Artículo de método

Conjunto de liposomas asistido por octanol en chip para bioingeniería

DOI:

10.3791/65032

⸱

17 de marzo de 2023

 ,  , 
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente protocolo describe el ensamblaje de liposomas asistido por octanol (OLA), una técnica microfluídica para generar liposomas biocompatibles. OLA produce liposomas monodispersos de tamaño micrométrico con encapsulación eficiente, lo que permite la experimentación inmediata en chip. Se prevé que este protocolo sea particularmente adecuado para la biología sintética y la investigación de células sintéticas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microfluídica es una herramienta ampliamente utilizada para generar gotitas y vesículas de diversos tipos de manera controlada y de alto rendimiento. Los liposomas son imitadores celulares simplistas compuestos de un interior acuoso rodeado por una bicapa lipídica; Son valiosos para diseñar células sintéticas y comprender los fundamentos de las células biológicas de manera in vitro y son importantes para las ciencias aplicadas, como la entrega de carga para aplicaciones terapéuticas. Este artículo describe un protocolo de trabajo detallado para una técnica microfluídica en chip, ensamblaje de liposomas asistido por octanol (OLA), para producir liposomas monodispersos, de tamaño micrométrico y biocompatibles. OLA funciona de manera similar al soplado de burbujas, donde una fase acuosa interna (IA) y una fase circundante de 1-octanol portadora de lípidos son pellizcadas por corrientes de fluido externo que contienen surfactante. Esto genera fácilmente gotas de doble emulsión con bolsas de octanol sobresalientes. A medida que la bicapa lipídica se ensambla en la interfaz de gotas, el bolsillo se separa espontáneamente para dar lugar a un liposoma unilamelar que está listo para una mayor manipulación y experimentación. OLA proporciona varias ventajas, como la generación constante de liposomas (>10 Hz), la encapsulación eficiente de biomateriales y las poblaciones de liposomas monodispersos, y requiere volúmenes de muestra muy pequeños (~ 50 μL), que pueden ser cruciales cuando se trabaja con productos biológicos preciosos. El estudio incluye detalles sobre microfabricación, litografía blanda y pasivación de superficies, que son necesarios para establecer la tecnología OLA en el laboratorio. Una aplicación de biología sintética de prueba de principio también se muestra al inducir la formación de condensados biomoleculares dentro de los liposomas a través del flujo de protones transmembrana. Se anticipa que este protocolo de video adjunto facilitará a los lectores establecer y solucionar problemas de OLA en sus laboratorios.

Introducción

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Todas las células tienen una membrana plasmática como su límite físico, y esta membrana es esencialmente un andamio en forma de una bicapa lipídica formada por el autoensamblaje de moléculas lipídicas anfifílicas. Los liposomas son las contrapartes sintéticas mínimas de las células biológicas; Tienen una luz acuosa rodeada de fosfolípidos, que forman una bicapa lipídica con los grupos de cabeza hidrófilos orientados hacia la fase acuosa y las colas hidrófobas enterradas hacia el interior. La estabilidad de los liposomas se rige por el efecto hidrófobo, así como por la hidrofilicidad entre los grupos polares, las fuerzas de van der Waals entre las colas de carbono hidrófobas y el enlace de hidrógeno entre las moléculas de agua y las cabezas hidrófilas 1,2. Dependiendo del número de bicapas lipídicas, los liposomas se pueden clasificar en dos categorías principales, a saber, vesículas unilamelares que comprenden una sola bicapa y vesículas multilamelares construidas a partir de múltiples bicapas. Las vesículas unilamelares se clasifican además en función de sus tamaños. Típicamente de forma esférica, se pueden producir en una variedad de tamaños, incluyendo pequeñas vesículas unilamelares (SUV, 30-100 nm de diámetro), vesículas unilamelares grandes (LUV, 100-1,000 nm de diámetro) y, finalmente, vesículas unilamelares gigantes (GUV, >1,000 nm de diámetro)3,4. Se han desarrollado varias técnicas para producir liposomas, y éstas se pueden clasificar ampliamente en técnicas a granel5 y técnicas microfluídicas6. Las técnicas a granel comúnmente practicadas incluyen rehidratación de película lipídica, electroformación, transferencia de emulsión invertida y extrusión 7,8,9,10. Estas técnicas son relativamente simples y efectivas, y estas son las principales razones de su uso generalizado en la comunidad de biología sintética. Sin embargo, al mismo tiempo, sufren de grandes inconvenientes con respecto a la polidispersidad en tamaño, la falta de control sobre la laminación y la baja eficiencia de encapsulación 7,11. Técnicas como la encapsulación continua de cruce de interfaz de gotas (cDICE)12 y el disparo de gotas y la filtración de tamaño (DSSF)13 superan estas limitaciones hasta cierto punto.

Los enfoques microfluídicos han ido cobrando prominencia en la última década. La tecnología microfluídica proporciona un entorno controlable para manipular flujos de fluidos dentro de microcanales definidos por el usuario debido al flujo laminar característico y la transferencia de masa dominada por difusión. Los dispositivos lab-on-a-chip resultantes ofrecen posibilidades únicas para el control espaciotemporal de moléculas, con volúmenes de muestra significativamente reducidos y capacidades de multiplexación14. Se han desarrollado numerosos métodos microfluídicos para hacer liposomas, incluyendo el chorro pulsado 15, la plantilla de doble emulsión 16, la eyección transitoria de membrana 17, la transferencia de emulsión de gotitas 18 y el enfoque hidrodinámico 19. Estas técnicas producen liposomas monodispersos, unilamelares y del tamaño de células con alta eficiencia de encapsulación y alto rendimiento.

Este artículo detalla el procedimiento para el ensamblaje de liposomas asistido por octanol (OLA), un método microfluídico en chip basado en el pellizco hidrodinámico y el posterior mecanismo de deshumectación con solvente20 (Figura 1). Se puede relacionar el funcionamiento de OLA con un proceso de soplado de burbujas. Una unión de seis vías enfoca la fase acuosa interna (IA), dos corrientes orgánicas portadoras de lípidos (LO) y dos corrientes acuosas externas (OA) que contienen surfactante en un solo punto. Esto da como resultado gotas de doble emulsión de agua en (lípidos + octanol) en agua. A medida que estas gotas fluyen aguas abajo, la minimización de la energía interfacial, el flujo de cizallamiento externo y la interacción con las paredes del canal conducen a la formación de una bicapa lipídica en la interfaz a medida que la bolsa de disolvente se desprende, formando así liposomas unilamelares. Dependiendo del tamaño de la bolsa de octanol, el proceso de deshumectación puede tomar de decenas de segundos a un par de minutos. Al final del canal de salida, las gotas de octanol menos densas flotan hacia la superficie, mientras que los liposomas más pesados (debido a una solución encapsulada más densa) se hunden en el fondo de la cámara de visualización lista para la experimentación. Como experimento representativo, se demuestra el proceso de separación de fase líquido-líquido (LLPS) dentro de los liposomas. Para eso, los componentes requeridos se encapsulan dentro de los liposomas a un pH ácido que evita LLPS. Al desencadenar externamente un cambio de pH y, por lo tanto, un flujo de protones transmembrana, se forman gotas de condensado separadas por fases dentro de los liposomas. Esto resalta las capacidades efectivas de encapsulación y manipulación del sistema OLA.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabricación de la oblea maestra

  1. Tome una oblea de silicio limpia de 4 pulgadas (10 cm) de diámetro (consulte la Tabla de materiales). Límpielo aún más con aire presurizado para eliminar cualquier partícula de polvo.
  2. Monte la oblea en una recubridora de centrifugado y dispense suavemente ~ 5 ml de una fotorresistencia negativa (consulte la Tabla de materiales) en el centro de la oblea. Trate de evitar las burbujas de aire, ya que podrían interferir con el proceso de impresión posterior de la oblea.
  3. Para obtener una capa fotorresistente de 10 μm de espesor, estire la oblea a 500 rpm durante 30 s con una aceleración de 100 rpm/s para la propagación inicial, seguida de un giro de 60 s a 3.000 rpm con una aceleración de 500 rpm/s. En caso de que se desee un grosor diferente, cambie los parámetros de hilado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. Hornear la oblea en una placa calefactora durante 2 min a 65 °C y luego durante 5 min a 95 °C.
  5. Una vez que la oblea se enfríe, monte la oblea en la cámara de impresión de la máquina de litografía óptica de escritura directa (consulte la Tabla de materiales) y alimente el diseño OLA (Figura 2A, Archivo de codificación suplementario 1) en el software.
    NOTA: El diseño OLA consiste esencialmente en dos canales OA, dos canales LO y un canal IA, que se fusionan para formar una unión de seis vías que continúa como un canal de postproducción y termina en el pozo experimental (EW).
  6. Imprima los diseños OLA en la oblea recubierta utilizando un láser UV (consulte la Tabla de materiales) con una dosis de 300 mJ/cm2.
  7. Una vez impreso el diseño, hornee la oblea a 65 °C durante 1 min, seguido de 95 °C durante 3 min.
  8. En este punto, asegúrese de que el contorno del dispositivo impreso aparezca en la oblea y sea visible a simple vista. Para lavar la fotorresistencia sin curar, sumerja la oblea en un vaso de precipitados de vidrio que contenga la solución reveladora (consulte la Tabla de materiales) hasta que la fotorresistencia sin curar se elimine por completo.
    NOTA: El exceso de tratamiento del revelador puede afectar a la resolución del diseño.
  9. Lave la oblea con acetona, isopropanol y agua desionizada (DI) en secuencia y, finalmente, con aire presurizado/N2 usando una pistola de soplado.
  10. Cocine la oblea a 150 °C durante 30 minutos para asegurarse de que el diseño impreso esté firmemente adherido a la superficie de la oblea y no se desprenda en el proceso de fabricación posterior. La oblea maestra está lista para su uso posterior (Figura 2B).

2. Preparación del dispositivo microfluídico

  1. Coloque la oblea maestra sobre una pieza cuadrada de aluminio y envuelva el papel de aluminio alrededor de la oblea, formando una estructura similar a un pozo (Figura 2C).
  2. Mida 40 g de polidimetilsiloxano (PDMS) y 4 g de agente de curado (10:1, relación en peso, consulte la Tabla de materiales) en un tubo de centrífuga de 50 ml, y mezcle vigorosamente con una espátula o una punta de pipeta durante 2-3 min.
  3. La mezcla vigorosa del PDMS y el agente de curado atrapa las burbujas de aire dentro de la mezcla. Gire el tubo a 100 x g durante 2-3 minutos para eliminar la mayoría de las burbujas de aire grandes.
  4. Verter aproximadamente 15-20 g de la mezcla preparada en el paso 2.3 sobre la oblea maestra y desgasificar con un desecador. Guarde el exceso de mezcla para hacer portaobjetos de vidrio recubiertos con PDMS (paso 3).
  5. Incubar el conjunto en un horno a 70 °C durante al menos 2 h.
  6. Saque la oblea maestra del horno y deje que se enfríe. Para quitar el bloque PDMS solidificado, retire el papel de aluminio y retire con cuidado el bloque PDMS del borde de la oblea.
    NOTA: La oblea es frágil y puede romperse, por lo que es importante realizar este proceso con cuidado.
  7. Una vez que se retira el bloque PDMS, mantenga la estructura estampada hacia arriba y, con una cuchilla afilada o un bisturí, corte bloques PDMS individuales, cada uno con un solo dispositivo microfluídico.
  8. Coloque el bloque PDMS sobre una superficie oscura y ajuste la dirección de la luz (una lámpara de mesa es útil para esto) para que los canales grabados sean brillantes y, como resultado, visibles. Haga agujeros en las entradas y el canal de salida utilizando punzones de biopsia de 0,5 mm y 3 mm de diámetro (consulte la Tabla de materiales), respectivamente.
    NOTA: Utilice un punzón de biopsia agudo para evitar grietas en el PDMS, que pueden causar fugas más adelante. Empuje suavemente el punzón de biopsia a través del bloque PDMS y asegúrese de que pase completamente a través de él. Para retirar el punzón de biopsia, retírelo suavemente mientras lo gira en direcciones alternas. El bloque PDMS con el diseño OLA grabado ahora está listo para unirse a un portaobjetos de vidrio recubierto de PDMS.

3. Hacer el portaobjetos de vidrio recubierto de PDMS

  1. Tome un cubreobjetos de vidrio transparente, vierta aproximadamente 0,5 ml de PDMS (preparado en exceso en el paso 2.4) en el centro del portaobjetos de vidrio y extiéndalo a través del cubreobjetos inclinando suavemente el portaobjetos de vidrio, asegurando una cobertura total del portaobjetos de vidrio con PDMS.
  2. Monte la corredera de vidrio en la corredera de centrifugado, asegúrese de colocarla en el centro (de modo que el centro de la corredera se superponga con el centro del eje de presión) y gire la corredera de vidrio a 500 rpm durante 15 s (en un incremento de 100 rpm / s) y luego a 1,000 rpm durante 30 s (en un incremento de 500 rpm / s).
  3. Coloque el portaobjetos de vidrio recubierto de PDMS (lado recubierto hacia arriba) en una plataforma elevada como un bloque de PDMS (1 cm x 1 cm) en una placa de Petri cubierta, y hornee a 70 °C durante 2 h.

4. Unión del dispositivo microfluídico

  1. Limpie el bloque PDMS (preparado en el paso 2) pegando y retirando la cinta adhesiva disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) dos veces. Asegúrese de mantener el lado limpio hacia arriba hasta su uso.
  2. Limpie la corredera de vidrio recubierta de PDMS con aire presurizado/N2 con una pistola de soplado y mantenga el lado limpio hacia arriba.
  3. Coloque el bloque PDMS (canales grabados hacia arriba) y la diapositiva de vidrio recubierta de PDMS (lado recubierto hacia arriba) en la cámara de vacío del limpiador de plasma (consulte la Tabla de materiales).
  4. Encienda el vacío y exponga el contenido al plasma de aire a una frecuencia de radio de 12 MHz (modo RF alto) durante 15 s para activar las superficies. El plasma de oxígeno se puede ver en forma de un tono rosado.
  5. Inmediatamente después del tratamiento con plasma, coloque el portaobjetos de vidrio recubierto de PDMS sobre una superficie limpia con el lado PDMS hacia arriba. Coloque suavemente el bloque PDMS con el patrón microfluídico ahora orientado hacia el portaobjetos de vidrio recubierto de PDMS, lo que les permite unirse (Figura 2D).
    NOTA: La eliminación del aire atrapado en el dispositivo es crucial para garantizar una unión completa.
  6. Hornear los dispositivos unidos a 70 °C durante 2 h.

5. Funcionalización superficial del dispositivo microfluídico

NOTA: Antes de la funcionalización de la superficie, es importante calibrar la bomba de presión según el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales) y ensamblar el tubo para conectarlo al dispositivo microfluídico.

  1. Conexión del dispositivo microfluídico a las bombas de presión
    1. Conecte el controlador de flujo accionado por presión a una fuente de presión externa (hasta 6 bares). Se requieren al menos cuatro canales de presión de aire independientes: tres módulos individuales de 0-2 bar y un módulo de -0,9-4 bar.
    2. Calibre la bomba de presión de acuerdo con el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
    3. Corte el tubo (1/16 en OD x 0.02 en ID) en cuatro piezas de igual tamaño de aproximadamente 20 cm de longitud.
    4. Inserte conectores doblados de acero inoxidable de 90° de 23 G (consulte la Tabla de materiales) en un extremo de cada pieza. Este extremo se inserta posteriormente en las tres entradas (OA, LO e IA) del dispositivo microfluídico y el cuarto se utiliza para eliminar el exceso de solución (paso 5.2.5).
    5. Inserte el otro extremo del tubo en el soporte del depósito microfluídico y séllelo con accesorios microfluídicos, asegurándose de que el tubo sea lo suficientemente largo como para tocar el fondo del depósito (tubos de 1,5 ml, consulte la Tabla de materiales). Esto evita que las burbujas de aire no deseadas entren en el dispositivo microfluídico durante el tratamiento con PVA / producción de liposomas.
  2. Tratamiento PVA del canal de salida
    NOTA: Antes de la generación de liposomas, es crucial hacer que el dispositivo sea parcialmente hidrófilo aguas abajo de la unión de producción. Esto se hace tratando estos canales con una solución de alcohol polivinílico (PVA) al 5% (p/v). La solución de PVA se prepara disolviendo el polvo de PVA (ver Tabla de materiales) en agua a 80 °C durante 3 h con agitación constante utilizando un agitador magnético. Filtre la solución antes de usarla para el tratamiento de superficies. Inmediatamente después de la unión del dispositivo, los canales microfluídicos son hidrófilos debido a la activación superficial inducida por plasma, y gradualmente se volverán hidrófobos nuevamente. Se recomienda esperar 2 h después de la cocción (paso 4.6) antes de comenzar el tratamiento con PVA.
    1. Dispense 200 μL de solución de PVA al 5% p/v en un tubo de 1,5 ml y conéctelo al soporte del depósito microfluídico. Inserte el tubo (el mencionado en el paso 5.1.3) de modo que un extremo se sumerja en la solución de PVA y el otro extremo esté conectado a la entrada del canal OA del dispositivo microfluídico.
      NOTA: Una concentración de PVA más baja puede conducir a una funcionalización superficial deficiente.
    2. Repita el paso anterior sin PVA (tubo vacío de 1,5 ml) y conéctelo a los canales LO e IA.
    3. Aumentar la presión de la fase OA a 100 mbar para que fluya la solución de PVA en los canales de OA. Aumentar las presiones de las fases IA y LO a 120 mbar para evitar el reflujo de la solución de PVA dentro de estos canales (Figura 2E).
      NOTA: Si es necesario, ajuste las presiones de los canales individuales para mantener el menisco estable en la unión de producción.
    4. Fluya la solución de PVA de esta manera durante aproximadamente 5 minutos, asegurando la funcionalización completa del canal de salida.
    5. Para eliminar la solución de PVA, separe el tubo de la entrada de OA y aumente inmediatamente la presión en los canales LO e IA a 2 bar. Simultáneamente, use un tubo conectado a un canal de presión negativa (−900 mbar) elimine el exceso de PVA primero del canal de salida y luego de la entrada OA (Figura 2F).
    6. Hornea el dispositivo a 120 °C durante 15 minutos y deja que se enfríe antes de usarlo. El dispositivo se puede almacenar en condiciones ambientales durante al menos 1 mes.
      NOTA: Se recomienda esperar 1 día (a temperatura ambiente) antes de proceder con OLA para asegurar que el PDMS no tratado recupere su hidrofobicidad después del tratamiento con plasma.

6. Ensamblaje de liposomas asistido por octanol (OLA)

  1. Preparación de las reservas lipídicas
    NOTA: Aquí, se utiliza como ejemplo una mezcla de lípidos 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (Liss Rhod PE) (ver Tabla de materiales); Los usuarios deben preparar la composición lipídica que necesitan de manera similar.
    1. Inyectar 76 μL de DOPC (25 mg/ml) y 16,6 μL de Liss Rhod PE (1 mg/ml) en un matraz de fondo redondo utilizando jeringas de vidrio separadas.
    2. Mantener el matraz de fondo redondo en posición vertical y utilizar una pistola de soplado deN2 comprimido para dar una suave corriente de nitrógeno para evaporar el cloroformo y formar una película lipídica seca en el fondo del matraz.
    3. Colocar el matraz en el desecador durante al menos 2 h al vacío continuo para eliminar el cloroformo restante.
    4. Añadir 100 μL de etanol en el matraz de fondo redondo, seguido de un ligero pipeteo o agitación para asegurarse de que los lípidos se disuelven para formar una reserva lipídica del 10% (p/v).
      NOTA: En caso de que una composición lipídica particular no sea completamente soluble en etanol, use una mezcla de etanol / cloroformo, manteniendo el volumen de cloroformo lo más pequeño posible.
    5. Pipetear la solución en un vial de vidrio oscuro. Enjuague suavemente el vial con nitrógeno con una pistola de soplado para reemplazar el aire con una atmósfera inerte. Selle la tapa con una película de parafina y guárdela a -20 °C.
      NOTA: La solución madre se puede utilizar durante un máximo de unos meses. Cada vez que se abra el vial, reemplace suavemente el aire con nitrógeno y vuelva a sellar con la tapa con una película de parafina.
  2. Preparación de las soluciones OLA
    1. Hacer soluciones de stock de los componentes indispensables: 20 mM dextrano (Mw 6,000); glicerol al 60% (v/v); un búfer de elección. En este caso, se preparó 5x solución salina tamponada con fosfato (0,68 M NaCl, 13,5 mM KCl, 50 mM Na 2 HPO 4, 9 mM KH2PO 4; pH 7,4) (ver Tabla de materiales).
      NOTA: Como el glicerol puro es altamente viscoso, se recomienda cortar un trozo pequeño al final de la punta de la pipeta de manera inclinada para un pipeteo efectivo.
    2. Prepare 100 μL de muestras de IA, OA y solución de salida (ES, la solución deseada para llenar el EW). Para facilitar la visualización, se agregó proteína fluorescente amarilla (YFP) a la solución IA en este caso particular. Verifique el equilibrio osmótico entre el AI y el OA calculando la osmolaridad de los componentes encapsulados y agregando una cantidad adecuada de azúcar o sal en el OA si es necesario. Esto se hace para evitar el estallido o la contracción de los liposomas durante la producción.
      NOTA: Las composiciones finales de las tres fases son las siguientes:
      IA: 15% glicerol, 5 mM de dextrano (Mw 6.000), 5,4 μM YFP, 1x PBS
      OA: 15% glicerol, 5% F68 surfactante, 1x PBS
      ES: 15% glicerol, 1x PBS
      Una menor concentración de surfactante F68 afecta negativamente la generación de emulsiones dobles.
    3. Preparar 80 μL de la fase LO pipeteando 4 μL de lípidos madre en 76 μL de 1-octanol (ver Tabla de materiales). La concentración final de DOPC es de 5 mg/ml.
    4. Centrifugar las muestras a 700 x g durante 60 s para eliminar cualquier agregado grande antes de continuar con los experimentos microfluídicos. Esto evita que cualquier factor de obstrucción obvio ingrese al chip microfluídico.
  3. Producción de liposomas
    1. Dispensar las soluciones (IA, LO, OA) en tres tubos de 1,5 ml, ensamblarlos (como se mencionó en el paso 5.1) y conectarlos al chip microfluídico tratado con PVA (paso 5.2.6).
    2. Aplique una presión positiva en los tres canales: ~100 mbar en los canales IA y LO y ~200 mbar en el canal OA.
      NOTA: Dado que la presión de OA es más alta que las demás, la solución de OA será la primera en llegar a EW; Esto es muy recomendable.
    3. Una vez que la solución OA alcanza EW, disminuya la presión de OA a 100 mbar y aumente el LO a 200 mbar.  La solución LO que llega a la unión de producción probablemente dará lugar a burbujas de aire debido al desplazamiento de aire de los canales LO. Una vez que las burbujas de aire se dispensan en el EW, ajuste la presión LO a 100 mbar. Por último, aumente la presión IA a 200 mbar y espere hasta que se elimine todo el aire en el canal IA. La secuencia ideal de llegada a la unión de las tres fases es, por lo tanto, OA, LO e IA.
    4. Después de eliminar el aire de los tres canales, ajuste todas las presiones del canal a 50 mbar y pipete 10 μL de ES en la cámara de salida. Después de pipetear el ES, coloque un portaobjetos en el orificio de salida para evitar la evaporación. En caso de que el LO sea empujado hacia atrás, aumente gradualmente la presión de LO en incrementos de 1 mbar hasta que comience a fluir hacia la unión.
    5. Una vez que las tres fases comiencen a cofluir en la unión, asegúrese de que comience la producción de doble emulsión y ajuste de acuerdo con su calidad (Figura 3A-C). Cambie las presiones gradualmente (pasos de 0.1-1 mbar) en lugar de abruptamente a menos que la presión se cambie para eliminar una obstrucción no deseada en el canal.
      NOTA: Los canales a ajustar dependen de lo que esté sucediendo en el cruce. Por ejemplo, el AI debe reducirse si las emulsiones son demasiado grandes; la OA debe aumentarse si se forman emulsiones dobles pero estallan en lugar de pellizcarse; y el LO debe reducirse si la bolsa de octanol es demasiado grande.
    6. Compruebe que las gotas de doble emulsión fluyan aguas abajo hacia EW. A medida que fluyen, las bolsas de octanol se vuelven cada vez más prominentes y finalmente se pellizcan, formando liposomas (Figura 3D-F). Asegúrese de que el canal de postproducción sea lo suficientemente largo y que la migración de las emulsiones dobles sea lo suficientemente lenta para la deshumectación.
      NOTA: En cuestión de minutos después de una producción decente, los liposomas y las gotas de octanol saldrán del canal de postproducción y entrarán en el EW. Como resultado, al ser menos densas que el agua, las gotas de octanol flotan hacia la superficie del ES. Debido a la adición de dextrano en la IA, los liposomas son más pesados que su entorno y van al fondo de la cámara listos para la observación y posterior manipulación.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio demuestra la formación de condensados sin membrana a través del proceso de separación de fase líquido-líquido (LLPS) dentro de los liposomas como un experimento representativo.

Preparación de muestras
El IA, OA, ES y la solución de alimentación (FS) se preparan de la siguiente manera:

IA: 12% glicerol, 5 mM dextrano, 150 mM KCl, 5 mg/mL poli-L-lisina (PLL), 0,05 mg/ml poli-L-lisina-FITC marcado (PLL-FITC), 8 mM trifosfato de adenosina (ATP), 15 mM citrato-HCl (pH 4)

OA: 12% v/v glicerol, 5% p/v F68, 150 mM KCl, 15 mM citrato-HCl (pH 4)

ES: 12% glicerol, 150 mM KCl, 15 mM citrato-HCl (pH 4)

FS: 12% glicerol, 150 mM KCl, 75 mM Tris-HCl (pH 9)

Formación de condensado dentro de los liposomas
Se seleccionó un ensayo simple de coacervación compleja sensible al pH de poli-L-lisina (PLL) cargada positivamente y trifosfato de adenosina (ATP) multivalente cargado negativamente para demostrar los fenómenos de LLPS en liposomas. Para evitar la separación de fases de polilisina y ATP durante la encapsulación, el pH de la solución se mantuvo en 4, en el que el ATP es neutro. El aumento del pH de las CE mediante la adición de FS (un tampón de pH 9) eventualmente aumentó el pH dentro de los liposomas debido al flujo de protones transmembrana, haciendo que el ATP se cargue negativamente y desencadenando su separación de fases con PLL21 cargado positivamente (Figura 4A). Después de aproximadamente 2 h de generación de liposomas, las presiones IA y LO se apagaron. La presión del canal OA se mantuvo a 100 mbar para que los liposomas restantes fluyeran lentamente hacia la cámara de observación. Una vez que todos los liposomas en el canal se recuperaron en el EW, las presiones se apagaron para detener el flujo y evitar que los liposomas se muevan. Los liposomas generados a un pH más bajo mostraron una fluorescencia homogénea (del PLL-FITC fluorescente encapsulado) en su lumen (Figura 4B, D). Las gotas de octanol que flotaban en la superficie se eliminaron pipeteando cuidadosamente 5 μL de solución desde la parte superior para evitar que afectaran a los pasos posteriores de pipeteo. Posteriormente, se agregaron 10 μL de tampón FS al EW, lo que indujo la separación de fases del PLL encapsulado y el ATP. La fluorescencia homogénea de FITC de cada liposoma se transformó gradualmente en distintas gotas de condensado fluorescente. Eventualmente, las gotitas individuales se fusionaron en una gota de condensado más grande que se difundió libremente dentro de los liposomas (Figura 4C, E-G).

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Figura 1: Esquema que muestra el montaje y funcionamiento de OLA. El controlador de presión está conectado a los depósitos que contienen soluciones acuosas externas, lipídicas en octanol y acuosas internas. Los tubos insertados en los depósitos están conectados a las entradas respectivas del dispositivo OLA. Los flujos apropiados en los tres canales conducen a la formación de emulsiones dobles de agua en (lípidos en octanol) en agua. Las emulsiones dobles formadas migran al pozo de salida, durante el cual las bolsas de octanol se desprenden para formar liposomas. Los liposomas formados se recogen en el fondo del pozo para su visualización y experimentación adicional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Preparación del chip OLA (fotolitografía, microfabricación, tratamiento de superficies). (A) Diseño digital que muestra las características clave del diseño OLA, incluidas tres entradas, una salida y una unión de producción de seis vías. (B) Un esquema de la oblea maestra que muestra múltiples diseños OLA producidos utilizando litografía UV. (C) Un elastómero PDMS fundido en la oblea maestra, colocado en un pozo creado con papel de aluminio, y curado por cocción a 70 °C durante 2 h. (D) Un dispositivo microfluídico unido mediante tratamiento con plasma de oxígeno, donde el bloque PDMS que contiene el diseño OLA se une a un portaobjetos de vidrio recubierto de PDMS. (E) Funcionalización de la superficie del chip fabricado para hacer que el dispositivo sea parcialmente hidrófilo. Esto se hace fluyendo 5% p/v PVA durante 5 min desde el canal acuoso exterior hacia el canal de salida. La presión de aire positiva en los otros canales evita que la solución de PVA entre en estos canales. (F) El PVA se elimina aplicando un vacío en el canal de salida. El dispositivo se hornea a 120 °C durante 15 minutos y luego está listo para usar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Demostración de OLA produciendo eficientemente emulsiones dobles monodispersas y, finalmente, liposomas con excelente encapsulación. (A) Una imagen de campo claro que muestra la generación rápida de gotas de doble emulsión. (B) El canal lipídico fluorescente muestra la formación de una bolsa de octanol debido a la deshumectación parcial. La fase lipídica en octanol contenía una mezcla de DOPC (5 mg / ml) y Lis Rhod PE en una proporción de 1,000: 1. (C) El canal acuoso interno que muestra encapsulación de proteína fluorescente amarilla (YFP). Los recuadros en (A-C) muestran vistas ampliadas representativas de los paneles respectivos (barras de escala = 10 μm). (D-F) Deshumedecer la bolsa de octanol en el canal de salida, que forma un liposoma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: separación de fase líquido-líquido activada por pH de pLL/ATP dentro de liposomas. (A) Esquema de la transición dependiente del pH de la solución homogénea de pLL y ATP encapsulada dentro del liposoma (izquierda) a coacervados de pLL/ATP separados por fase (derecha). El ambiente ácido inicial en el liposoma hace que la carga molecular del ATP sea neutra, inhibiendo la coacervación. Cuando el pH dentro de los liposomas se equilibra con el aumento del pH aplicado externamente, el ATP gana una carga negativa, desencadenando la coacervación. (B-C) Gráficos de líneas (correspondientes a las líneas punteadas en los paneles [D] y [G], respectivamente) que muestran la distribución espacial de pLL (canal verde) y la membrana (canal rojo). (D-G) Imágenes de lapso de tiempo que muestran la formación de coacervados pLL / ATP dentro de los liposomas. La adición externa de un tampón básico eleva el nivel de pH dentro de los liposomas en el transcurso de minutos e inicia la coacervación. t = 0 min se refiere al tiempo justo antes de la ocurrencia del primer evento de coacervación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo de codificación suplementario 1: archivo CAD del diseño OLA. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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La complejidad celular hace que sea extremadamente difícil entender las células vivas cuando se estudian como un todo. Reducir la redundancia y la interconectividad de las células mediante la reconstitución de los componentes clave in vitro es necesario para ampliar nuestra comprensión de los sistemas biológicos y crear imitadores celulares artificiales para aplicaciones biotecnológicas22,23,24. Los liposomas sirven como un excelente sistema mínimo para comprender los fenómenos celulares. Una lista no exhaustiva de estos fenómenos incluye la dinámica del citoesqueleto y las deformaciones de membrana resultantes 25,26, la regulación espaciotemporal de condensados biomoleculares 27,28 y su interacción con la membrana 29, la encapsulación de una amplia variedad de biomoléculas, incluidos los sistemas de transcripción-traducción libre de células 30, la síntesis de lípidos libres de células 31 y la evolución de las proteínas 32,33,34. Los liposomas también han sido ampliamente utilizados como portadores para la administración de fármacos y han sido aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) para uso clínico11. Los liposomas y las nanopartículas basadas en lípidos se utilizan como portadores para la administración de fármacos, incluidas las vacunas de ARNm como la reciente vacuna COVID-1935.

Este estudio describe un protocolo detallado sobre fotolitografía, ensamblaje microfluídico y funcionalización de superficies para realizar la técnica OLA con el fin de generar liposomas en chip (Figura 1 y Figura 3). Los liposomas producidos mediante OLA son monodispersos (coeficiente de variación: 4%-11% de la media) y en el rango de tamaño celular biológico (típicamente entre 5-50 μm de diámetro), y pueden ser sintonizados utilizando velocidades de flujo apropiadas de los canales acuosos interno y externo36. Por ejemplo, la población de liposomas que se ve en la Figura 1 tiene una distribución de tamaño de 23.3 μm ± 1.8 μm (n = 50). Con tasas de producción típicas de 10-30 Hz, los liposomas formados son unilaminares, como se confirmó previamente mediante la inserción de una sola proteína transmembrana específica de la bicapa, alfa-hemolisina36, en la membrana, así como mediante el uso del ensayo de blanqueo de ditionato37. OLA también es compatible con una amplia variedad de composiciones lipídicas, ofreciendo al usuario flexibilidad en la elección de lípidos. Es importante destacar que la composición lipídica utilizada inicialmente se refleja en la composición final del liposoma38.

Al ser una tecnología relativamente nueva, hay más margen para mejorar la OLA. Por ejemplo, la funcionalización de superficies utilizando PVA es crucial pero tediosa de realizar. Una forma más fácil y sencilla de funcionalizar la superficie del dispositivo reduciría significativamente el tiempo de fabricación del chip, así como la variabilidad de chip a chip. El tensioactivo Pluronic F68 es un componente importante en la fase acuosa externa para estabilizar inicialmente las emulsiones dobles; Sin embargo, su uso puede ser restrictivo en ciertos casos. La sustitución de Pluronic F68 por un surfactante más biocompatible o la eliminación completa del surfactante puede mejorar la versatilidad del sistema. Durante la migración de las emulsiones dobles generadas en el canal de salida, pueden estallar debido al cizallamiento. La actualización del diseño OLA para mejorar la estabilidad de la doble emulsión y la separación de la bolsa de octanol podría, por lo tanto, aumentar el rendimiento. No obstante, OLA tiene varias ventajas, que incluyen principalmente la encapsulación eficiente, liposomas monodispersos y unilamelares, y experimentación controlada en chip.

OLA ha sido empleado y adaptado en una amplia gama de estudios, incluyendo el crecimiento y la división de liposomas39, el estudio del proceso de separación de fase líquido-líquido27 y su interacción con la membrana21, y la comprensión de la formación de bioproductos de crecimiento bacteriano en liposomas40. Los ensayos de alto rendimiento basados en OLA también se están utilizando para comprender el transporte de iones a través de la membrana41 y la permeabilidad del fármaco a través de la bicapa lipídica37, como un sistema de administración de fármacos con fines terapéuticos 42, para estudiar el efecto de los antimicrobianos en la membrana 43, y como una herramienta para encapsular cristales líquidos 44. Además de la amplia gama de aplicaciones de la tecnología OLA, se están desarrollando versiones modificadas de OLA adecuadas para fines particulares 45,46,47,48,49,50. En general, teniendo en cuenta los pros y los contras, creemos firmemente que OLA es una plataforma versátil para la biología sintética.

Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Nos gustaría agradecer a Dolf Weijers, Vera Gorelova y Mark Roosjen por proporcionarnos amablemente YFP. S.D. reconoce el apoyo financiero del Consejo de Investigación Holandés (número de subvención: OCENW. KLEIN.465).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1-OctanolSigma-AldrichNº 297887
Tubos de 1,5 mLFisher scientific10451043Eppendorf 3810X Tubos de microcentrífuga de polipropileno
ATPSigma-AldrichNº A2383
Punzón de biopsiaDarwin microfluídicaPT-T983-050,5 mm y 3 mm de diámetro
de citratoSigma-AldrichNº 71405
DextranSigma-AldrichNº 31388Mr~6.000
Máquina de litografía óptica de escritura directaDurham Magneto Optics LtdMicroWriter ML3 Configuracióny software
Lípido DOPCAvanti SKU:850375C
F68Sigma-AldrichNº 24040032
Cubreobjetos de vidrioCorning#1, 24 x 40 mm
GlicerolSigma-AldrichNº G2025
Ácido clorhídricoThermo Scientific AcrosNº 124630010
Lípido Liss Rhod PEAvantiReferencia:810150C
ParafilmSigma-AldrichNº P7793
PhotoresistMicro resist technology GmbHEpoCore 10
Revelador fotorresistentemicro resist technology GmbHmr-Dev 600
Limpiador de plasmaHarrick plasmaPDC-32G
PolidimetilsiloxanoDowSylgard 184PDMS y agente de curado
Poly-L-lisinaSigma-AldrichNo. P7890
Poly-L-lisina– Etiquetado FITCSigma-AldrichNo. P3543
Alcohol polivinílicoSigma-AldrichNo. P8136peso molecular 30,000 – 70.000, 87%– Controlador de presión 90% hidrolizado
Elveflow OBK1 Mk3 +Controlador de flujo
Cinta adhesivaCinta mágica Cinta mate invisible Oblea
silicioMateriales de silicona0620R16002
Recubrimiento giratorio  Laurell Technologies CorporationModelo WS-650MZ-23NPP
Acero inoxidable 90° Acopladores PDMS dobladosDarwin microfluidicsPN-BEN-23G
Tris-baseSigma-AldrichNo. 252859
Tubería Tygonmicrofluidics1/16" OD x 0.02" ID
Láser UV Longitud de onda de 365 nm
Basepara bebés de Darwin

Referencias

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