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El glucógeno, un polímero de glucosa ramificado, juega un papel importante en el metabolismo energético en procariotas y eucariotas. En condiciones de limitación de nutrientes, las bacterias y las levaduras utilizan glucógeno para la supervivencia celular1. En los mamíferos, el glucógeno tiene funciones específicas de los tejidos, incluido el uso local en los músculos para alimentar la contracción y en el hígado para regular los niveles de glucosa en sangre2. La síntesis de glucógeno es catalizada por la glucógeno sintasa, que une los residuos de glucosa a través de enlaces alfa 1,4, y la enzima ramificada, que forma enlaces alfa 1,6, creando así ramificaciones en la macromolécula de glucógeno. La utilización de este almacén de energía se ve facilitada por la glucógeno fosforilasa junto con la enzima desramificante, lo que resulta en la remodelación del glucógeno y la liberación de glucosa-1-P. La estructura del glucógeno, incluido el tamaño de las partículas y la ramificación, son de interés en parte porque la ramificación afecta la solubilidad del glucógeno, el tamaño de las partículas de glucógeno afecta su tasa de degradación y la inestabilidad estructural del glucógeno se ha implicado en la diabetes. Además, investigar la localización subcelular del glucógeno es importante en tejidos como los músculos para obtener información sobre el papel de este combustible durante el ejercicio.
La acumulación de glucógeno está controlada por las actividades relativas de las enzimas sintetizadoras de glucógeno y las que degradan la macromolécula. Wilson3 describe técnicas para medir la actividad enzimática de la glucógeno sintasa, la glucógeno fosforilasa, la enzima ramificada y la enzima desramificante. Estos métodos bioquímicos miden la producción o el consumo de NADH/NADPH o el cambio colorimétrico con un espectrofotómetro. Estos son enfoques escalables que eluden el alto costo, el equipo especializado y la carga regulatoria asociada con el método más sensible que utiliza radioisótopos. Los métodos descritos son los más adecuados para medir la actividad enzimática con enzimas purificadas, aunque con suficiente dilución homogeneizada y controles adecuados, se han utilizado con muestras de tejido. Wilson3 también describe un ensayo colorimétrico simple para medir la ramificación del glucógeno. Aunque este método proporciona menos información sobre la estructura fina del glucógeno que las técnicas de separación más laboriosas, proporciona una medida simple y rápida de los grados relativos de ramificación.
Fermont et al.4 describen el uso de la electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE), un método para determinar la distribución de la longitud de la cadena (CLD), que es un reflejo del tamaño de partícula de glucógeno y el porcentaje de ramificación. La estructura del glucógeno afecta la capacidad de las bacterias para sobrevivir a la inanición, y el glucógeno anormal se acumula en varias enfermedades de almacenamiento de glucógeno, lo que destaca la importancia de los métodos para estudiar el tamaño y la ramificación de esta fuente de combustible. FACE implica la aminación reductora de un grupo hemiacetal con ácido 8-amino 1,3,6 pireno trisulfónico (APTS). Además de proporcionar información sobre la CLD, FACE es útil para medir las propiedades catalíticas de las enzimas ramificadas de diversas fuentes. La principal técnica competidora, HPAEC-PAD, tiene la ventaja de no requerir extremos no reductores, pero esta técnica tiene un problema de sesgo de masa.
El grado de ramificación y el tamaño de las partículas de glucógeno son características importantes del polímero de glucosa. Se ha observado mediante microscopía electrónica que el glucógeno existe en tres estructuras: partículas beta esféricas (~20 nm), que incluyen varias partículas gamma (3 nm), y partículas alfa más grandes en forma de roseta (~300 nm) compuestas por partículas beta5. Los métodos tradicionales para aislar el glucógeno son suficientes para medir la concentración de glucógeno, pero comprometen la estructura fina del glucógeno, lo que significa que se requiere el desarrollo de una técnica más suave. Wang, Wang et al.6 describen una extracción con agua fría mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa para su uso en bacterias. Esta técnica es superior a otros métodos para preservar tanto moléculas de glucógeno más grandes, medidas por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), como cadenas más largas, medidas por electroforesis capilar asistida por fluoróforos (FACE)6. Wang, Liu et al.7 también aplican un método similar al hígado. La importancia de comprender la estructura del glucógeno se demuestra en un informe reciente que muestra que, en la diabetes, las partículas alfa de glucógeno hepático son "frágiles", lo que resulta en una degradación más rápida en comparación con las partículas alfa estables, lo que posiblemente afecte el control de la glucosa en sangre. Las limitaciones de estos métodos de aislamiento basados en gradiente de sacarosa incluyen la pérdida de glucógeno en el sobrenadante, que puede mitigarse con una menor concentración de sacarosa, y la degradación enzimática de una porción del glucógeno debido a las condiciones suaves utilizadas. Este último se mitiga con un breve paso de ebullición, aunque esto interrumpe las proteínas asociadas.
Finalmente, Jensen et al.8 describen el uso de microscopía electrónica de transmisión (TEM) para obtener imágenes de la distribución subcelular del glucógeno y el tamaño de partícula en fibras musculares esqueléticas individuales. Este método es el único disponible para investigar las reservas de glucógeno subsarcolema, intermiofibrilar e intramiofibrilar y se ha utilizado en tejidos musculares de una variedad de animales. Como algunos procesos subcelulares utilizan preferentemente glucógeno como combustible, es importante caracterizar la ubicación de estas reservas de combustible. Además, este método proporciona la capacidad de examinar el metabolismo del glucógeno en distintos tipos de fibras musculares, lo cual es importante en el ejercicio, donde la fatiga depende del glucógeno solo en fibras seleccionadas. Una limitación del método TEM es la incapacidad de detectar pequeñas partículas de glucógeno, y esto es una preocupación particularmente para las condiciones en las que se degrada el glucógeno, como durante la contracción muscular.
En conclusión, esta colección de métodos proporciona una muestra de las técnicas que se utilizan para sondear la estructura del glucógeno y las enzimas que regulan el anabolismo y el catabolismo de esta macromolécula. Estos métodos serán fundamentales para mejorar nuestra comprensión del metabolismo del glucógeno tanto en condiciones fisiológicas como patológicas.