Artículo de método

Aislamiento de vesículas extracelulares de bajo contenido de endotoxinas derivadas de líneas celulares cancerosas

DOI:

10.3791/65062

⸱

17 de febrero de 2023

 ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Jagiellonian University Medical College, 2Doctoral School of Medical and Health Sciences, Jagiellonian University, 3Institute of Veterinary Sciences, University Center of Veterinary Medicine JU-AU, University of Agriculture in Kraków

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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El protocolo propuesto incluye pautas sobre cómo evitar la contaminación con endotoxinas durante el aislamiento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultivos celulares y cómo evaluarlas adecuadamente.

Resumen

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Las vesículas extracelulares (EV) son una población heterogénea de vesículas de membrana liberadas por las células in vitro e in vivo. Su omnipresencia y su importante papel como portadores de información biológica los convierten en objetos de estudio intrigantes, que requieren protocolos confiables y repetitivos para su aislamiento. Sin embargo, darse cuenta de todo su potencial es difícil ya que todavía hay muchos obstáculos técnicos relacionados con su investigación (como la adquisición adecuada). Este estudio presenta un protocolo para el aislamiento de EVs pequeñas (según la nomenclatura MISEV 2018) a partir del sobrenadante de cultivo de líneas celulares tumorales basado en centrifugación diferencial. El protocolo incluye pautas sobre cómo evitar la contaminación con endotoxinas durante el aislamiento de EV y cómo evaluarlas adecuadamente. La contaminación por endotoxinas de los vehículos eléctricos puede obstaculizar significativamente los experimentos posteriores o incluso enmascarar sus verdaderos efectos biológicos. Por otro lado, la presencia pasada por alto de endotoxinas puede llevar a conclusiones incorrectas. Esto es de particular importancia cuando se refiere a las células del sistema inmune, incluidos los monocitos, porque los monocitos constituyen una población que es especialmente sensible a los residuos de endotoxinas. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente detectar la contaminación por endotoxinas en los EV, especialmente cuando se trabaja con células sensibles a las endotoxinas, como monocitos, macrófagos, células supresoras derivadas de mieloides o células dendríticas.

Introducción

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Las vesículas extracelulares (EV), según la nomenclatura MISEV 2018, son un término colectivo que describe varios subtipos de vesículas membranosas secretadas por células que desempeñan un papel crucial en numerosos procesos fisiológicos y patológicos 1,2. Además, los vehículos eléctricos son prometedores como nuevos biomarcadores para diversas enfermedades, así como como agentes terapéuticos y vehículos de administración de fármacos. Sin embargo, realizar todo su potencial es difícil, ya que todavía hay muchos obstáculos técnicos relacionados con su adquisición3. Uno de esos desafíos es el aislamiento de EV libres de endotoxinas, que se ha descuidado en muchos casos. Una de las endotoxinas más comunes es el lipopolisacárido (LPS), que es un componente importante de las paredes celulares bacterianas gramnegativas y puede causar una respuesta inflamatoria aguda, debido a la liberación de un gran número de citoquinas inflamatorias por varias células 4,5. LPS induce una respuesta mediante la unión a la proteína de unión a LPS, seguida de la interacción con el complejo CD14/TLR4/MD2 en las células mieloides. Esta interacción conduce a la activación de vías de señalización dependientes de MyD88 y TRIF, que a su vez desencadenan el factor nuclear kappa B (NFkB). La translocación de NFkB al núcleo inicia la producción de citoquinas6. Los monocitos y macrófagos son altamente sensibles al LPS, y su exposición al LPS resulta en una liberación de citoquinas inflamatorias y quimiocinas (por ejemplo, IL-6, IL-12, CXCL8 y TNF-α)7,8. La estructura CD14 permite la unión de diferentes especies de LPS con afinidad similar y sirve como co-receptor para otros receptores tipo toll (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 y 9)6. El número de estudios que se están realizando sobre los efectos de las EV en monocitos/macrófagos sigue aumentando 9,10,11. Especialmente desde la perspectiva del estudio de las funciones de los monocitos, sus subpoblaciones y otras células inmunes, la presencia de endotoxinas e incluso su presencia enmascarada en EV es de gran importancia12. La contaminación pasada por alto de los vehículos eléctricos con endotoxinas puede llevar a conclusiones engañosas y ocultar su verdadera actividad biológica. En otras palabras, trabajar con células monocíticas requiere confianza en ausencia de contaminación por endotoxinas13. Las fuentes potenciales de endotoxinas pueden ser agua, medios y sueros obtenidos comercialmente, componentes y aditivos de medios, cristalería de laboratorio y artículos de plástico 5,14,15.

Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un protocolo para el aislamiento de EV con bajo contenido de endotoxinas. El protocolo proporciona consejos simples sobre cómo evitar la contaminación por endotoxinas durante el aislamiento de EV en lugar de eliminar las endotoxinas de EV. Anteriormente, se han presentado muchos protocolos sobre cómo eliminar endotoxinas de, por ejemplo, nanopartículas diseñadas utilizadas en nanomedicina; sin embargo, ninguno de ellos es útil para estructuras biológicas como los EV. La despirogenación efectiva de nanopartículas puede llevarse a cabo mediante enjuague con etanol o ácido acético, calentamiento a 175 °C durante 3 h, irradiación γ o tratamiento con tritón X-100; sin embargo, estos procedimientos conducen a la destrucción de los vehículos eléctricos16,17.

El protocolo presentado es un estudio pionero centrado en evitar las impurezas de endotoxinas en las EV, a diferencia de estudios previos sobre el efecto de las EV en los monocitos9. La aplicación de los principios propuestos a la práctica de laboratorio puede ayudar a obtener resultados de investigación confiables, lo que puede ser crucial cuando se considera el uso potencial de EV como agentes terapéuticos en la clínica12.

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Protocolo

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1. Preparación de tubos de ultracentrífuga

  1. Use tubos estériles de un solo uso. Si esto no es posible, reutilice los tubos de ultracentrífuga después de lavarlos con un detergente utilizando una pipeta estéril Pasteur u otros aplicadores de un solo uso. Recuerde que los tubos de ultracentrífuga deben dedicarse a un tipo de material centrifugado (sobrenadante de cultivo celular / suero / plasma) y especies (humano / ratón / etc.).
  2. Después de un lavado con detergente, enjuague los tubos de ultracentrífuga con agua desionizada y sin LPS 3x.
    NOTA: No utilice agua de baja calidad.
  3. Seque los tubos de ultracentrífuga y luego llénelos con etanol al 70%. Deje los tubos con etanol al 70% para la desinfección durante la noche. Retire el etanol y seque los tubos nuevamente.
  4. Coloque los tubos y tapas en el embalaje de esterilización y ciérrelos herméticamente. Utilizar el método de esterilización por plasma o gas (óxido de etileno)18,19. Guarde los tubos de ultracentrífuga encerrados en el embalaje de esterilización en un lugar seco y utilícelos antes de la fecha de vencimiento.
    NOTA: Realice un monitoreo mensual del nivel de LPS en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el agua utilizada para el aislamiento de EV. El monitoreo también debe incluir los tubos (por ejemplo, probando el agua [control de lavado] que se ha almacenado en los tubos de ultracentrífuga durante la noche a temperatura ambiente [RT]).

2. Preparación de suero fetal bovino con bajo contenido de endotoxinas sin EV (EE-FBS)

  1. Asegúrese de usar FBS de endotoxinas ultra bajas (disponible comercialmente; ver Tabla de materiales; <0.1 EU/mL).
  2. Colocar un frasco de endotoxina ultra baja FBS en un baño maría e incubar a 56 °C durante 30 min. Este paso es necesario para desactivar el sistema del complemento.
  3. Pipetear el FBS inactivado a tubos de ultracentrífuga y centrifugarlo a 100.000 x g durante 4 h a 4 °C. Recoja el sobrenadante en tubos estériles de 50 ml, asegurándose de no exceder los 45 ml por tubo para evitar la contaminación de la tapa y humedecer el anillo del tubo.
  4. Conservar el suero EE-FBS preparado de esta manera a -20 °C. Compruebe la concentración de LPS en EE-FBS (paso 6). La concentración de LPS debe estar al mismo nivel que antes de la ultracentrifugación.

3. Cultivo celular

  1. Para este estudio, cultivar líneas celulares SW480 y SW620 en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L de glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio y gentamicina (50 μL/ml) suplementado con EE-FBS al 10% en matraces de cultivo de 75cm2 utilizando una técnica aséptica. Sembrar casi 4,5 x 106 células y 6,5 x 106 células por matraz para SW480 y SW620, respectivamente.
  2. Recoger los sobrenadantes dos veces por semana (~10 ml por matraz) cuando las células alcancen la confluencia completa (~13,5 x 10 6 y 20 x 106 células por matraz para SW480 y SW620, respectivamente), y dividir. Asegurar que la viabilidad de las células no sea inferior al 99% y que las células se cultiven a 37 °C en una atmósfera deCO2 al 5%.
  3. Recoja los sobrenadantes del cultivo celular en tubos de 15 ml debidamente etiquetados. Centrifugar los sobrenadantes recolectados a 500 x g durante 5 minutos a RT para eliminar los restos celulares.
  4. Recoja los sobrenadantes con cuidado, evite aspirar residuos, colóquelos en tubos etiquetados y centrifugar nuevamente a 3.200 x g durante 12 minutos a 4 °C.
  5. Recoja sobrenadantes del segundo paso de centrifugación en tubos estériles etiquetados de 50 ml. Evite mojar los bordes de los tubos. Asegúrese de que el volumen de sobrenadante no exceda los 45 ml y que los tubos se mantengan verticalmente.
  6. Envuelva la tapa del tubo con una película transparente estéril y guarde los sobrenadantes en posición vertical a -80 °C.
    NOTA: Realizar un control mensual de Mycoplasma spp. y contaminación por LPS en sobrenadantes de cultivo fresco (paso 6). Si el nivel de endotoxina en los sobrenadantes supernadante supera 0,05 EU/ml, verifique en qué etapa podría haberse producido la contaminación y reinicie el proceso desde el principio. Si la contaminación del cultivo celular por Mycoplasma spp. se detecta, el aislamiento de los vehículos eléctricos de tales sobrenadantes debe suspenderse.

4. Aislamiento de EVs de sobrenadantes de cultivos celulares

  1. Prepare filtros de jeringa de 0,22 μm y jeringas de volumen adecuado. Preparar dos tubos con sobrenadantes de cultivo (90 mL).
  2. Llene la jeringa con el sobrenadante y conecte el filtro al adaptador de aguja. Coloque la jeringa llena con el filtro sobre un tubo de 50 ml. Empuje la brida del émbolo y recoja ~90 ml de filtrado.
  3. Pipetear el filtrado (7 ml) a los tubos de ultracentrífuga (asegurándose de que se pipetea el mismo volumen a cada tubo para un equilibrio adecuado) y centrifugar a 100.000 x g durante 2 h a 4 °C.
    NOTA: La eficiencia de la peletización de vehículos eléctricos depende de muchos factores (por ejemplo, el tipo de rotor, su factor k, la longitud de la ruta de migración, la viscosidad del medio, etc.), que deben optimizarse para una mejor recuperación de los vehículos eléctricos20.
  4. Deseche el sobrenadante con una pipeta estéril de Pasteur. Recoja los gránulos restantes con puntas de pipeta largas y filtradas y agrúyelos en dos tubos de ultracentrífuga. Llénelos hasta 7 ml con PBS filtrado libre de endotoxinas para enjuagar los EV.
  5. Centrifugar los pellets resuspendidos con PBS a 100.000 x g durante 2 h a 4 °C. Retire completamente el sobrenadante con una pipeta estéril de Pasteur y añada 200 μL de PBS filtrado y libre de endotoxinas a ambos tubos para resuspender los EV. Pipetea suavemente el pellet de EV para recoger todos los EV.
  6. Transfiera la suspensión EV a un tubo de ensayo estéril de 1,5 ml (si es posible, use un tubo de unión a proteínas bajas). Retener 10 μL de la suspensión EV para preparar una dilución para el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y para otros fines (por ejemplo, medición de la concentración de proteínas).
  7. Diluir los EV con PBS filtrado (1:1.000) para mediciones por NTA, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Asegure los tubos EV envolviendo la tapa con una película transparente estéril. Guarde los vehículos eléctricos a -80 °C.

5. Detección de marcadores específicos por western blotting

  1. Determinar el nivel de proteína en las muestras (por ejemplo, mediante el ensayo de Bradford) y preparar las muestras (20 μg) con tampón de carga. Preparar el tampón de carga mezclando 5 μL de tampón de muestra (4x) y 2 μL de agente reductor de muestras (10x) hasta un volumen total de 20 μL. Incubar las muestras a 70 °C durante 10 min.
  2. Prepare geles de poliacrilamida con SDS (10%-14%) y cargue los 20 μg de EV en cada pocillo.
  3. Ejecutar la electroforesis con tampón de funcionamiento (30 g de Tris, 144 g de glicina, 10% SDS por 1 L) durante 45 min a 150 V.
  4. Realizar la transferencia semiseca de proteínas del gel a la membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) en una máquina de transferencia con tampón Towbin (1,51 g de Tris, 7,2 g de glicina, 10% de metanol por 0,5 L) a 25 V durante 1 h.
  5. Coloque la membrana en tampón TBST (1 ml de Tween, 100 ml de solución salina tamponada con Tris (TBS 10x) por 1 L) para bloquear con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en tampón TBST, e incube durante 1 h en el balancín en RT.
  6. Añadir anticuerpos diluidos (1:1.000), anti-CD9 1 (clon#D8O1A) o anti-Alix 1 (clon#3A9), en BSA al1% e incubar con la membrana durante la noche a 4 °C en el balancín. Retire los anticuerpos y lave la membrana 3x con 10 mL de 1x TBST durante 10 minutos.
  7. Añadir anticuerpo secundario anticonejo de cabra o antiratón de cabra (dilución: 1:2.000) conjugado con peroxidasa de rábano picante, dependiendo del anticuerpo primario en la membrana, e incubar durante 1 h en el balancín en RT. Eliminar anticuerpos y lavar la membrana 3x con 10 ml de 1x TBST durante 10 minutos.
  8. Mezcle el sustrato y el luminol en una proporción de 1:1 para obtener una solución de 1 ml. Vierta la solución sobre la membrana. Coloque la membrana inmediatamente en la cámara de medición del sistema de imágenes, elija el módulo de quimioluminiscencia y visualice las bandas de proteínas en la pantalla.

6. Medición del nivel de endotoxinas mediante la prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL)

  1. Realizar la medición cromogénica de LAL del nivel de endotoxinas, de acuerdo con la recomendación del fabricante. Brevemente, use el método basado en la interacción de la endotoxina con el lisado de amebocitos de limulus (LAL). El límite de detección de este método es de 0,005 EU/mL.
    NOTA: El ensayo LAL, a pesar de sus limitaciones, sigue siendo actualmente el método estándar para detectar y cuantificar la contaminación por endotoxinas en diferentes tipos de soluciones y otros productos utilizados en ciencia o medicina8. El factor limitante de este kit es la estabilidad de la solución de lisado de amebocitos reconstituida, que es estable durante solo 1 semana a -20 °C si se congela inmediatamente después de la reconstitución.
  2. Use una dilución diez veces mayor de EV y otras muestras y una dilución de suero de 50 veces. Para experimentos adicionales, use solo reactivos de endotoxinas bajas como EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0.005 EU/mL) y sobrenadantes de cultivo libres de LPS.

7. Detección del gen procariota 16S rRNA en muestras de EV

  1. Aislar el ADN de las muestras EV. Trate de mantener los reactivos y el sitio de aislamiento asépticos. Mida la concentración y calidad del ADN (por ejemplo, usando un espectrofotómetro).
  2. Realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como se describió anteriormente21. Prepare gel de agarosa al 1,5% con bromuro de etidio o verde SYBR para visualizar los productos de PCR en luz ultravioleta (UV).
  3. Ejecute la electroforesis de la muestra y el marcador de peso con tampón TRIS-acetato-EDTA a 75 V durante 45 min. Visualice las bandas de ADN utilizando el sistema de imágenes.

8. Determinación de la concentración efectiva de LPS para la estimulación en el modelo de monocitos humanos

  1. Preparar 2 x 106 monocitos/ml de suspensión de monocitos en RPMI 1640 suplementado con L-glutamina, glucosa y EE-FBS al 2%. Añadir 50 μL de la suspensión por pocillo de una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos22.
  2. Añadir un volumen adecuado de LPS o medio de cultivo para obtener las siguientes concentraciones finales: 0 pg/mL (control), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL y 100 ng/mL, en 100 μL de volumen total de suspensión celular. Haga triplicados de cada concentración de LPS.
  3. Cultivar las células durante 18 h a 37 °C, 5%CO2. Recoge el sobrenadante.
  4. Girar el sobrenadante a 2.000 x g durante 5 min. Transfiera los sobrenadantes a tubos nuevos. Mida la concentración de TNF8,23 e IL-1023 en sobrenadantes recolectados con el kit de citoquinas humanas de matriz de perlas citométricas (CBA), de acuerdo con el procedimiento del fabricante, con un citómetro de flujo.

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Resultados

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Un requisito previo o paso obligatorio para este protocolo es la exclusión de la posible contaminación por endotoxinas de los reactivos. Todos los reactivos utilizados, como FBS, DMEM, RPMI, PBS e incluso tubos de ultracentrífuga, deben estar libres de endotoxinas (<0.005 EU/mL). Mantener el régimen de no contaminación por endotoxinas no es fácil ya que, por ejemplo, el suero regular/estándar para cultivo celular puede ser su fuente rica (0,364 EU/ml; ver Tabla 1).

Aunque e...

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Discusión

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En los últimos años, los métodos para el aislamiento adecuado de los vehículos eléctricos se han vuelto cada vez más importantes, lo que permite sus análisis más confiables, por ejemplo, en el contexto de la obtención de datos ómicos y funcionales confiables24. Con base en la experiencia de investigación previa, parece que no solo el tipo de método de aislamiento, sino también otras condiciones durante este procedimiento pueden ser importantes. El uso de FBS sin EV es ampliamente reconocido como u...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera construirse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Ciencias, Polonia, número de subvención 2019/33 / B / NZ5 / 00647. Nos gustaría agradecer al profesor Tomasz Gosiewski y Agnieszka Krawczyk del Departamento de Microbiología Médica Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad Jagiellonian por su inestimable ayuda en la detección de ADN bacteriano en EV.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
  Alix (3A9) Ratón mAb Tecnología de señalización celular2171
Filtro 1250ul Puntas de pipeta universales, transparentes, de polipropileno, no pirogénicasGoogLab ScientificGBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Citómetro de flujoBD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit IIBD Biosciences551809
CD9 (D8O1A) Tecnologíade señalización celular13174
Sistema de imágenes ChemiDocBio-Rad Laboratories, Inc. 
DMEM (Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio) Corning10-013-CV
ELX800NB, Lector universal de microplacasBIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Suero Fetal BovinoGibco 16000044
Suero Fetal Bovino Sudamérica Endotoxina Ultra Baja  Biowest  S1860-500
Gentamicina, 50 mg/mL  PAN – BiotechP06-13100
IgG anti-ratón de cabra- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2004
IgG anti-conejo de cabra- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2005
Membrana de PVDF Immun-BlotBio-Rad Laboratories, Inc. 
LPS de Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)  Enzo Ciencias de la Vida, Inc.ALX-581-009-L002
Mini celda de transferencia electroforética trans-blotBio-Rad Laboratories, Inc. 
Análisis de seguimiento de nanopartículas Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Tampón de muestras (4X)  Invitrogen  NP0007
NuPAGE Agente reductor de muestras (10x)  InvitrogenNP0004
ParafilmSigma AldrichP7793película transparente
Perfect 100-1000 bp DNA LadderEURxE3141-01 
Kit PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant ThermoScientificA39552
PP Oak Ridge Tubo con tapones de selladoThermo Scientific3929, 03613
RPMI 1640RPMI-1640 (Gibco)11875093
Termociclador SimpliAmpBiosistema aplicadoA24811
Centrífuga Sorvall wX+ ULTRA SERIES con rotorT-1270Sistema de
Sub-Cell GTBio-Rad Laboratories, Inc. 
SuperSignal West Pico PLUS Sustrato quimioluminiscenteThermo Scientific34577
Línea celular SW480Colección de cultivos tipo americano (ATCC)
Línea celular SW480Colección de cultivos tipo americano (ATCC)
Filtro de jeringa 0,22 mmmTPP99722
Trans-Blot SD Célulade transferencia semisecaLaboratorios Bio-Rad, Inc. 1703940Máquina de transferencia
Pipeta de transferencia, 3,5 mLSARSTEDT86.1171.001
mAb de conejo 1700140116201771703930 electroforesis horizontal Thermo Scientific 75000100 1704401

Referencias

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