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Los enfoques proteómicos pueden incluir la detección y cuantificación de los péptidos, proteínas y modificaciones postraduccionales específicas (PTM) presentes en un determinado estado celular, así como las proteínas que se unen en orgánulos específicos o complejos de proteínas macromoleculares. La proteómica es un campo diverso que se puede dividir en flujos de trabajo generales y cuantitativos. La proteómica cuantitativa se centra en determinar la cantidad de proteína o proteína PTM en una muestra. La pregunta biológica debe considerarse antes de realizar cualquier experimento de proteómica para determinar el método de preparación, secuenciación y análisis de datos de muestras más apropiado necesario para responder a la pregunta. Las proteínas son altamente dinámicas y los espectrómetros de masas son sensibles a la secuenciación de proteínas más abundantes sobre PTM de menor abundancia; Por lo tanto, la elección de los flujos de trabajo de preparación y secuenciación de muestras es fundamental. Esta colección de métodos describe enfoques para cuantificar ciertos tipos de proteínas utilizando métodos de MS de vanguardia y proporciona un flujo de trabajo de análisis de datos para redes de proteínas.
La peptidomómica es el estudio de péptidos generados naturalmente durante los procesos celulares normales, así como en condiciones de enfermedad, y este enfoque se limitó históricamente a la cuantificación basada en anticuerpos hasta que la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas y los procesos de extracción de péptidos avanzaron a su estado actual1. Estos avances, junto con la aplicación de la inactivación por calor de las proteasas endógenas, ahora permiten la identificación y cuantificación de cientos de péptidos intracelulares. En Correa et al.2, los autores describen un flujo de trabajo de preparación de muestras, que incluye inactivación por calor, extracción de péptidos en condiciones suaves para preservar los enlaces peptídicos y cuantificación relativa mediante el etiquetado de isótopos estables de aminas. Los autores han desarrollado un enfoque económico que podría permitir la identificación y cuantificación de péptidos nativos y biológicamente activos a partir de cultivos celulares y muestras de tejidos. Este enfoque podría usarse para descubrir biomarcadores peptídicos específicos de la enfermedad, péptidos antimicrobianos o objetivos para el desarrollo terapéutico futuro.
Los avances en los enfoques de espectrometría de masas y bioinformática permiten ahora la caracterización detallada de proteomas a partir de diversas fuentes de material biológico3. Descifrar la importancia biológica de los patrones de expresión proteómica en estas muestras complejas sigue siendo un desafío importante en el campo. Para abordar este desafío, Vanderwall et al. presentan JUMPn, un programa de biología de sistemas y su flujo de trabajo asociado que organiza los datos proteómicos en módulos (es decir, complejos de proteínas) que conectan grupos de coexpresión de proteínas con nodos de red relacionados con la interacción proteína-proteína (PPI)4. Los autores evalúan la efectividad de esta herramienta utilizando conjuntos de datos proteómicos existentes, así como datos simulados, y muestran su utilidad para facilitar la interpretación biológica de conjuntos de datos de proteomas complejos. Sus resultados muestran que este enfoque se puede utilizar para medir el factor de transcripción y la activación de la cascada de quinasas, lo que demuestra su utilidad para identificar los impulsores de enfermedades humanas y para otros estudios que intentan determinar los mecanismos biológicos a partir de datos profundos del proteoma.
Los pirofosfatos de inositol (PP-InsPs) se encuentran en todas las células eucariotas donde funcionan como moléculas de señalización metabólica y regulan diversos procesos5. Históricamente, debido a las propiedades físicas y la baja abundancia de PP-InsP, el análisis se ha limitado al uso de trazadores radiactivos, que son costosos y requieren un cuidado y almacenamiento especiales. Como alternativa, Qiu et al. han desarrollado un protocolo que permite la cuantificación absoluta y de alto rendimiento de pirofosfatos de inositol a partir de cultivos celulares o material de origen tisular mediante espectrometría de masas de ionización por electrospray acoplada a electroforesis capilar (CE-ESI-MS)6. En su informe, muestran cómo se puede utilizar este enfoque para perfilar todos los PP-InsP presentes en un espécimen, resolviendo especies e identificando regioisómeros para identificar cambios espaciales y temporales en diversas condiciones y estados de enfermedad.
Una gran proporción de los procesos celulares se controlan a través de la fosforilación de proteínas y los errores en estas vías de señalización se asocian con muchos estados de enfermedad diferentes7. Sin embargo, todavía existen lagunas significativas en la comprensión de los mecanismos completos que regulan las proteínas fosfatasas y quinasas en diferentes tipos de células y en diversas condiciones. Para abordar estas brechas en la comprensión, Smolen et al. introducen un nuevo flujo de trabajo que utiliza perlas inhibidoras de fosfatasa junto con espectrometría de masas (PIB-MS)8. Utilizando un inhibidor no selectivo de la fosfoproteína fosfatasa, microcistina-LR, acoplado a las perlas de sefarosa, los autores pueden enriquecer estas proteínas diana. Además, al usar condiciones de lavado suaves para eliminar las contenciones no específicas, también pudieron capturar interactivos de proteínas. Muestran cómo se puede utilizar este enfoque para identificar y cuantificar fosfoproteínas fosfatasas, su estado de fosforilación y las posibles interacciones proteína-proteína tanto en cultivos celulares como en tejidos.
Los avances en los métodos de preparación de muestras, como las estrategias para cuantificar péptidos endógenos, el enriquecimiento de fosfatasas y quinasas, las interacciones de proteínas y los pirofosfatos de inositol, están ampliando la base de conocimientos para la dinámica de proteínas en procesos biológicos. El avance de los espectrómetros de masas, como la adquisición independiente de datos, en contraste con la adquisición dependiente de datos, permite una mayor profundidad de capacidad de secuenciación para identificar péptidos de tal manera que los péptidos más abundantes no enmascaren péptidos menos abundantes durante la recopilación de datos, lo que permite identificar otras clases de proteínas. Los espectrómetros de masas timsTOF ayudarán a impulsar el futuro al incorporar la movilidad iónica además de la cromatografía líquida como una separación adicional de péptidos para permitir una secuenciación aún más profunda y una mayor posibilidad de detectar péptidos a partir de las estrategias de preparación de muestras descritas en esta colección. El campo de la proteómica continuará avanzando en función de nuevas metodologías de preparación de muestras, avances en espectrómetros de masas para la adquisición de datos y herramientas de análisis bioinformático, como JUMPn, para comprender las complejidades y funciones biológicas.