$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Incluso antes de que se otorgara el Premio Nobel de 2017 por la criomicroscopía electrónica (cryoEM) de moléculas biológicas, el campo estaba generando entusiasmo. La revolución de la resolución estaba en marcha y la biología estructural buscaba crioEM como un método de caracterización que se acercaba al estándar de oro de la cristalografía de rayos X1. Al principio, el campo de la crioEM abarcaba principalmente los datos generados por los microscopios electrónicos de transmisión criogénica (crioTEM). Ahora, a medida que los microscopios, los instrumentos de preparación de muestras y los métodos de preparación de muestras han avanzado, los tipos de datos generados se han vuelto más diversos. CryoEM ya no está reservado para la caracterización de proteínas por crioTEM. El campo ha crecido y ahora comprende datos generados a partir de microscopios electrónicos de criobarrido y haz de iones enfocado (cryoSEM / FIB). El impacto se siente más ampliamente en múltiples disciplinas, incluida la investigación de imágenes en moléculas, células, tejidos y materiales sintéticos como hidrogeles.
Los avances en las capacidades de imagen han sido una fuerza impulsora en el desarrollo de crioEM. Las mejoras en las cámaras, los detectores y el procesamiento de imágenes han allanado el camino para obtener imágenes con menos entrada de energía, lo que permite que las muestras biológicas delicadas sobrevivan al proceso de obtención de imágenes. En los TEM, la exposición al haz de baja dosis se ha traducido en la aplicación de tomografía en la que se obtienen imágenes de una sola muestra repetidamente en múltiples ángulos para generar una reconstrucción 3D 2,3. Los avances en SEM / FIB también han resultado en una resolución mejorada mientras se usa menos energía. Es importante destacar que esto ha llevado a la mejora de las imágenes de muestras no conductoras, lo que se traduce en mejores imágenes de volumen en SEM / FIB 4,5. Estas mejoras han avanzado en todas las imágenes de microscopía electrónica biológica, pero han mejorado especialmente las imágenes criogénicas, donde las muestras son delicadas y no se agregan metales pesados adicionales para mejorar el contraste.
A medida que las capacidades de obtención de imágenes han avanzado, también lo han hecho los instrumentos de preparación de muestras. En la preparación de muestras crioEM, el primer paso es la vitrificación exitosa de las muestras. Las muestras hidratadas se congelan para formar hielo amorfo, evitando así el daño causado por la formación de cristales de hielo. Las estrategias líderes son la congelación por inmersión en etano líquido para moléculas y celdas pequeñas o la congelación a alta presión (HPF) para muestras más grandes de hasta unos pocos cientos de micras de espesor. Los avances en la tecnología de congelación por inmersión permiten una mejor captura de moléculas en todas las orientaciones al reducir el autoensamblaje a lo largo de la interfaz aire/agua6. Además, los avances en la tecnología HPF permiten la estimulación lumínica y eléctrica de las muestras momentos antes de la congelación7. Más recientemente, se ha desarrollado una nueva tecnología HPF que puede interactuar con un microscopio de fluorescencia, lo que permite un breve retraso de tiempo (<2 s) entre la imagen de fluorescencia de células vivas y la congelación de HPF8.
Los avances anteriores han dinamizado el campo de la crioEM e inspirado el desarrollo de nuevos métodos. También ha habido una revitalización de las técnicas establecidas. Aquí, presentamos una colección de métodos centrados en el avance de la crioEM con el objetivo de difundir estas estrategias en el campo de investigación en rápida expansión.
Si bien las mejoras en las capacidades de imagen y los instrumentos de preparación de muestras han sido una fuerza impulsora importante detrás de los avances en el campo de la crioEM, un obstáculo importante en esta investigación sigue siendo la preparación práctica de muestras. Truong et al.9 presentan un método que aprovecha la formación de monocapas lipídicas en la interfaz aire/agua. Se forma una capa lipídica en la rejilla TEM y actúa como andamio para las proteínas de membrana de interés. Para muestras de membranas multilamelares o apiladas, Johnson et al.10 presentan una estrategia para "pelar" las capas sobrantes, dejando una sola capa en la cuadrícula que es apropiada para la obtención de imágenes TEM. En otro artículo, Chang et al.11 reconocen que algunas proteínas son dependientes de la temperatura y que la estructura relevante se observa a temperaturas elevadas. Describen un método modificado de congelación por inmersión que permite aplicar muestras a la rejilla a temperaturas elevadas y al mismo tiempo lograr hielo vítreo después de la congelación por inmersión. Para controlar aún más el proceso de preparación de la rejilla criogénica, Kang et al.12 presentan un método de alto rendimiento para producir chips microestampados para rejillas TEM en las que los poros tienen una profundidad controlable. Este método puede proporcionar otra variable para controlar el espesor del hielo amorfo durante la preparación de la cuadrícula.
La correlación de múltiples modalidades de imagen es impactante. Bieber et al.13 describen un flujo de trabajo criogénico en el que se obtiene una imagen de una rejilla congelada en un microscopio de criofluorescencia para localizar una región fluorescente de interés. Luego, la rejilla se transfiere a un cryoSEM / FIB, donde se utilizan fiduciales para alinear la imagen de fluorescencia con la imagen SEM, lo que permite que la región fluorescente sea el objetivo del fresado FIB. La región objetivo se adelgaza a unos pocos cientos de nanómetros, y luego la rejilla se transfiere a un crioTEM para tomografía en la ubicación objetivo adelgazada. DiCecco et al.14 demuestran una correlación entre TEM líquido y cryoTEM, acercándose así al objetivo de acoplar datos cryoTEM de alta resolución con los datos TEM de moléculas en movimiento dinámico.
La adquisición automatizada de grandes conjuntos de datos también es un área de interés. Es necesario maximizar el valioso tiempo de los instrumentos y la automatización es un paso clave. Kumar et al.15 describen la configuración clic a clic de un software automatizado de adquisición de datos para imágenes crioTEM.
A medida que el campo de la crioEM continúe desarrollándose, se verán más avances en la preparación de muestras, y el impacto de la crioEM se sentirá ampliamente en más disciplinas. Algunos avances no implicarán nuevas técnicas, sino el fortalecimiento de las técnicas existentes. Las técnicas serán más rápidas, fáciles y robustas, con un mayor rendimiento. A medida que la automatización aumenta la producción de datos, las áreas clave de desarrollo serán el análisis de imágenes y el procesamiento de datos. Además, la IA jugará un papel importante. Deberíamos esperar ver una reducción en los costos y la huella de instrumentación, lo que permitirá que esta tecnología sea más accesible, aunque estos desarrollos pueden tardar más en materializarse.