El presente protocolo describe un método simple y eficiente para la identificación de metabolitos de 2,4-dibromofenol en plantas.
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Artículo de método
Elucidación del metabolismo del 2,4-dibromofenol en plantas
En este artículo
Resumen
Resumen
Los cultivos pueden estar ampliamente expuestos a contaminantes orgánicos, ya que el suelo es un sumidero importante para los contaminantes desechados en el medio ambiente. Esto crea una exposición humana potencial a través del consumo de alimentos acumulados con contaminantes. Esclarecer la absorción y el metabolismo de los xenobióticos en los cultivos es esencial para evaluar el riesgo de exposición alimentaria en los seres humanos. Sin embargo, para tales experimentos, el uso de plantas intactas requiere experimentos a largo plazo y protocolos complejos de preparación de muestras que pueden verse afectados por varios factores. Los cultivos de callos vegetales combinados con espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) pueden proporcionar una solución para la identificación precisa y rápida de metabolitos de xenobióticos en plantas, ya que pueden evitar la interferencia del microambiente microbiano o fúngico, acortar la duración del tratamiento y simplificar el efecto matriz de las plantas intactas. El 2,4-dibromofenol, un retardante de llama y disruptor endocrino típico, se eligió como sustancia modelo debido a su presencia generalizada en el suelo y a su potencial de absorción por las plantas. En este trabajo, el callo vegetal se generó a partir de semillas de asepsia y se expuso a un medio de cultivo estéril que contenía 2,4-dibromofenol. Los resultados mostraron que se identificaron ocho metabolitos de 2,4-dibromofenol en los tejidos de callos de la planta después de 120 h de incubación. Esto indica que el 2,4-dibromofenol se metabolizó rápidamente en los tejidos callosos de las plantas. Por lo tanto, la plataforma de cultivo de callos vegetales es un método eficaz para evaluar la absorción y el metabolismo de los xenobióticos en las plantas.
Introducción
Un número cada vez mayor de contaminantes orgánicos han sido descartados en el medio ambiente debido a las actividades antropogénicas 1,2, y el suelo se considera un importante sumidero de estos contaminantes 3,4. Los contaminantes del suelo pueden ser absorbidos por las plantas y potencialmente transferidos a organismos de nivel trófico superior a lo largo de las cadenas alimentarias, entrando directamente en el cuerpo humano a través del consumo de cultivos, lo que conduce a una exposición no intencionada 5,6
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Protocolo
1. Diferenciación del callo de zanahoria
NOTA: Autoclave todo el equipo utilizado aquí y realice todas las operaciones en un banco de trabajo ultralimpio esterilizado por UV.
- Vernalizar las semillas sumergiendo las semillas uniformes de zanahoria (Daucus carota var. sativus) en agua desionizada a 4 °C durante 16 h.
- Esterilizar las semillas vernalizadas con etanol al 75% durante 20 minutos y luego enjuagar tres veces con agua desionizada estéril en condiciones asépticas.
- Esterilizar las semillas con 20% de H 2 O2durante 20 min, y lavarlas con agua desionizada ester....
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Resultados
Los pasos del protocolo se muestran en la Figura 1. Siguiendo el protocolo, comparamos el cromatograma del extracto de callo de zanahoria del tratamiento con 2,4-dibromofenol con los controles, y encontramos ocho picos distintos que están presentes en el tratamiento con 2,4-dibromofenol pero ausentes en los controles (Figura 2). Esto indica que un total de ocho metabolitos de 2,4-dibromofenol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 y M187) se detectaron con éx.......
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Discusión
Este protocolo fue desarrollado para identificar eficientemente la biotransformación de xenobióticos en plantas. El paso crítico de este protocolo es el cultivo del callo de la planta. La parte más difícil es la diferenciación y el mantenimiento del callo de la planta, porque el callo de la planta se infecta fácilmente y se convierte en tejidos vegetales. Por lo tanto, es importante asegurarse de que todos los equipos utilizados estén esterilizados en autoclave y que todas las operaciones se realicen en condiciones asépt.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (21976160) y el Proyecto de Investigación de Aplicación de Tecnología de Bienestar Público (LGF21B070006) de la provincia de Zhejiang.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido 2,4-diclorofenoxiacético | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O<>2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-bencilaminopurina | WAKO | 0,5 mg/L | |
| 75% etanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 cromatografía de gases | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance cromatografía líquida | Aguas | ||
| Viales de vidrio ámbar | Aguas | ||
| Incubadora de clima artificial | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 columna | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrífuga | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS columna capilar | Agilent | ||
| Diclorometano | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Liofiliz | |||
| Trituradora de tisú de alto rendimiento | SCIENTZ | ||
| masas de metanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII | Sistema Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Medio Skoog | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexano | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Instrumento de soplado de nitrógeno | AOSHENG | MD200-2 | |
| isómeros NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Cartuchos Oasis HLB | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µ L | |
| Semillas de zanahoria Little Finger (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Sacudiendo Incubadoras | Shanghai bluepard instruments Co., ltd. | THZ-98AB | |
| Extractor de fase sólida | AUTO SCIENCE | ||
| Ecógrafo | ZKI | UC-6 | |
| Banco de trabajo ultralimpio esterilizado por UV | AIRTECH |
Referencias
- Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 10....
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