti et al. presenta métodos para medir los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células gliales de Müller8. Se ha establecido el papel del estrés oxidativo en la disfunción microvascular retiniana en las retinopatías isquémicas y ha alentado a los investigadores a investigar hasta qué punto las especies reactivas de oxígeno (ROS) contribuyen a la descomposición del BRB y el RNV tanto in vivo como in vitro 9,10,11,12 . Vaglienti et al. utilizan diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína (DCFD) para evaluar los niveles de generación intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS). Este método se basa en la difusión de DCFD en la célula y luego en la oxidación de DCFD por ROS en 2', 7' –diclorofluoresceína (DCF). El DCF es altamente fluorescente y se puede detectar mediante citometría de flujo o microscopía confocal. Este método puede obtener imágenes y medir los niveles de generación de ROS tanto en las células como en los tejidos de la retina.
El artículo de Tomaszewski et al. demuestra el aislamiento y crecimiento de células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) de ratón13. Las células del EPR contribuyen al BRB externo y desempeñan un papel esencial en la hemostasia y la integridad de los fotorreceptores. La disfunción de las células del EPR es un sello distintivo de varias enfermedades de la retina, incluidas, entre otras, la DMAE y la RD. Por lo tanto, los estudios in vitro de la función de las células del EPR en la salud y la enfermedad son fundamentales para comprender los mecanismos moleculares y celulares de varias enfermedades vasculares de la retina. Para ello, el aislamiento primario de células EPR podría ser una herramienta importante para estudiar los mecanismos subyacentes y la patogénesis de diferentes enfermedades oculares, así como para proponer nuevas aplicaciones terapéuticas para esas enfermedades. Esta técnica permite el estudio de los cambios en la estructura y función de las células del EPR y su impacto en el BRB externo en la DMAE y la RD. Además, la técnica se puede aplicar para estudiar cambios en células RPE aisladas de ratones C57BL6 de tipo salvaje y diferentes ratones modificados genéticamente y para probar diferentes compuestos farmacológicos como dianas terapéuticas para la DMAE14.
El artículo de Elmasry et al. presenta un modelo experimental ex vivo que se puede utilizar para estudiar enfermedades neurovasculares de la retina mediante el cultivo de explantes de retina durante un período prolongado15. En este sistema ex vivo, los explantes de retina presentan redes vasculares y gliales intactas y neuronas retinianas hasta por 2 semanas en cultivo. Los explantes organotípicos de la retina han surgido como una herramienta fiable para estudiar las enfermedades de la retina, como la RD y las enfermedades degenerativas de la retina16,17. En comparación con otras técnicas existentes, el uso de explantes de retina admite tanto cultivos de células retinianas in vitro como modelos animales in vivo al agregar una característica única que permite el examen de la diafonía entre varias células de la retina (por ejemplo, células vasculares, gliales y neuronales) bajo los mismos parámetros bioquímicos e independientemente de las variables sistémicas. Los cultivos de explantes mantienen varias células de la retina juntas en el mismo entorno y conservan las interacciones físicas y moleculares intercelulares. Además, los estudios han demostrado que los explantes de retina pueden preservar la estructura morfológica y la funcionalidad de las células retinianas cultivadas. En resumen, los explantes de retina pueden proporcionar una plataforma adecuada para investigar la diafonía entre varias células de la retina en respuesta a cambios bioquímicos, como la hiperglucemia y la hipoxia, similares a los observados en la retinopatía diabética (RD) o la retinopatía del prematuro (ROP). Este enfoque también permite probar intervenciones terapéuticas en un entorno bioquímico restringido. El cultivo de explantes de retina representa una técnica controlable y un modelo experimental muy flexible que permite numerosas manipulaciones farmacológicas y puede descubrir varios mecanismos moleculares de enfermedades de la retina.