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Sistemas de Expresión Libre de Células: Métodos de Producción y Uso

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28 de julio de 2023

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1US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3Office of Naval Research – Global

En este artículo

Resumen

ARTÍCULOS DISCUTIDOS:

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. Sistema sin células OnePot PURE. Revista de Experimentos Visualizados. (172), doi:10.3791/62625 (2021).

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. De las células a la síntesis de proteínas sin células en 24 horas mediante el flujo de trabajo de autoinducción sin células. Revista de Experimentos Visualizados. (173), doi:10.3791/62866 (2021).

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Producción rápida, asequible y sin complicaciones de lisado libre de células bacterianas. Revista de Experimentos Visualizados. (176), doi:10.3791/62753 (2021).

Dopp, J. L., Reuel, N. F. Métodos enzimáticos rápidos para la amplificación de plantillas mínimas y lineales para la creación de prototipos de proteínas utilizando sistemas libres de células. Revista de Experimentos Visualizados. (172), doi:10.3791/62728 (2021).

McManus, J. B. et al. Caracterización rápida de partes genéticas con sistemas libres de células. Revista de Experimentos Visualizados. (174), doi:10.3791/62816 (2021).

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. Un kit de herramientas de transcripción y traducción de estreptomyces de alto rendimiento para aplicaciones de biología sintética y productos naturales. Revista de Experimentos Visualizados. (175), doi:10.3791/63012 (2021).

Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Cromatografía líquida acoplada a detección de índice de refracción o espectrometría de masas para el perfil de metabolitos en sistemas libres de células basados en lisado. Revista de Experimentos Visualizados. (175), doi:10.3791/62852 (2021).

Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparación de microcápsulas multifuncionales a base de seda cargadas con plásmidos de ADN que codifican aptámeros de ARN y ribointerruptores. Revista de Experimentos Visualizados. (176), doi:10.3791/62854 (2021).

Jaenes, K. et al. Diseño para el estudio de implementación para el desarrollo y la validación del paciente de diagnósticos de interruptores de agarre basados en papel. Revista de Experimentos Visualizados. (184), doi:10.3791/63223 (2022).

Editorial

Los sistemas de expresión libre de células (CFE) son un conjunto de herramientas que reconstituyen los procesos celulares clave de transcripción, traducción y metabolismo fuera de los confines de la célula1. Tales métodos han crecido rápidamente en popularidad al ofrecer una experimentación simplificada a través de la eliminación de membranas celulares y una complejidad reducida a través de la eliminación del ADN genómico y la complejidad correspondiente de las interacciones entre una construcción genética y el huésped. Los sistemas CFE ahora se utilizan para investigación fundamental, detección, biofabricación y educación. Esta colección de métodos presenta nueve ejemplos de nuevas formas de producir y utilizar sistemas libres de células.

Tres de los métodos se centran en hacer más accesible la producción de sistemas libres de células. Grasemann et al. describen una forma más fácil de hacer el sistema PURE, un sistema CFE que reconstituye todos los componentes necesarios para la transcripción y traducción, en lugar de utilizar lisados celulares2. En lugar de expresar y purificar cada uno de los 36 componentes proteicos, los autores agrupan las cepas de expresión, ofreciendo la producción de un sistema PURE funcional en una semana. Smith et al. ofrecen un proceso simplificado para la producción de sistemas CFE basados en lisado utilizando un enfoque de cultivo optimizado que reduce el flujo de trabajo total a 24 h, que se puede lograr dentro de las horas normales de trabajo3. Cooper et al. describen un método que utiliza una cepa modificada de E. coli que permite la lisis celular por congelación-descongelación, eliminando la necesidad del equipo especializado requerido por otros métodos4. Todos estos métodos contribuyen a una tendencia de esfuerzos para hacer que la producción de sistemas libres de células sea alcanzable por laboratorios con menos infraestructura y experiencia en los complicados protocolos tradicionales. Con la disponibilidad de kits comerciales de la competencia, cada vez más laboratorios pueden explorar las ventajas de los sistemas CFE con poco riesgo. Con métodos como los que se presentan aquí, estos laboratorios pueden optar por fabricar sus propios sistemas CFE que se adapten a sus necesidades sin una gran inversión en equipos o tiempo.

Dos métodos se centran en las ventajas de la experimentación rápida y de alto rendimiento posible con los sistemas CFE. Dopp et al. presentan un método para amplificar plantillas de ADN lineales para el cribado rápido de construcciones genéticas5. Usando su enfoque, los diseños genéticos se pueden solicitar a las empresas de síntesis de ADN y luego amplificarse y examinarse en 24 horas. McManus et al. describen un enfoque similar mediante el cual un gen reportero se amplifica con diferentes cebadores que codifican diferentes componentes reguladores6. El bajo costo de los oligos combinados con los sistemas CFE permite una detección rápida y rentable de componentes como los promotores. Ambos métodos resaltan el potencial de los sistemas CFE para la experimentación rápida, reduciendo los plazos para diseñar y probar una construcción de semanas utilizando la clonación tradicional a días o incluso horas.

Los siguientes tres métodos proporcionan herramientas para usos especializados de los sistemas CFE. Toh et al. ofrecen un método para crear sistemas CFE a partir de Streptomyces venezuelae7. La mayoría de los protocolos de CFE se basan en E. coli, incluidos todos los demás métodos de esta colección. Este nuevo método para S. venezuelae trae las ventajas de los sistemas CFE a un organismo de amplio interés para la producción de productos naturales. Dinglasan et al. proporcionan una forma de medir las concentraciones de metabolitos en reacciones libres de células8. Tales mediciones son críticas para aplicaciones en ingeniería metabólica libre de células, donde el metabolismo intacto de los sistemas CFE se utiliza para producir productos no proteicos de interés. En tercer lugar, Drachuk et al. presentan microencapsulación de ADN para su adición a reacciones CFE9. Este enfoque es representativo de un conjunto de técnicas que permiten reintroducir racionalmente las ventajas de la compartimentación en los sistemas CFE después de la eliminación de membranas naturales durante la fabricación de los sistemas CFE. Cada uno de estos métodos diversifica la gama de aplicaciones a las que se pueden aplicar los sistemas CFE.

Finalmente, Jaenes et al. describen métodos para producir un diagnóstico del virus del Zika en el mundo real basado en sistemas CFE10. Las pruebas y la instrumentación son de bajo costo en comparación con las tecnologías de la competencia, como la PCR, y los autores han probado con éxito sus diagnósticos utilizando muestras de pacientes en varios países. Este trabajo es un fuerte ejemplo de aplicaciones de detección en el punto de necesidad, que es quizás el área donde los sistemas CFE están preparados para tener el impacto más inmediato en el mundo real.

Como colección, estos métodos capturan una franja representativa de las principales áreas de investigación activa en los sistemas CFE en los últimos años. Los métodos que mejoran la producción de sistemas CFE y permiten la experimentación de alto rendimiento están bien representados, y están presentes ejemplos de los numerosos usos más específicos de los sistemas CFE. Otras áreas de interés incluyen la producción de proteínas complejas para aplicaciones médicas, la incorporación de aminoácidos no canónicos, la optimización para el almacenamiento a largo plazo y el desarrollo de células artificiales. Anticipamos que la adopción de sistemas CFE continuará acelerándose dada la reducción de la barrera de entrada, el potencial para la experimentación rápida y una gama más amplia de capacidades, todo ello gracias a métodos como los presentados en esta colección. Los desafíos restantes dependen del espacio de la aplicación. Para la biofabricación, la reducción de costos a escala mediante el cambio a sustratos más baratos y un mejor reciclaje será fundamental. Para la detección, se necesita un trabajo significativo basado en el ejemplo de Jaenes et al. para demostrar un rendimiento robusto en varias aplicaciones de punto de necesidad. En términos generales, el campo debe continuar refinando las técnicas básicas mientras se amplía el repertorio de lo que se puede hacer con los sistemas CFE.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen al programa de Investigación Aplicada para el Avance de las Prioridades de CyT de la Oficina del Secretario de Defensa por apoyar la colaboración que llevó a esta colección.

Referencias

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE cell-free system. Journal of Visualized Experiments. (172), e62625(2021).
  3. Smith, P. E. J., Slouka, T., Oza, J. P. From cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow. Journal of Visualized Experiments. (173), e62866(2021).
  4. Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate. Journal of Visualized Experiments. (176), e62753(2021).
  5. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-Free Systems. Journal of Visualized Experiments. (172), e62728(2021).
  6. McManus, J. B., et al. Rapid characterization of genetic parts with cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (174), e62816(2021).
  7. Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications. Journal of Visualized Experiments. (175), e63012(2021).
  8. Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based Cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (175), e62852(2021).
  9. Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with DNA plasmids encoding RNA aptamers and riboswitches. Journal of Visualized Experiments. (176), e62854(2021).
  10. Jaenes, K., et al. Design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics. Journal of Visualized Experiments. (184), e63223(2022).

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Protein SynthesisCell free AutoinductionBacterial Cell free LysateGenetic Parts CharacterizationSynthetic BiologyTranscription translation ToolkitMetabolite ProfilingSilk based MicrocapsulesRNA AptamersRiboswitchesDiagnostics

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