Visualización de orgánulos in situ mediante tomografía crio-STEM

Resumen

La tomografía crio-STEM proporciona un medio para visualizar orgánulos de células intactas sin incrustación, seccionamiento u otras preparaciones invasivas. La resolución 3D obtenida se encuentra actualmente en el rango de unos pocos nanómetros, con un campo de visión de varios micrómetros y un espesor accesible del orden de 1 μm.

Resumen

La microscopía electrónica criogénica (crio-EM) se basa en la obtención de imágenes de muestras biológicas u orgánicas incrustadas en su medio acuoso nativo; El agua se solidifica en un vaso (es decir, vitrificado) sin cristalización. El método crio-EM es ampliamente utilizado para determinar la estructura de macromoléculas biológicas recientemente a una resolución casi atómica. El enfoque se ha extendido al estudio de orgánulos y células mediante tomografía, pero el modo convencional de imágenes EM de transmisión de campo amplio sufre una limitación severa en el grosor de la muestra. Esto ha llevado a la práctica de fresar laminillas delgadas utilizando un haz de iones enfocado; La alta resolución se obtiene mediante el promedio de subtomografía de las reconstrucciones, pero se pierden las relaciones tridimensionales fuera de la capa restante. La limitación de espesor se puede eludir mediante imágenes de sonda escaneada, similar al EM de escaneo o al microscopio de escaneo láser confocal. Mientras que la microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) en la ciencia de los materiales proporciona resolución atómica en imágenes individuales, la sensibilidad de las muestras biológicas criogénicas a la irradiación de electrones requiere consideraciones especiales. Este protocolo presenta una configuración para la criotomografía utilizando STEM. La configuración tópica básica del microscopio se describe para sistemas de dos y tres condensadores, mientras que la automatización es proporcionada por el software no comercial SerialEM. También se describen las mejoras para la adquisición de lotes y la alineación correlativa con mapas de fluorescencia adquiridos previamente. Como ejemplo, mostramos la reconstrucción de una mitocondria, señalando la membrana interna y externa y los gránulos de fosfato de calcio, así como los microtúbulos circundantes, filamentos de actina y ribosomas. La tomografía crio-STEM sobresale en revelar el teatro de orgánulos en el citoplasma y, en algunos casos, incluso la periferia nuclear de las células adherentes en cultivo.

Introducción

La visualización tridimensional (3D) de orgánulos es una tarea primordial en la biología celular moderna. Dadas las escalas involucradas, que van desde decenas de nanómetros para vesículas secretoras hasta muchas micras para el núcleo celular, es difícil encontrar una sola técnica de microscopía que se adapte a todas las aplicaciones. Si bien la microscopía de fluorescencia moderna puede abarcar gran parte del rango en términos de resolución, solo aparecen las moléculas marcadas. El teatro celular sigue siendo el reino de la microscopía electrónica. Los métodos convencionales de fijación química, incrustación de plástico y tinción con metales pesados son fuertemente invasivos, por lo que los resultados pueden depender de los detalles de la preparación de la muestra. Cryo-EM, por otro lado, está limitado por la necesidad de vitrificar el medio acuoso; Los cristales de hielo que se forman difractan la iluminación de electrones, causando artefactos de contraste de mayor contraste que el material orgánico de interés.

La última década ha visto una proliferación de técnicas de imagen EM desarrolladas o adaptadas para estudios celulares¹. La congelación a alta presión combinada con el fresado iterativo de haz de iones enfocado (FIB) y las imágenes seriadas de la superficie utilizando el microscopio electrónico de barrido (es decir, FIB-SEM) es actualmente el método de elección para muestras grandes². La tomografía criogénica de rayos X blandos (crio-SXT) es adecuada para muestras de varias micras de tamaño, limitadas por la longitud de absorción característica de los rayos X blandos en agua ^3,4,5. Esta escala incluye muchos tipos de células intactas, y la naturaleza cuantitativa del contraste de absorción de rayos X agrega un aspecto de la medición de concentración⁶ o espectroscopia⁷. Cuando se combina con el promedio de subtomograma, la tomografía electrónica de criotransmisión (crio-ET), basada en microscopía electrónica de transmisión de contraste de fase (TEM), ofrece la resolución más alta para macromoléculas o complejos ^8,9,10. Sin embargo, es raro que los orgánulos intactos sean tan regulares que puedan promediarse enteros. Además, el modo convencional de TEM de campo amplio está limitado para el grosor de la muestra a unos pocos cientos de nanómetros mediante la combinación de dispersión inelástica (que implica pérdida de energía) en la muestra y aberración cromática en la lente magnética del objetivo^11,12. La gran propagación de energía dicta el uso de un filtro de energía para eliminar la neblina desenfocada resultante, pero la muestra sensible aún sufre daños por radiación, mientras que la señal de imagen se vuelve exponencialmente más débil con el aumento del grosor.

El modo de imagen alternativo, EM de transmisión de barrido (STEM), evita la necesidad de filtrado de energía y retiene los electrones inelásticamente dispersos para la formación de imágenes, aunque actualmente a una resolución más baja que para la tomografía TEM (Figura 1). De hecho, no se forma ninguna imagen real. En cambio, como en un EM de escaneo, las mediciones se realizan punto por punto, y la imagen es ensamblada por la computadora. La ampliación está determinada solo por el tamaño de los pasos de escaneo sin cambiar las corrientes de la lente. Cuando se configura correctamente, el rango útil de espesor de la muestra para la tomografía crio-STEM (CSTET) puede alcanzar 1,5 o incluso 2 μm, aunque la zona de confort, donde la intensidad útil de la señal sigue siendo una fracción significativa de la iluminación, es de alrededor de 600-900 nm^11,13. Esto es suficiente para ver una gran fracción del citoplasma y, ocasionalmente, un borde del núcleo celular. En la práctica, encontramos que la vitrificación por el método estándar de inmersión en líquido criogénico impone una restricción más severa en el grosor que las imágenes STEM. El objetivo de este artículo de video es facilitar la incorporación de CSTET en el cofre de herramientas para imágenes de células y orgánulos en laboratorios de investigación e instalaciones de microscopía.

El primer desafío es que las operaciones de microscopio en CSTET aún no están estandarizadas para aplicaciones de ciencias de la vida de la misma manera que lo han sido para la tomografía crio-TEM. El hardware STEM rara vez (o nunca) se ha dirigido al mercado crio-EM. Sin embargo, esto está cambiando con la última generación de microscopios, y muchas herramientas existentes se pueden adaptar. STEM como técnica ha despegado y tomado el relevo en gran medida en las ciencias de los materiales, donde también hay un interés incipiente en los métodos criogénicos y de dosis bajas^14,15. La literatura de ciencia de materiales abunda en acrónimos BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, etc., que se suman a la confusión. Ofrecemos aquí un punto de partida recomendado que, en nuestra experiencia colectiva en el Instituto Weizmann de Ciencias, proporciona el protocolo más general para resultados útiles basados en imágenes STEM de campo claro (BF)¹⁶. De ninguna manera agota o incluso explora la gama de posibilidades, pero servirá como base para futuras mejoras. Si bien enfatizamos crio-STEM, la mayor parte del protocolo es igualmente relevante para la tomografía STEM a temperatura ambiente de secciones incrustadas en plástico.

La esencia de STEM es escanear la muestra con una sonda electrónica enfocada (Figura 1), el cono de iluminación, y registrar señales del plano de difracción (dispersión) en transmisión, píxel por píxel, para producir imágenes 2D^17,18. Los especímenes amorfos, incluyendo la mayoría de los materiales celulares, producirán un patrón de dispersión difusa en la transmisión. La configuración práctica más simple de STEM es colocar un detector circular para registrar el disco central (es decir, la iluminación de la sonda que se transmitiría sin una muestra). El espécimen dispersa electrones lejos de este cono de iluminación en la medida en que la señal disminuye. Esto produce una imagen BF: el espécimen aparece oscuro sobre un fondo brillante. También se puede usar un detector anular (o en su lugar) para detectar la dispersión de la muestra fuera del cono de iluminación. Con la muestra removida, no hay señal. Cuando una muestra está en su lugar, los objetos aparecen brillantes sobre un fondo oscuro en la imagen de campo oscuro (DF). La nomenclatura para STEM (BF, campo oscuro anular [ADF], campo oscuro anular de ángulo alto [HAADF], etc.) se refiere principalmente a los rangos de ángulos de recolección para los detectores.

El ángulo de convergencia de la iluminación representa una adaptación esencial de STEM a la tomografía celular. Cuando la máxima prioridad es la alta resolución, el ángulo de convergencia debe ser lo más grande posible. (Esto es similar a la microscopía de barrido láser confocal; la resolución está determinada por el diámetro de la sonda, que escala como la longitud de onda dividida por la apertura numérica. Tenga en cuenta que nos referimos al ángulo de semiángulo o semiconvergencia para EM). Cuando la prioridad es la profundidad de campo, por otro lado, un compromiso en la resolución ofrece una gran ventaja, ya que el haz enfocado permanece aproximadamente paralelo a una distancia igual al doble de la longitud de onda dividida por el semiángulo al cuadrado. Idealmente, todo el volumen celular permanece enfocado¹⁹. Por ejemplo, a 300 keV, la longitud de onda del deBroglie del electrón es de 0,002 nm, por lo que una convergencia de 1 mrad produce una resolución de 2 nm y una profundidad de campo de 4 micras. En estas condiciones, la tomografía se puede realizar incluso sin enfocar durante el proceso de recolección de datos, pero solo una vez al comienzo de la adquisición. Una STEM convencional con capacidad de tomografía puede alcanzar un ángulo de semiconvergencia de 7 u 8 mrad; Por lo tanto, en principio, podríamos alcanzar una resolución del orden de 0,25 nm, pero luego con una profundidad focal de solo 62 nm. Esto es claramente demasiado delgado para las imágenes celulares. Los microscopios más avanzados con tres lentes de condensador ofrecen un ajuste continuo del ángulo de semiconvergencia en un rango considerable. Con la configuración más tradicional de dos condensadores, la convergencia se fija discretamente por la apertura del condensador (C2).

Para muestras robustas incrustadas en plástico, se puede grabar una serie focal en cada inclinación y combinarlas para obtener una alta resolución²⁰, pero para muestras criogénicas, el presupuesto de radiación está demasiado limitado. Finalmente, al sopesar las ventajas de las imágenes BF o DF, para muestras gruesas, se deben considerar los efectos de la dispersión elástica múltiple en la muestra. La señal BF está menos corrompida por dispersión múltiple y muestra una resolución más alta para especímenes gruesos^16,21.

Una regla general útil ha sido establecer ángulos de colección varias veces mayores que la convergencia. Cuanto más grueso sea el espécimen, más grande debe ser el disco de recolección. Un disco demasiado pequeño proporcionará una intensidad de señal baja; Un disco demasiado grande dará como resultado un contraste de imagen deficiente, ya que solo la dispersión de ángulo más alto contribuirá. Los ángulos de recolección deben optimizarse para una muestra determinada. Los ángulos del detector en función de la longitud de la cámara (difracción) deben calibrarse de forma independiente. Pueden ser mostrados convenientemente por el software del microscopio. En la práctica, un factor de dos a cinco en la relación de semiángulos de recolección a iluminación, θ a α, respectivamente (Figura 1), es un punto de partida recomendado para CSTET de muestras celulares.

El siguiente protocolo describe la operación de tomografía STEM utilizando el popular software SerialEM para el control del microscopio^22,23. SerialEM no está vinculado a un fabricante específico, y es ampliamente utilizado en la tomografía TEM. La mayoría de las operaciones de configuración para la tomografía se pueden transferir directamente desde TEM. La estrategia de SerialEM es modelar el sistema de escaneo como una cámara. Esto permite el cruce simple de TEM a STEM. Sin embargo, hay que tener en cuenta que parámetros como la ampliación y la agrupación son completamente artificiales. Los parámetros importantes son el campo de visión en micras, el número de píxeles en el campo de visión y el tiempo de exposición. El espaciado de píxeles, o muestreo, es el campo lineal dividido por el número de píxeles, mientras que el tiempo de permanencia es el número de píxeles dividido por el tiempo de exposición.

La configuración mínima para STEM y CSTET implica tres características en el microscopio: un generador de escaneo, un detector STEM y un software de control de tomografía. El protocolo se refiere a la nomenclatura de FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), pero los conceptos son genéricos. El software propietario de TFS ha sido descrito en JoVE para TEM²⁴, y el funcionamiento STEM es muy similar.

Suponemos que el microscopio ha sido alineado de antemano por el equipo de servicio o el personal experimentado y que se puede llamar a una alineación de columna cargando un archivo. Los ajustes menores se denominan alineaciones directas y se pueden almacenar en los llamados registros FEG (microscopios TFS). Las alineaciones directas incluyen centro de rotación, puntos de pivote, alineación de difracción y compensación para el astigmatismo del condensador. Los ajustes deben realizarse de forma iterativa. Tenga en cuenta que los microscopios TFS implementan distintos modos de nanosonda (nP) y microsonda (μP); para una apertura de condensador dada, estos proporcionan un campo de visión relativamente estrecho o amplio con iluminación paralela en TEM y un haz de electrones más o menos convergente (estrechamente enfocado) en STEM, respectivamente. Otros fabricantes utilizan diferentes esquemas para cubrir el rango de ángulos de convergencia.

Antes de comenzar, se debe elegir el campo de visión, L, y el muestreo (ancho de píxeles), l, dependiendo de la muestra en estudio. Por ejemplo, para l = 1 nm/píxel, se debe elegir una imagen de 4.000 x 4.000 píxeles que cubra un campo de visión de 4^μm2 . La resolución será, en el mejor de los casos, el doble del muestreo espacial, por lo que 2 nm, y el diámetro de la sonda, d, deberían coincidir con eso. La calibración del ángulo de la sonda está más allá del alcance de este protocolo, por lo que asumimos que hay una tabla o una lectura de pantalla disponible. El diámetro de la sonda es aproximadamente la longitud de onda del electrón dividida por el ángulo de semiconvergencia (en radianes): d = λ/θ. La longitud de onda, λ, es 0.002 nm para 300 keV y 0.0025 nm para electrones de 200 keV, por lo que θ de 1 mrad proporcionará un diámetro de punto de 2 o 2.5 nm, respectivamente.

El protocolo se presenta en una progresión de complejidad creciente. La primera tarea es producir una imagen STEM, que depende del software del fabricante del microscopio, y luego una serie de inclinación, para lo cual usamos SerialEM. Muchos lectores sin duda estarán familiarizados con SerialEM, por lo que las tareas más complicadas vendrán naturalmente. No hay necesidad de seguir los procedimientos estrictamente. Los desarrollos relacionados con la automatización pueden implementarse directamente tanto para STEM como para TEM. Los usuarios experimentados probablemente invertirán el protocolo, comenzando con el registro correlativo de mapas de fluorescencia y continuando configurando la tomografía por lotes. Se pueden encontrar más detalles en la extensa documentación y bibliotecas de tutoriales para SerialEM, incluido un artículo reciente de JoVE sobre los últimos desarrollos en automatización²⁵.

Protocolo

1. Configuración de STEM

1. Alineaciones preliminares: cargue el archivo de alineación de columnas y, a continuación, abra Válvulas de columna. Si utiliza un crioprotector de entrada lateral, abra Cryo-shield. Comience en modo TEM. El haz debe aparecer en la pantalla. Si no es así, reduzca el aumento.
2. Lleve el microscopio al foco eucéntrico presionando el botón en el panel de control.
3. Ajuste el tamaño del punto a un valor conveniente (por ejemplo, 6) para visualizar la pantalla fluorescente, ya sea directamente o con la cámara incorporada (dependiendo del modelo de microscopio).
4. Ajuste el microscopio al modo STEM y verifique que el enfoque utiliza las lentes del condensador (intensidad) en lugar del objetivo. Establezca un enfoque eucéntrico. Luego, salga del modo de difracción para los ajustes iniciales.
5. Asegúrese de que la viga no esté en blanco. Reduzca el aumento hasta que aparezca el haz en la pantalla. Ajuste el desplazamiento del haz hacia el centro y aumente el aumento en pasos hasta aproximadamente 70kx mientras mantiene el haz en el centro.
6. Inserte la abertura deseada del condensador, normalmente 50 μm. Compruebe el centrado de apertura. Al girar la perilla de enfoque ligeramente hacia adelante y hacia atrás, el punto debe expandirse y contraerse, pero permanecer en su lugar, como si un avión cortara un reloj de arena vertical imaginario. Si la apertura no está centrada, la iluminación se desplazará lateralmente, como si el reloj de arena estuviera inclinado.
7. Enfoca el haz y pulsa Enfoque de la lista de intensidad (si está disponible) en la ficha Alineaciones, o vuelve al foco eucéntrico como en 1.2. Reajuste la posición del haz hacia el centro.
8. Ajuste el centro de rotación. Gire la rueda de enfoque al mínimo o un paso por encima, de modo que el haz pulse suavemente y asegúrese de que permanezca estacionario a medida que el enfoque se mueve hacia arriba y hacia abajo.
9. Seleccione los puntos de pivote y junte los dos puntos con los ajustes X e Y.
   NOTA: Si se instala una placa de fase en un instrumento TFS, solo se debe utilizar el ajuste X.
10. Desenfoque ligeramente el haz y ajuste los estigmas del condensador para que el disco sea redondo. Sube y baja a través del enfoque para optimizar; No debe haber tendencia a alargarse en una dirección u otra al pasar el enfoque.
11. Normaliza las lentes. Luego, aumente el aumento progresivamente a aproximadamente 240 kx mientras usa el desplazamiento del haz para mantener el punto centrado, y repita los ajustes del centro de rotación y el punto de pivote (pasos 1.6-1.8).
12. Volver al modo de difracción. El haz debe aparecer como un disco uniforme en la pantalla fluorescente. La longitud de la cámara (CL) ahora controla efectivamente la distancia óptica al detector, como en la cristalografía de rayos X. Cámbielo y observe cómo el disco se contrae y se agranda, como si la ubicación de la pantalla se moviera hacia o lejos de la muestra. Este cono representa la iluminación BF.
    NOTA: Para cada CL, hay una alineación de difracción que debe ajustarse para llevar el haz proyectado al eje central. Normalmente no hay necesidad de refinarlos todos, solo uno (o pocos) que se utilizarán para la detección.
13. Activa el modo STEM con un gran aumento.
    1. Si hay un detector BF STEM disponible, comience con eso. Lleve el escenario a un área con un orificio vacío y ajuste la alineación de difracción para centrar el haz utilizando el CL deseado.
    2. Muchos microscopios están equipados solo con un detector HAADF; hay un truco para usar esto como un detector BF. Primero, retraiga el detector, centre el haz como arriba en las alineaciones directas, inserte una apertura objetiva, típicamente una pequeña como 20 μm, y ajuste su posición para rodear el haz de manera uniforme. (La forma más fácil de hacerlo es insertando una muestra o una rejilla de prueba para ver un halo alrededor de la iluminación). Luego, use la alineación de difracción para mover el haz fuera del eje y hacia el área del detector. Inserte y retraiga el detector mientras observa el haz en la pantalla para confirmar que el haz está bloqueado por el detector.
    3. Inicie un escaneo en el software del microscopio y ajuste la configuración de brillo y contraste (B / C) para que la señal esté cerca de 0 cuando el haz está en blanco, y cerca de la saturación cuando la iluminación completa caiga sobre el detector. Utilice la pantalla del alcance para ayudar. La configuración puede acoplarse de maneras inesperadas, por lo que el ajuste debe iterarse varias veces.
14. Devuelva el microscopio a un aumento relativamente bajo en el registro de gran aumento (modo SA), sin pasar al modo de baja magnitud (LM).
15. Anote la corriente de la pantalla para referencia más adelante (consulte el paso 3.1.1). La corriente se puede cambiar con la lente de la pistola y los ajustes de tamaño de punto, como en TEM, con números crecientes correspondientes a una corriente reducida.
16. En este punto, guarde un registro FEG para facilitar el retorno a los valores estándar.
    NOTA: La instalación puede preparar un conjunto predeterminado de registros FEG para que los usuarios puedan comenzar desde una configuración de trabajo.

2. Colocación de la muestra

1. En el modo LM TEM, asegúrese de que la cuadrícula no sea opaca. Encuentre un cuadrado de cuadrícula para realizar los ajustes iniciales. Es conveniente encontrar algún área vacía, un agujero o un cuadrado de cuadrícula rasgado. Registre las posiciones del escenario para volver a ellas convenientemente.
2. Llevar la muestra a la altura eucéntrica. Hay varios métodos para hacer esto. Por ejemplo, utilice el tambaleante de escenario para inclinar la cuadrícula mientras mueve la altura de la muestra a lo largo del eje Z hasta que la imagen deje de desplazarse lateralmente. Alternativamente, marque algunas características en la pantalla de visualización e incline el escenario a 30 °. La función se moverá lateralmente. Ajuste la altura de la muestra para devolverla a la posición original. Aumente la ampliación o la inclinación del escenario para refinar. Volver a 0° de inclinación.
3. Vuelva al modo STEM e inserte el detector STEM. Vaya al modo de aumento alto (SA) más bajo. Asegúrese de que se observa una imagen en la pantalla de la computadora. Escanee rápidamente para evitar exposiciones innecesarias; 1 μs/píxel o menos sería típico. Tenga en cuenta que la imagen puede aparecer distorsionada en el borde izquierdo cuando el escaneo es excesivamente rápido (consulte la figura 2).
4. Pulse Enfoque eucéntrico, aumente la ampliación y refina el enfoque mientras escanea. Es conveniente utilizar la lupa de enfoque proporcionada por el software del microscopio.
5. Ajuste el astigmatismo del condensador. Esto se puede hacer con mayor precisión por el método de Ronchigram. Con el haz sobre un área de muestra delgada, concéntrese en el punto donde explota el haz transmitido, entre las imágenes de sombra de la muestra a cada lado. Luego, ajuste la sintonización del condensador para hacer que el disco central sea redondo. Esto requiere algo de práctica, especialmente para muestras criogénicas.
   NOTA: Una alternativa es encontrar algunas partículas de oro (a menudo utilizadas como marcadores fiduciales para la alineación en la tomografía). Aumente el aumento y enfoque hacia arriba y hacia abajo, ajustando el astigmatismo para que las partículas permanezcan redondas sin alargamiento en ninguna dirección.
6. Vaya al modo LM STEM y continúe escaneando para encontrar un área interesante. Reajuste la configuración B/C del detector si es necesario (paso 1.13.3), aproximadamente en este punto.

3. Grabación de una imagen

1. Estimar la dosis para el registro. Como regla general, apunte a 100-150 e^-/Ų para toda la tomografía. Compruebe la tolerancia a la dosis por muestra. La corriente en amperios (A) dividida por la carga por electrón representa un recuento de e^-/s, que se multiplica por el tiempo de exposición, T, en segundos y se divide por el campo de visión en Ų. Para mayor comodidad, exprese la corriente en nanoamperios (como se lee en la pantalla), el ancho del campo de visión en micrómetros y el tiempo de exposición del cuadro en segundos, con factores adecuados:
   
   Este número debe multiplicarse por el número de inclinaciones para obtener la exposición total en la serie. Por ejemplo, con una corriente I = 0.04 nA, un campo L = 4 μm y un tiempo de exposición de 12 s, obtenemos 1.9 e-/Å 2 por inclinación, o aproximadamente 110 e^-/Ų para una serie de 61 proyecciones.
2. Devuelva el escenario a un orificio (o retraiga la rejilla) y ajuste la corriente del haz utilizando el tamaño del punto y / o la configuración de la lente del cañón para alcanzar la corriente de pantalla deseada. Si la medición indica 0, inserte una apertura C2 más grande para aumentar la corriente. Luego, corrija dividiendo la medida por el cuadrado de la relación de diámetros, y finalmente regrese a la apertura más pequeña.
3. Refine la configuración de B/C de acuerdo con el paso 1.13.3 y, finalmente, devuelva el escenario a un área de interés y vuelva a verificar las alineaciones directas y el astigmatismo en las condiciones de imagen.
4. Adquiera una imagen de prueba.

4. Tomografía con SerialEM

1. Inicie el servidor SerialEM en el equipo con microscopio (SerialEM normalmente se instala en uno diferente). A continuación, abra SerialEM. STEM aparece en SerialEM como una cámara, con la misma interfaz. Asegúrese de que las comunicaciones se ejecutan correctamente para la configuración. Por ejemplo, la pestaña del microscopio debe mostrar el aumento correcto. Si esto no funciona, deténgase aquí y solucione el problema.
2. Busque la pestaña Cámara y guión y abra Configuración. Asegúrese de que la cámara STEM esté seleccionada y, para cada modo, elija los tiempos de agrupación y permanencia adecuados. Asegúrese de que el detector (o detectores) apropiado aparezca en el cuadro "canales para adquirir" en la parte inferior izquierda. Presione Adquirir en la parte inferior para probar. Nuevamente, no continúe si no sucede nada, o si la viga no se desenvacha. Deténgase y verifique las comunicaciones.
   NOTA: Los modos se utilizan de manera similar a la tomografía TEM. Binning es un artificio para la compatibilidad con TEM. El parámetro importante es el recuento de píxeles; Diferentes sistemas de microscopio utilizan diferentes agrupaciones para alcanzar el mismo conteo.
   1. La vista y la búsqueda deben ser escaneos rápidos con relativamente pocos píxeles (por ejemplo, 512 x 512 píxeles a 1 s).
   2. El enfoque es generalmente un área pequeña con grabación rápida. Por lo tanto, en el modo de dosis baja, elija Enfoque para tener un aumento diferente al modo de grabación, lo que puede ayudar a la precisión. Deje el tamaño del punto sin cambios.
   3. Para el modo de grabación, utilice los parámetros elegidos anteriormente en la estimación de la exposición. Si está disponible, seleccione también Enfoque dinámico, que corrige el enfoque línea por línea en una imagen inclinada.
   4. Para mayor comodidad, elija la agrupación para la vista previa para que sea idéntica a la de Vista (consulte la Mejora #1, paso 5.5). El tamaño de la imagen (número de píxeles) no tiene por qué ser el mismo.
   5. Utilice el modo de prueba para mantener el área Registro centrada durante la adquisición. Puede ser similar a View, pero tenga cuidado de que no haya distorsiones de escaneo aparentes en el lado izquierdo del marco (consulte la Figura 2 para ver un ejemplo). Una vez más, en el modo de dosis baja, la versión de prueba puede tener un aumento diferente que en el modo de grabación.
   6. Utilice el modo de montaje inmediatamente para el escaneo de cuadrícula. Debe ser lo suficientemente denso en píxeles para encontrar áreas de interés; Recomendación: 512 x 512 o 1024 x 1024. Asegúrese de que la imagen sea buena, con un rango dinámico decente (visto en los controles de visualización de imágenes), ya que este modo se utiliza para encontrar las áreas de la muestra.
   7. Guarde el archivo de configuración para que estas opciones se mantengan como predeterminadas para la próxima sesión (lo que puede ocurrir pronto en caso de que el programa se bloquee).
3. Pruebe las calibraciones de desplazamiento de imagen y cambio de etapa. En el modo microsonda (o nanosonda), haga clic en Ver imagen, desplácese sobre ella con el mouse, mantenga presionado el botón y arrastre diagonalmente aproximadamente una cuarta parte del campo de visión. Luego, tome otro punto de vista. Las imágenes deben superponerse perfectamente. Repita arrastrando de nuevo mientras mantiene presionada la tecla Mayús (para forzar un movimiento de escenario). Las imágenes deben superponerse bien, aunque quizás con menos precisión.
4. Vaya al modo LM y pruebe el cambio de etapa. Si estas pruebas fallan, deténgase y solucione el problema. El resto no funcionará.
5. Haz un mapa LM de montaje de toda la cuadrícula. Esto también se puede hacer en TEM.
   1. Vaya al modo STEM de menor aumento donde la imagen no está bloqueada por aperturas, generalmente alrededor de 185x.
   2. Haga clic en el menú Navegador > Abrir. A continuación, haga clic en el menú Navegador > Navegación. Opciones > anular la selección de Convertir mapas en bytes.
   3. Seleccione el menú Navegador > Montaje y cuadrículas > Configurar montaje completo. Se abrirá un menú. Las opciones a comprobar son: Mover etapa en lugar de cambiar imagen, Crear mapa de cada montaje si Navegador está abierto , y Usar asignación de montaje, no Grabar parámetros. La cuadrícula de la imagen debe ser aproximadamente 6 x 6 o 7 x 7. Busque el área total que se va a registrar. Si se requieren demasiadas imágenes, es posible que el aumento no se lea correctamente desde el microscopio (Figura 3). Deténgase y verifique.
   4. Para iniciar la adquisición de Montage, presione Start en Montage Controls o Montage en Camera & Script (Cámara y guión). Se abrirá otro menú para elegir los parámetros de archivo: mrc, almacenar como enteros y, en otro cuadro de diálogo, elija el nombre del archivo para el almacenamiento. Asegúrese de almacenar los datos en el área de datos adecuada y no en la configuración de usuario de SerialEM. Se recomienda no almacenar datos grandes en el disco C donde reside el sistema.
   5. Cuando finalice la adquisición, el montaje aparecerá en la ventana principal (Figura 4). Ahora se puede navegar por la cuadrícula utilizando el marcador y los puntos en el Navegador, al igual que en TEM.
6. Vuelva a comprobar la corrección del astigmatismo. Por lo general, es suficiente escanear un área pequeña rápidamente y ajustarla junto con el enfoque para que las características puntuales, como las nanopartículas de oro, permanezcan completamente redondas a medida que entran y salen de foco (como en un SEM) a gran aumento. De manera más conservadora, se pueden repetir las alineaciones directas de los pasos 1.5-1.8 antes de corregir el astigmatismo.
7. Alinee la imagen de gran aumento con el montaje LM.
   1. Vaya a una posición en el montaje LM con alguna característica fácilmente reconocible. Agregue un punto, haga clic en la ventana Navegador > Agregar puntos y haga clic en la función. Presione de nuevo (deje de agregar) para desactivar.
   2. Tome una imagen de vista o prueba con el aumento más bajo de alta magnitud (HM) y busque el elemento indicado. Coloque el marcador allí (cruz verde) y, con el punto correspondiente resaltado en la ventana Navegador, en el menú Navegador > Mayús a marcador..., en el cuadro de diálogo que se abre, elija Todos los mapas y Guardar Mayús, como se muestra en la Figura 5.
   3. Prueba moviendo el escenario a otras posiciones y verificando que la imagen HM está centrada en las mismas ubicaciones seleccionadas en el montaje LM. Si la función no es visible en la imagen HM, el cambio entre los modos LM y HM puede ser demasiado grande. En este caso, haga un montaje de polígono sobre un área más grande. Haga clic en la ventana Navegador > Agregar polígono, elija algunos puntos y, a continuación, haga clic en Agregar polígono nuevamente para cerrar. Haga clic en el menú Navegador > Montaje y cuadrículas > Configurar montaje de polígonos y Controles de montaje > Inicio. Luego, busque los puntos correspondientes como se indica arriba y haga clic en Shift to Marker....
8. Configure el modo de dosis baja.
   1. Abra la pestaña Control de dosis baja y marque la casilla Modo de dosis baja .
   2. Marque Actualización continua y vaya a Ver. Elija el aumento del microscopio para este modo, normalmente el más bajo o el próximo al más bajo. Elija cada uno de los siguientes modos y establezca el aumento adecuado. El registro debe configurarse para lograr el tamaño de píxel deseado, y la ampliación del enfoque debe ser lo suficientemente alta como para que los marcadores fiduciarios u otras características de alto contraste para enfocar se resuelvan claramente. Luego, desmarque inmediatamente Actualización continua.
      NOTA: El modo de prueba puede configurarse de manera similar a Record, en cuyo caso el área de seguimiento tendrá que desplazarse del área de registro para minimizar la exposición, o a un aumento bajo, que abarca gran parte del entorno.
   3. Tome una imagen de vista y establezca la posición de prueba utilizando Definir posición del área: Prueba.
      NOTA: Recomendación # 1: Dado el cambio en el área y el tiempo muestreados, la exposición adicional para un ensayo de baja magnitud puede ser mínima. Mientras la barra de cuadrícula no entre en el campo de visión, este método de seguimiento suele ser más confiable. Recomendación #2: También es posible actualizar el tamaño del punto para ajustar la dosis para diferentes modos, como Focus. Para la estabilidad en la configuración de la óptica del microscopio, recomendamos no hacer esto, sino dejar el tamaño del punto como es apropiado para Grabar y luego ajustar el tiempo de exposición si es necesario para los modos de escaneo más rápidos.
   4. Haga clic en la pestaña Control de dosis baja > Vaya a: Rec., luego haga clic en el menú Navegador > Abrir estados de imagen > Agregar estado actual. Asígnele un nombre para que pueda recuperarse fácilmente (por ejemplo, μP STEM para microsonda STEM). Se pueden definir varios estados para diferentes tareas.
9. Mueva el escenario a un lugar de interés para la tomografía (más sobre el uso del Navegador a continuación).
   1. Agregue un punto en el Navegador haciendo clic en la ventana Navegador > Agregar puntos.
   2. Refine la altura eucéntrica seleccionando Tareas > Eucentricidad > Áspero. Ventana Navegador > Actualización Z.
   3. Establezca las áreas de Enfoque y Prueba. Primero, tome una imagen de View. A continuación, en la ficha Control de dosis baja , en Definir posición del área, seleccione Enfoque o Ensayo. Ajuste las posiciones de las dos áreas a lo largo del eje de inclinación. El foco no debe superponerse al área Registro.
      NOTA: Tenga en cuenta que hay un poco de exceso, particularmente en el borde izquierdo, por lo que ninguno debe establecerse inmediatamente adyacente al área de grabación. El alcance del exceso de rebasamiento se puede evaluar en un área de prueba escaneando repetidamente en el aumento de registro y luego reduciendo el aumento para obtener una visión más amplia.
10. Para una buena medida (opcional con la experiencia), incline el escenario a +60 ° y luego a -60 °, cada vez que tome una imagen Vista o Vista previa para asegurarse de que la barra de cuadrícula no ingrese al campo de visión Área de grabación que se muestra en verde.
11. Configure la serie de inclinación.
    1. Abra un nuevo archivo para guardar los datos haciendo clic en Archivo > Abrir nuevo y elija un nombre de archivo. Seleccione el menú Serie de inclinación > Configuración de la serie de inclinación (Figura 6). Solución de problemas: si el botón Abrir nuevo está gris, compruebe que la serie de inclinación anterior haya finalizado. Si no es así, termine haciendo clic en Tilt Series > Terminar.
    2. Defina los ángulos de inclinación extremos en los cuadros Inclinación a y Fin en , normalmente -60° y +60°, respectivamente, así como el incremento, normalmente 2°.
    3. Para el modo simétrico de dosis (recomendado: asegúrese de que el modo de dosis baja sigue activo), marque Ejecutar serie en dos direcciones desde ___. El blanco es normalmente 0, pero puede usarse para compensar las laminillas FIB preinclinadas (por ejemplo, a 20°).
    4. Para simplificar, marque Mantener constante el tiempo de exposición. Cambiar esto requiere cierta reelaboración del cálculo de la exposición y también puede interferir con las reconstrucciones algebraicas (por ejemplo, ART/SART/SIRT), que comparan las intensidades proyectadas con los datos originales (véase el paso 7.1).
    5. Marque Omitir enfoque automático. Un ángulo de semiconvergencia pequeño, como 1 mrad, implica una profundidad de campo tan larga que puede ser innecesario enfocar. Como prueba, enfoca a 0°, inclina a 60° o -60° y presiona Grabar. Mantener el enfoque es principalmente una cuestión de altura eucéntrica precisa. Para una mayor convergencia, puede ser necesario enfocar durante la serie. En este caso, tome una vista y, en la pestaña Control de dosis baja , defina la posición del área y el enfoque, y ajuste el área de enfoque.
    6. Acciones iniciales y finales: Si el ajuste de altura eucéntrico se realizó con precisión, no hay necesidad de repetirlo. Desmarque Cerrar válvulas de columna al final de la serie a menos que haya una buena razón para no hacerlo.
    7. Para rastrear los parámetros de control, hay muchas opciones. Para la recopilación de datos desatendida, la máxima prioridad es evitar que el programa se detenga para la entrada del usuario. Utilice la configuración recomendada: repita Grabar si el porcentaje de campo perdido es superior a 5. A continuación, realice una pista después y marque Alinear con vista previa antes de obtener una nueva referencia de pista y Obtener nueva referencia de pista si la alineación del registro difiere en un 2%. Para la recolección de datos asistida, aplique parámetros más estrictos para evitar el riesgo de perder horas de tiempo del instrumento.
    8. Cuando esté listo para comenzar, presione GO en la parte inferior de la ventana. Al final, seleccione Serie de inclinación > Terminar.

5. Adquisición por lotes en múltiples puntos usando el Navegador (Mejora #1)

NOTA: El protocolo es rudimentario porque a) es idéntico a TEM y b) nuevas herramientas están disponibles que probablemente harán que una descripción completa sea obsoleta.

1. Cargue el montaje de cuadrícula completo en la ventana principal.
2. Elija una serie de áreas que parezcan prometedoras. Haga clic en Agregar puntos y agréguelos a los centros de los cuadrados de cuadrícula seleccionados. Haga clic en Agregar puntos nuevamente para desactivar el modo.
3. Con el estado de imagen de dosis baja activado, seleccione la ventana Navegador > marque Adquirir y Nuevo archivo en el elemento para cada uno de los cuadrados seleccionados. Para el primero, se abrirá un cuadro de diálogo para las propiedades del archivo (Figura 7) y luego el nombre del archivo. Elija Imágenes montadas y, a continuación, en el cuadro de diálogo Configuración de montaje (Figura 8), marque Usar parámetros de vista en el modo de dosis baja y cree una cuadrícula lo suficientemente grande como para cubrir el cuadrado (aproximadamente 100 x 100 μm).
4. Haga clic en el menú Navegador > Adquirir en elementos y seleccione los parámetros para la asignación. Lo más importante es que, en Acciones primarias, marque Crear mapa de navegador, luego Eucentricidad aproximada y Eucentricidad fina, y presione Ir (Figura 9). Para una cuadrícula de malla 200, esto dará como resultado un mapa de aproximadamente todo el cuadrado (Figura 10)
5. Prepárese para las selecciones de posición del tomograma. Abra un nuevo archivo haciendo clic en Archivo > Abrir nuevo. Asígnele un nombre de archivo (por ejemplo, AnchorMaps.mrc).
   1. Con el modo de dosis baja activo, ingrese a Configuración de cámara y guión > y asegúrese de que la vista y la vista previa estén en el mismo binning (de lo contrario, no se pueden guardar en el mismo archivo).
   2. Visite los puntos en los mapas cuadrados haciendo clic en la ventana Navegador > Vaya a XYZ.
   3. Elija una posición para la primera tomografía con el marcador. Tome una imagen de vista previa y refine la posición arrastrando con el botón derecho del mouse. A continuación, seleccione la ventana Navegador > Nuevo mapa y haga clic en sí en el cuadro de diálogo para guardar. A continuación, tome una imagen Ver de la misma área y guárdela nuevamente como un nuevo mapa. Asegúrese de que el Ver mapa esté resaltado y compruebe Estado de anclaje en la ventana Navegador en la parte superior derecha.
   4. Elija la segunda posición, vuelva a tomar una vista previa y refine la ubicación como se mencionó anteriormente, y esta vez presione Anchor Map en la ventana del navegador. Esto guardará tanto la Vista previa como la Vista como nuevos mapas en el Navegador.
   5. Repita el paso 5.5.4 para todas las ubicaciones deseadas. Desplácese de un cuadrado de cuadrícula a otro seleccionando el punto y presionando Ir a XYZ en la ventana Navegador.
6. Para el enfoque de referencia, elija un área clara de la cuadrícula y enfoque cuidadosamente, a mano o con enfoque automático. Pulse Restablecer desenfoque en el panel del microscopio. Cree un script en SerialEM haciendo clic en Script > Editar > Editar 15 (u otro número libre) e introduzca dos líneas: ScriptName SetDefocus y SetDefocus 0.
7. En la ventana Navegador, resalte la primera ubicación (Vista previa o Ver). Presione Mayús-T y luego resalte la última ubicación y nuevamente presione Mayús-T. Se abrirá el cuadro de diálogo Propiedades de archivo. Elija imágenes y parámetros de un solo fotograma para guardar, incluido el nombre de archivo. Edite el nombre del archivo, pero deje la etiqueta del elemento al final.
   NOTA: Los nombres de archivo que terminan en números se actualizarán automáticamente para las series de inclinación sucesivas. Es conveniente utilizar la opción Menú Navegador > Navegación. Opciones > Usar etiquetas de elementos en nombres de archivo.
8. A continuación, el menú Configuración de la serie Tilt se abrirá automáticamente. Rellenar como antes (Figura 6), pero no elija Refinar eucentricidad. Los puntos de vista previa en el navegador ahora se marcarán como TS. Uno puede volver a este menú usando el botón en la ventana Navegador encima de la lista de elementos.
9. Seleccione el menú Navegador > Adquirir en elementos. Esta vez, seleccione los parámetros para Datos finales. Seleccione Acción principal: adquiera series de inclinación y elija Administrar Dewars/Vacuum, Relinear con elemento, Eucentricidad fina y Ejecutar script antes de la acción, con Script para ejecutar: SetDefocus. Seleccione las opciones generales: no hay cuadro de mensaje cuando se produce un error y cierre las válvulas de columna al final, luego presione GO (Figura 11). SerialEM ahora visitará todos los mapas de anclaje y registrará una serie de inclinaciones en cada posición (Figura 12).

6. Registro de mapas CLEM (Mejora #2)

1. Si aún no se ha hecho, cargue el montaje de cuadrícula completo en la ventana principal y, a continuación, cree una nueva ventana haciendo clic en Ventana > Nueva ventana y asígnele un nombre. Tenga en cuenta que el montaje de cuadrícula completa aparece en el Registro 1.
2. Importe la imagen del mapa CLEM haciendo clic en el menú Navegador > Importar mapa. Debe ir al Registro 2. También se le puede asignar una nueva ventana como la anterior.
3. Inspeccione el mapa CLEM para determinar la rotación relativa con respecto al montaje completo de la cuadrícula. Es más fácil hacer esto en un mapa en el que aparecen las barras de cuadrícula. Tenga en cuenta que el mapa también se puede voltear. Alinéelo aproximadamente usando el menú Navegador > Rotar mapa, con Voltear si es necesario.
   NOTA: El siguiente paso también puede acomodar un giro, pero hacerlo por adelantado hace que lo siguiente sea mucho más fácil. Este paso puede repetirse hasta que la alineación parezca satisfactoria, pero no es necesario ser preciso.
4. Introduzca puntos de registro para una alineación precisa. Coloque una serie de puntos correspondientes en una ventana y luego en la otra. Para cada uno de estos puntos, marque Punto de registro en la parte superior de la ventana Navegador. Los puntos correspondientes se etiquetarán con un índice ascendente, seguido de R1 o R2 para el montaje de cuadrícula o el mapa importado, respectivamente.
   NOTA: El uso de cuadrículas de buscador hace que este paso sea muy simple. De lo contrario, elija características sólidas como el marcador central o las esquinas de los cuadrados de la cuadrícula. En principio, tres puntos son suficientes para una alineación cruda, pero más puntos ayudan a compensar los desajustes menores en las construcciones de montaje.
5. Si se desean varios canales de un mapa CLEM, por ejemplo, diferentes colores fluorescentes o fluorescencia sin un fondo de campo brillante, impórtelos como en el paso 6.2 anterior y cambie los registros a 2. De esta manera, heredarán los puntos de registro del primer mapa.
6. Imponer el registro por el menú Navegador > Transformar elementos. Los puntos de registro correspondientes aparecerán ahora en todos los mapas, que se enumerarán en el Registro 1. Para alinearse visualmente, haga clic en el menú Navegador > Rotar mapa. Tenga en cuenta que cuando se carga un mapa desde la ventana Navegador, no se gira automáticamente a menos que la casilla Girar al cargar esté marcada. Siempre se puede girar desde la ventana Navegador.
7. Ahora debería ser posible colocar el marcador o un punto en el mapa de fluorescencia y mover el escenario a la ubicación correspondiente en la cuadrícula (Figura 13).

7.3D reconstrucción

1. Esto implica los mismos pasos básicos que la tomografía TEM: alineación de la serie de inclinación seguida típicamente por retroproyección. Hay varias plataformas de software disponibles, y los datos se pueden tratar de manera similar a los datos TEM, con la excepción de que se debe omitir la corrección CTF.
2. Aplique normalizaciones de intensidad para mejorar la contribución de las proyecciones de alta inclinación o para equilibrar un cambio en la iluminación durante la serie, con la advertencia de que la información cuantitativa se ve afectada. IMOD²⁶ funciona bien, por ejemplo, mientras que AreTomo²⁷ es muy útil para la alineación sin fiducial; donde las partículas fiduciales están presentes, ClusterAlign²⁸ puede seguirlas como grupos en lugar de puntos individuales; esto es particularmente útil para los datos STEM donde las manchas pueden perderse u ocultarse por características de alto contraste.
3. Siga la reconstrucción con deconvolución 3D²⁹ para mejorar el contraste y eliminar ruido. Una vez reconstruidos, represente los datos de volumen STEM mediante cualquiera de los métodos estándar, como ortesis o segmentación de isosuperficie. Cabe destacar que la distribución de intensidad es unipolar, sin inversiones de contraste ni franjas de Fourier que aparecen en el TEM convencional de contraste de fase. Un medio interesante de representación de los tomogramas STEM, en general, es invertir el campo brillante (Figura 14). El efecto es el de los "ojos de rayos X", viendo los objetos densos de interés a través de la célula clarificada³⁰.

Resultados

Un montaje de cuadrícula completo preparado en STEM muestra las áreas con celdas de interés (Figura 4). Tenga en cuenta que la imagen está en campo oscuro, por lo que los agujeros vacíos aparecen oscuros. Las células aparecen parcialmente brillantes, donde los electrones se dispersan hacia el detector HAADF. En las partes más gruesas, típicamente los centros o cerca de las barras de cuadrícula, el contraste vuelve a oscurecerse. Esto se debe a la dispersión múltiple, por la cual los electrones alcanzan ángulos no capturados por el detector. En la práctica, estas áreas serán demasiado gruesas para la tomografía.

La siguiente etapa involucra mapas de aumento intermedio (Figura 10). Estos a menudo se llaman mapas de montaje medio, o mapas cuadrados, que se refieren a los cuadrados de cuadrícula en lugar de la forma. Incluso en el modo STEM de microsonda más bajo, también se adquirirán como imágenes de montaje. Al hacer clic en el elemento en la ventana Navegador, se carga la imagen del mapa en la ventana principal. Dentro de esta área se eligen puntos específicos para la adquisición de tomogramas. Utilice el modo Vista previa para localizar el área en el aumento de la grabación. Tenga en cuenta que puede haber un cambio lateral entre Vista previa y Grabar, dependiendo de las velocidades de escaneo. Una sola serie de inclinación se puede registrar aquí. Las mitocondrias, por ejemplo, a menudo se pueden identificar en la imagen Vista previa y Grabación (Figura 12).

Para la tomografía discontinua, la etapa viajará alrededor de la cuadrícula y es posible que no regrese exactamente a la misma ubicación. Los mapas de anclaje se utilizan para garantizar que las áreas de grabación deseadas se vuelvan a identificar de forma fiable haciendo coincidir la imagen de vista previa con una vista de menor aumento, incluso si el movimiento del escenario se ha desplazado. PyEM^23,24 ofrece una alternativa más rápida que sin duda se recomienda^, pero aún no forma parte de la instalación estándar.

En el enfoque CLEM, se puede utilizar un mapa de fluorescencia para identificar las áreas de interés para la tomografía. La fluorescencia se adquiere externamente y debe registrarse en el montaje de la cuadrícula completa. Es útil tener visibles las barras de cuadrícula y los orificios, por lo que se puede preparar un compuesto combinado de fluorescencia + campo brillante antes de la importación, por ejemplo, en el software GIMP (https://www.gimp.org) o ImageJ³¹ (tenga cuidado de que ImageJ invierta el eje vertical). Cuando el rango dinámico de la fluorescencia es grande, puede ser difícil crear tal fusión sin saturación. En este caso, los dos mapas pueden importarse por separado y luego registrarse juntos como se describe (Figura 13). De esta manera, un punto en el mapa de fluorescencia en la ventana del navegador, seguido de "Go To XY", lleva el escenario a la posición correspondiente en la cuadrícula montada en el TEM. Tenga cuidado de que pequeñas inconsistencias en la creación del montaje (o el mapa de fluorescencia, si también es un montaje) conducirán a pequeños desplazamientos; Por lo tanto, para una precisión óptima, la fluorescencia debe volver a registrarse específicamente en el mapa cuadrado. A menudo es suficiente hacer este registro a ojo, sobre la base de agujeros en la película de soporte o características compartidas con la imagen de luz de campo brillante.

La reconstrucción de la serie de inclinación da como resultado un volumen 3D (Figura 14). Este ejemplo tiene un tamaño de píxel de 2,042 nm, lo que da como resultado un campo de visión de ~4 μm. Los depósitos de fosfato de calcio (puntas de flecha naranjas) se destacan, debido al mayor número atómico en comparación con el entorno. Los microtúbulos (puntas de flecha rojas) se pueden rastrear en todo el campo de visión. Además, las membranas mitocondriales internas y externas (puntas de flecha verdes) se pueden ver claramente. La actina se puede observar como haces o como filamentos individuales. Para lograr una resolución más isotrópica, la reconstrucción puede ser procesada por deconvolución.

Figura 1: Comparación de TEM versus STEM. En TEM, el campo de visión está iluminado por un haz casi paralelo, y la lente del objetivo forma una imagen ampliada en la cámara. Para cryo-TEM, la apertura del objetivo se abre para pasar las ondas de electrones dispersos (línea roja discontinua), que, con el desenfoque, producen contraste de fase por interferencia con las ondas no dispersas (verdes). STEM, por otro lado, rasteriza un haz enfocado a través del espécimen y recoge los electrones dispersos de una manera píxel por píxel. Múltiples detectores pueden recoger electrones dispersos en diferentes ángulos. Esta cifra se ha modificado de³⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ejemplo de distorsión de imagen en el lado izquierdo debido a la alta velocidad de escaneo. Tenga en cuenta la distorsión marcada por puntas de flecha amarillas, así como los agujeros distorsionados de forma ovalada en el Quantifoil. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Diálogo de configuración de montaje para todo el montaje de la cuadrícula. Elija el aumento y el número de piezas en X e Y para que el área total alcance alrededor de 2.000 μm para obtener un mapa para la mayor parte de la cuadrícula. Elija también Mover etapa en lugar de cambiar imagen y Usar asignación de montaje, no Parámetros de grabación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: GridMap completo de bajo aumento registrado en modo STEM. Las áreas rotas aparecen completamente negras en la imagen de campo oscuro. Las áreas grises oscuras son probablemente demasiado gruesas y mal vitrificadas. Las buenas áreas candidatas para la tomografía son blancas o gris claro en esta exploración. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Cambio al proceso de marcadores. Un objeto reconocible está marcado en el mapa de baja resolución por Agregar puntos (38 en esta imagen). Tenga en cuenta el cambio entre el mapa de baja resolución (círculo verde) y el mapa de resolución media (círculo naranja). A continuación, el objeto se marca con el marcador (cruz verde, círculo rojo) y se inicia el cuadro de diálogo Cambiar a marcador. La opción elegida mueve todos los mapas a 245x en la misma cantidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Diálogo de configuración de la serie de inclinación para una serie de inclinación STEM. El esquema dosis-simétrico se utiliza de -60° a +60° en pasos de 2°. El enfoque automático se omite debido a la alta profundidad de enfoque cuando se utiliza un ángulo de convergencia bajo. No hay necesidad de refinar la eucentricidad como se ha hecho antes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Diálogo de propiedades de archivo para mapas de resolución media. Guarde como un archivo de pila MRC, elija enteros y guarde información adicional en un archivo de metadatos .mdoc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Diálogo de configuración de montaje para guardar mapas de resolución media. Para un cuadrado en una cuadrícula de malla 200, que tiene 90 μm de ancho, se recomienda un área total de al menos 90 μm x 90 μm. Elija Mover etapa en lugar de cambiar la imagen y Usar parámetros de vista en el modo de dosis baja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Grabación del mapa de resolución media. Adquirir en Elementos diálogo para grabar mapas de resolución media. Elija Mapping, Adquirir y guardar imagen o montaje, y marque Crear mapa de Navigator. En Tareas antes o después de la Primaria, elija Eucentricidad áspera y fina. Si no recibe ayuda, elija opcionalmente el cuadro Sin mensaje cuando se produzca un error y Cerrar válvulas de columna al final. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Imagen del mapa de resolución media. Mapa de resolución media (Square Map) grabado en modo STEM mediante un montaje de 3 x 3. Los dos mapas de anclaje de resolución media para la recopilación de datos se indican con los cuadrados azules. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Datos de la serie de inclinación por lotes. Adquirir en Elementos del cuadro de diálogo para recoger series de inclinación de lotes. Para la recopilación de datos de la serie de inclinación, elija Datos finales y Adquirir serie de inclinación. En Tareas antes o después de Primaria, marque Administrar Dewars/Vacuum (elija la configuración adecuada en el menú Configuración), Realinear con elemento, Perfeccionar eucentricidad y Ejecutar script antes de la acción. En las opciones generales, marque la casilla Sin mensaje cuando se produzca un error y Cerrar válvulas de columna al final (consulte 5.14). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12: Inclinación de 0° de una serie de inclinación STEM de una mitocondria. Las puntas de flecha naranjas apuntan a depósitos de fosfato de calcio (gránulos de matriz), puntas de flecha verdes a crestas y puntas de flecha rojas a marcadores fiduciarios de oro de 15 nm. Barra de escala = 500 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 13: Mapas crio-CLEM registrados. (A) El mapa STEM de resolución media (mapa cuadrado, 26-A) está registrado en el (B) mapa STEM de baja resolución, (C) mapa cryo-FM del canal BF y (D) mapa cryo-FM del canal GFP. Los nueve puntos de registro (etiquetas 4-21) se muestran en el (E) Navegador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 14: Renderizado de volumen. Representación volumétrica de (A) 60 nm y una (B) sección de 40 nm de espesor a través de un tomograma filtrado similar a SIRT (30 ciclos) a diferentes profundidades. El tamaño del píxel es de 2.048 nm, lo que resulta en un campo de visión de aproximadamente 4 μm. Tenga en cuenta la densidad invertida en comparación con la Figura 12, lo que significa que las características de alta intensidad son brillantes. Las puntas de flecha naranja, blanca, roja, verde y azul claro apuntan a depósitos de fosfato de calcio, ribosomas, microtúbulos, la membrana mitocondrial interna y externa y filamentos de actina, respectivamente. Barra de escala = 500 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo debe ayudar a los microscopistas de ciencias de la vida que estén interesados en obtener una vista 3D de los orgánulos intracelulares en regiones de la célula que no son accesibles para la tomografía TEM convencional. El mismo protocolo también se puede utilizar para la tomografía STEM de secciones plásticas, con restricciones relajadas en la exposición. El protocolo debe considerarse como un punto de partida y no como un conjunto de normas estrictas. De hecho, el poder de STEM es su flexibilidad; No hay una sola manera correcta de operarlo.

Enfatizamos que STEM, per se, se refiere solo a la sonda escaneada y no define la formación de la imagen. El contraste depende principalmente de la configuración de los detectores. Los métodos más sencillos emplean detectores con simetría axial, ya sea un disco centrado en el eje óptico o un anillo que lo rodea. En general, cuando la iluminación incide directamente en el detector, registramos una imagen BF donde la muestra (dispersión de electrones) aparece oscura; por el contrario, cuando el detector recoge solo electrones dispersos, registramos una imagen DF donde el espécimen denso aparece brillante. Cuando el hardware adecuado está disponible, SerialEM puede adquirir y grabar ambas señales simultáneamente. Hay configuraciones aún más sofisticadas disponibles, que van desde detectores con múltiples segmentos hasta cámaras totalmente pixeladas. La imagen de contraste de fase se puede lograr, por ejemplo, evaluando la diferencia entre los elementos detectores fuera del eje^32,33. La recopilación de todo el patrón de dispersión 2D (difracción) por píxel define el método conocido como 4D STEM³⁴, que permite la reconstrucción de múltiples contrastes de imagen a partir de los mismos datos originales. El STEM cuatridimensional permite la pticografía electrónica, que proporciona otro medio para obtener contraste de fase³⁵.

Nos hemos centrado en la modalidad STEM particular que consideramos más útil para el estudio de orgánulos y células intactas o secciones celulares de micras de espesor. Esto implica específicamente el uso de imágenes BF con un pequeño ángulo de semiconvergencia en la iluminación y un ángulo de recolección relativamente grande en el detector. La pequeña convergencia proporciona una gran profundidad de campo para que toda la muestra permanezca enfocada a lo largo de la serie de inclinación¹⁹. En la práctica, con una buena etapa de microscopio, también puede eliminar la necesidad de ajustar el enfoque durante la adquisición. El precio es un compromiso en la resolución, como se describe en la sección 3 del protocolo. Hemos sugerido imágenes 4k con una sonda de ~2 nm, que con un espacio de píxeles de 1 nm alcanza un campo de visión de 4 μm. Sin embargo, se recomienda encarecidamente al lector que experimente. La segunda consideración está en el lado del detector. Cuando el disco de iluminación rellena el detector BF en el eje, el contraste de fase se suprime y domina el contraste de dispersión (amplitud); Esta condición ha sido llamada contraste de campo brillante incoherente³⁶. La pregunta es por qué fracción llenar, y la respuesta depende de la muestra. Una muestra muy delgada mostrará el mejor contraste con el detector completamente lleno (es decir, el ángulo de recolección que coincide con el de la iluminación), pero una muestra más gruesa dispersará toda la intensidad, dejando una señal ruidosa con poco contraste. Una regla general útil es que cuanto más gruesa sea la muestra, mayor será el ángulo de corte exterior del detector BF²¹. El tamaño y la posición del detector son, por supuesto, fijos, por lo que el tamaño del disco de difracción se ajusta utilizando la longitud de la cámara, como se describe en la sección 1. Si los ajustes del amplificador del detector son tales que la señal llena el rango dinámico pero no se satura bajo iluminación directa (1.12.3), entonces la longitud de la cámara se puede aumentar hasta que se alcance una intensidad de señal y un contraste razonables. Una vez más, se anima al lector a experimentar. El arte, por así decirlo, está en los ángulos.

Otro parámetro, no discutido en el protocolo, es el voltaje de aceleración del microscopio. La interacción de los electrones iluminadores con la muestra será más fuerte a un voltaje más bajo. Con todo lo demás igual, podemos esperar un mayor contraste a un voltaje más bajo. Por otro lado, es el inicio de la dispersión múltiple dentro de la muestra lo que limita el grosor de la muestra utilizable, por lo que un voltaje más alto permite el uso de muestras más gruesas. Sin embargo, estos efectos son bastante sutiles. Nuestras experiencias hasta la fecha con aceleraciones de 200 kV y 300 kV son similares.

Teniendo en cuenta lo que se puede esperar de STEM en términos de resolución, esto depende nuevamente de la muestra y la configuración del detector. Usando un enfoque de análisis de partículas individuales, los iones metálicos en ferritina podrían localizarse mediante STEM de campo oscuro anular con una precisión de unos pocos angstrom³⁷. Más recientemente, se logró una resolución subnanométrica para muestras de virus y proteínas utilizando imágenes obtenidas por contraste de fase diferencial integrado (iDPC) STEM³² , así como pticografía³⁵. Para objetos únicos en especímenes celulares gruesos, y con los métodos descritos aquí, tal alta resolución no es realista. La resolución óptima es el diámetro de la sonda, que se relaciona con el ángulo de semiconvergencia como se describe. Otros factores degradarán la resolución, particularmente un muestreo de píxeles gruesos para alcanzar un gran campo de visión, desalineaciones en la serie de inclinación y propagación del haz de la sonda en la transmisión. Las imágenes se comparan bien con la tomografía de sección plástica. Con la configuración descrita aquí, por ejemplo, debería ser fácil ver el núcleo hueco de los microtúbulos, pero no los protofilamentos individuales.

En resumen, los métodos STEM y el hardware se encuentran en una fase de desarrollo. Podemos esperar que las innovaciones en imágenes también afecten a la tomografía, llevando a STEM a dominios que no han sido accesibles por otras técnicas. Esperamos que una convergencia con imágenes de fluorescencia criogénica correlativa basadas en métodos modernos de superresolución óptica sea especialmente fructífera. La escala de orgánulos, 100-1.000 nm, es un objetivo ideal para estos métodos emergentes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
SerialEM	Universidad de Colorado	Veriosn 4.0	SerialEM es una plataforma de software libre para el control de microscopios y la adquisición de datos.
		electrónico de transmisión con capacidad STEM	El protocolo se escribió sobre la base de la experiencia con varios microscopios de Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica y Tecnai T20-F. En principio, también debería ser aplicable a otros fabricantes.

Microscopio