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La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa devastadora que afecta aproximadamente a 1 de cada 400 personas en su vida. La enfermedad se presenta inicialmente como deterioro de las neuronas motoras superiores e inferiores y finalmente progresa a parálisis y muerte como resultado de insuficiencia respiratoria dentro de los 2 a 5 años posteriores al inicio de los síntomas1. La ELA puede ser hereditaria, con más de 30 mutaciones genéticas diferentes, pero solo 4 variantes genéticas (C9orf72, FUS, SOD1, TARDBP) que representan aproximadamente el 55% de la ELA familiar. La mayoría de los casos de ELA, aproximadamente el 90%, representan ELA esporádica, cuyas principales causas aún no se comprenden completamente2. Existe una necesidad urgente de desentrañar los mecanismos de la ELA mediante el uso de las herramientas y los organismos modelo adecuados. En esta colección de métodos, proporcionamos una descripción general del progreso reciente de la investigación en términos de imitar esta enfermedad y, con suerte, finalmente encontrar opciones de tratamiento. Por ejemplo, la aplicación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) que se pueden diferenciar en neuronas motoras o astrocitos ofrece un sistema modelo humanizado 3,4,5. Además, en esta colección de métodos, se presentan modelos animales, como Drosophila para estudiar la captación de glucosa y la unión neuromuscular (NMJ) in vivo 6,7, ratones para estudiar neuronas corticales8 y C. elegans o pez cebra para investigar deficiencias motoras 9,10 y tejido de pacientes post-mortem11.
Las larvas de pez cebra son transparentes y sus neuronas motoras son directamente visibles, lo que las convierte en una herramienta perfecta para estudios in vivo no invasivos. Asakawa et al. muestran la transición de fase de TDP-43 expresada optogenéticamente en neuronas motoras espinales individuales9. Después de la irradiación, se puede observar y analizar la reubicación citoplasmática de TDP-43. La agregación de TDP-43 citoplasmático es un sello distintivo de la degeneración de las neuronas motoras en la ELA. Este método permite el estudio funcional y el análisis de proteínas asociadas a ALS de manera subcelular y temporal.
Empleando microscopía de iluminación estructurada (SIM) de superresolución, Coyne y Rothstein detallan un protocolo que aísla los núcleos y describen cómo investigar los complejos de nucleoporinas11. Los complejos de nucleoporinas consisten en múltiples copias de aproximadamente 30 proteínas de nucleoporinas diferentes (Nups). Se ha demostrado que el deterioro del transporte nucleocitoplasmático (NCT) y las alteraciones de Nup son características tempranas de muchas enfermedades neurodegenerativas, incluida la ELA. Al extraer los núcleos, es posible investigar las proteínas Nup individuales dentro de la NPC y el nucleoplasma en 3D. Curiosamente, esto se puede aplicar no solo a las células derivadas de iPSC, sino también al tejido post-mortem.
Currey y Liachko describen dos ensayos para discriminar entre deterioro motor leve, moderado y severo en modelos de C. elegans de ELA10. En el ensayo de locomoción radial, se mide el arrastre sobre una superficie, lo que lo convierte en un ensayo fácil y rentable. En su segundo método, el ensayo de natación, los movimientos de agitación se pueden medir utilizando un método de seguimiento basado en computadora. Los autores usan esto para estudiar TDP-43 y tau.
Hayes et al. también describen un método para estudiar NCT8. Aplican un método de permeabilización a los cultivos neuronales. Usando neuronas corticales primarias de ratón, describen un método que mantiene la integridad de la membrana nuclear mediante el uso de lisis hipotónica combinada con un cojín de albúmina de suero bovino. De este modo, la importación nuclear sigue funcionando de forma dependiente de la energía, proporcionando así una plataforma de microscopía y análisis de alto contenido. Esta plataforma tendrá una amplia aplicabilidad en el futuro para estudiar el transporte nuclear pasivo y activo en neuronas primarias.
La evaluación rápida de cómo la manipulación, las proteínas relacionadas con la enfermedad o el ARN afectan los procesos sinápticos y si los fármacos terapéuticos pueden restaurar estas funciones es esencial para la investigación de la ELA. Utilizando neuronas motoras derivadas de iPSC, así como neuronas primarias de ratones, Krishnamurthy et al. presentan un protocolo que permite el monitoreo en tiempo real de la dinámica de entrada de calcio presináptico y la fusión de la membrana de la vesícula sináptica3. Los autores demuestran que la transfección de C9orf72-(GA)50 perjudica la transmisión sináptica, lo que destaca la idoneidad de estos métodos para detectar diferencias basadas en mutaciones en la función sináptica.
La alteración de la captación de glucosa es una de las características patobiológicas de la ELA. En este modelo de Drosophila , Loganathan et al. describen un método basado en FRET para medir los cambios intracelulares en la captación de glucosa en células específicas6. Usando un sensor FRET de glucosa codificado genéticamente, validan su método con neuronas de expresión TDP-43, que muestran una mayor absorción de glucosa. En la línea mutante TDP-43G298S , el aumento de la absorción de glucosa solo es detectable tras la estimulación de la glucosa. Este método proporciona una herramienta importante para estudiar la glucólisis no solo en la ELA sino también en general en relación con la regeneración de las neuronas motoras.
Las técnicas de disección que preservan la arquitectura de la NMJ son de suma importancia para estudiar los cambios en las neuronas motoras a lo largo de la pierna de Drosophila a lo largo del tiempo. Stilwell y Agudelo utilizan una técnica que permite la caracterización de la NMJ para la identificación de árboles de neuronas motoras mediante inmunocitoquímica7. Curiosamente, las neuronas adultas están presentes durante toda la vida de una mosca, que es de aproximadamente 90 días. Al comparar una mutación SOD1H71Y con la de tipo salvaje, los autores demuestran diferentes marcadores para la hinchazón de bouton dependiente de la edad, los agregados de proteínas y las mitocondrias agrandadas.
La innovación de imitar una NMJ utilizando un sistema de cocultivo satisface la necesidad urgente de estudiar la disociación entre neuronas motoras y miotubos. En términos de este método, Stoklund Dittlau et al. describen cómo cultivar neuronas motoras derivadas de iPSC humanas y miotubos derivados de mesoangioblastos primarios humanos para formar NMJ funcionalmente activos4. Los autores muestran su funcionalidad mediante la activación de neuronas motoras con cloruro de potasio y afluencia de calcio en miotubos marcados con Fluo-4 a partir de entonces, que fue abolido por la administración de bloqueadores de NMJ.
Recientemente, los sistemas de co-cultura han ganado cada vez más atención. Estudiar no solo uno, sino varios tipos de células en un plato tiene el beneficio de imitar las condiciones fisiológicas mejor que los métodos que utilizan células monocultivadas. La patobiología relacionada con la ELA, como la toxicidad mediada por astrocitos y la hiperexcitabilidad neuronal, se puede estudiar utilizando este enfoque. En el video de Taga et al., se muestra la generación de neuronas corticales y astrocitos en un cocultivo combinado con una configuración de matriz de electrodos múltiples (MEA) para monitorear la electrofisiología5. La actividad funcional se puede monitorear a lo largo del tiempo, lo que permite flexibilidad en la composición celular, así como en diferentes condiciones de cultivo. Esto proporciona además una plataforma para probar el potencial terapéutico de los medicamentos y su influencia en la actividad funcional.
Actualmente, solo hay tres tratamientos aprobados por la FDA para la ELA, todos con un potencial de aplicación limitado. Para encontrar tratamientos más prometedores, la investigación futura debe comprender mejor la patobiología mediante el empleo de múltiples sistemas y enfoques modelo. Sin duda, los modelos humanos derivados de iPSC proporcionarán una plataforma interesante para investigar los mecanismos moleculares subyacentes. Esto, combinado con sistemas modelo como el pez cebra, C. elegans, Drosophila o roedores, conducirá a avances en el campo. Además, se espera que la investigación epidemiológica futura proporcione más información sobre cómo los factores ambientales juegan un papel en el desarrollo de la ELA12. Con la expansión de los conjuntos de datos y la bioinformática desarrollándose a gran velocidad, será más fácil desentrañar los denominadores comunes de las enfermedades neurodegenerativas en el futuro. Esto conducirá a nuevas vías de terapia o incluso prevención.