Monitorización de la pexofagia mediada por Stub1

Resumen

Este protocolo proporciona instrucciones para desencadenar y monitorear la pexofagia mediada por Stub1 en células vivas.

Resumen

Las células de mamíferos pueden voltear los peroxisomas a través de la pexofagia mediada por Stub1. La vía potencialmente permite el control celular de la cantidad y calidad de los peroxisomas. Durante este proceso, la proteína de choque térmico 70 y la ubiquitina E3 ligasa, Stub1, se translocan en los peroxisomas para ser volteados para iniciar la pexofagia. La actividad de la ligasa Stub1 permite la acumulación de ubiquitina y otros módulos relacionados con la autofagia en peroxisomas específicos. La elevación de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro de la luz peroxisomal puede activar la pexofagia mediada por Stub1. Por lo tanto, se puede utilizar la generación de ROS asistida por colorante para desencadenar y monitorear esta vía. Este artículo describe los procedimientos para usar dos clases de colorantes, proteínas fluorescentes y fluoróforos sintéticos, para iniciar la pexofagia dentro de cultivos celulares de mamíferos. Estos protocolos basados en la generación de ROS asistidos por colorante no solo se pueden usar para atacar todos los peroxisomas dentro de una población celular a nivel mundial, sino que también pueden permitir la manipulación de peroxisomas individuales dentro de células individuales. También describimos cómo se puede seguir la pexofagia mediada por Stub1 utilizando microscopía de células vivas.

Introducción

Los peroxisomas son orgánulos unidos a una sola membrana presentes en la mayoría de las células eucariotas. Los peroxisomas son un compartimento metabólico esencial para llevar a cabo la beta-oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga, catabolismo de purina y síntesis de fosfolípidos y ácidos biliares^{éter 1}. La acetil-CoA derivada de peroxisomas controla la homeostasis lipídica regulando la señalización central en el metabolismo². Por lo tanto, no es de extrañar que las funciones peroxisomales comprometidas estén implicadas en diversas enfermedades, incluyendo trastornos neurodegenerativos, enve....

Protocolo

1. Preparación de células que expresan diKillerRed o proteínas automarcantes (SLP) en la luz del peroxisoma

1. Siembra las células deseadas en placas de cultivo celular con fondo de vidrio. Para el experimento aquí, sembrar 2 x 10⁵ células SHSY5Y humanas en 840 μL de medio de cultivo (DMEM / F-12 suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina / estreptomicina) o 6 x 10 4 células NIH3T3^{de ratón en} 840 μL de medio de cultivo (DMEM suplementado con 10% de suero bovino y 1% de penicilina/estreptomicina) en una placa de cultivo de 35 mm con un micropocillo de vidrio de 20 mm de diámetro.
   NOTA: El número de cél....

Resultados

El esquema de inducción de pexofagia mediado por Stub1 que se muestra aquí aprovecha la generación de ROS asistida por colorante dentro de la luz del peroxisoma. Esta operación requiere intensidades de luz mínimas. Por lo tanto, los peroxisomas que contienen proteínas o colorantes fluorescentes pueden iluminarse utilizando microscopios confocales estándar de barrido láser. La iluminación focal conduce a la producción instantánea y localizada de ROS dentro de los peroxisomas individuales, como lo indica el reportero fluor.......

Discusión

Este protocolo detalla cómo desencadenar la pexofagia mediada por Stub1 dentro de cultivos celulares elevando los niveles de ROS peroxisomales con luz. Como el protocolo se basa en la generación de ROS asistida por colorante, es necesario garantizar una expresión suficiente de diKillerRed-VKSKL o tinción de ligando SLP marcada con colorante dentro de las células de interés. Dado que diferentes tipos de células o células de diferentes antecedentes genéticos pueden albergar peroxisomas con propiedades ligeramente diferente.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de cultivo de 35 mm con un micropocillo de vidrio de 20 mm de diámetro	MatTek	P35G-1.5-20-C	20 mm con fondo de vidrio
3-amino-1,2,4-triazol (3-AT)	Sigma Aldrich	A8056
suero bovino	ThermoFisher Scientific	16170060
incubadora de cultivos celulares	Nuaire	NU-4750
diKillerRed-PTS1	Academia Sinica		fabricada mediante la adición del dímero tándem KillerRed con PTS1(VKSKL)
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)	ThermoFisher Scientific	11965092
Mezcla de medio/nutrientes de águila modificada de Dulbecco F-12 (DMEM/F-12)	ThermoFisher Scientific	11330032
EGFP-C1	Clontech	pEGFP-C1	La columna vertebral de EGFP-C1 se utilizó para la clonación de EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70	Academia Sinica		PCR del gen Hsp70 (HSPA1A) amplificada a partir de ADNc HeLa y clonada en EGFP-C1
EGFP-LC3B	Addgene	11546
EGFP-p62	Academia Sinica		generado mediante la inserción del gen SQSTM1 humano (a través de la amplificación por PCR del ADNc de la célula HeLa) en EGFP-C1
EGFP-Stub1	Academia Sinica		generado mediante la inserción del gen Stub1 de ratón (a través de la amplificación por PCR del ADNc total del riñón de ratón) en EGFP-C1
EGFP-Ub	Addgene	11928
suero fetal bovino	ThermoFisher Scientific	10437028
HaloTag TMR ligando	Promega	G8252
HaloTag-PTS1	Academia Sinica		PTS1 anexado y clonado en la columna vertebral EGFP-C1
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
Microscopio Confocal Invertido	Microscopio Olympus	FV3000RS	405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex  con incubadora de cámara TOKAI HIT y el accesorio de plato UNIV2-D35
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand	Promega	GA1120
LED	VitaStar	PAR64	80 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668	reactivo de transfección
NIH3T3 célula	ATCC	CRL-1658	adherente
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	319850	medio sérico reducido
penicilina/estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140
PMP34-TagBFP	Academia Sinica		PMP34 PCR amplificada a partir de ADNc HeLa y clonada intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1	Academia Sinica		generado mediante la adición de eroGFP (tomado del plásmido Addgene 20131) con la secuencia de aminoácidos VKSKL, y clonado en la célula EGFP-C1
SHSY5Y	adherente	ATCC	CRL-2266