Aislar células epiteliales bronquiales del tejido pulmonar resecado para biobancos y establecer cultivos de interfaz aire-líquido bien diferenciados

El papel del epitelio de las vías respiratorias en una variedad de enfermedades pulmonares agudas y crónicas ha sido descrito en varias revisiones 1,2,3,4,5,6,7. Los cultivos bien diferenciados de células epiteliales de las vías respiratorias son una herramienta importante para desentrañar el papel del epitelio de las vías respiratorias. El cultivo de células epiteliales de la vía aérea de la interfaz aire-líquido (LPA) se aplica ampliamente para promover la diferenciación de las células epiteliales basales de las vías respiratorias y, por lo tanto, estudiar el epitelio de las vías respiratorias de manera confiable in vitro ^8,9. En los últimos años, el uso de tales modelos ha aumentado aún más como resultado de nuevas iniciativas de investigación relacionadas con la pandemia de COVID-19 y una transición mundial hacia la investigación libre de animales. Por lo tanto, el mayor uso de esta línea celular modelo enfatiza la necesidad de compartir procedimientos y experiencias para obtener resultados sólidos. Esto también permitirá la comparación de resultados entre grupos de investigación. La robustez del procedimiento es la característica clave y, por lo tanto, debe someterse a un control de calidad. Varios laboratorios han invertido en el desarrollo de protocolos para cultivar células epiteliales primarias de las vías respiratorias en el ALI. El tiempo, el esfuerzo y el presupuesto requerido se pueden reducir cuando estos procedimientos se comparten en detalle. Estos detalles incluyen, por ejemplo, la elección de plásticos y medios de cultivo celular proporcionados por varios fabricantes, ya que se encontró que esto influyó en las características de los cultivos obtenidos^10,11,12. Esto enfatiza la importancia de compartir experiencias y detalles de los procedimientos de cultivo, ya que en ausencia de tales conocimientos, los resultados pueden verse afectados y / o los esfuerzos de validación en varios laboratorios pueden verse obstaculizados.

El epitelio pulmonar humano comprende varios tipos de células, incluidos los tipos principales, como las células basales, las células ciliadas, las células caliciformes y las células club. Para imitar de manera confiable la capa celular epitelial en las vías respiratorias in vitro, estos tipos de células deben estar representados en los modelos de cultivo, y su polarización y función deben mantenerse^13,14,15,16. La comprensión de que las características del donante (incluido el estado de la enfermedad) y el origen anatómico de las células (es decir, las vías respiratorias nasales, traqueales, grandes y pequeñas) pueden afectar la composición celular y las respuestas funcionales del cultivo celular es igualmente importante. La experiencia y la práctica relevantes son un requisito previo para cultivar con éxito las células epiteliales primarias de las vías respiratorias y evaluar la calidad del cultivo tanto intuitivamente (mediante inspección visual durante el cultivo) como cuantificablemente. El objetivo de esta contribución es proporcionar un método rentable y eficaz en tiempo para el aislamiento y el cultivo de células epiteliales bronquiales humanas primarias (PBEC) que también se puede aplicar al cultivo de células epiteliales traqueales y de las vías respiratorias pequeñas. Además de describir un método para aislar dichas células del tejido pulmonar resecado, se presenta y discute un método para la expansión y el biobanco, y finalmente para el establecimiento y caracterización de un cultivo de LPA bien diferenciado dentro de un costo y período de tiempo razonables.

Las células se aislaron de tejido pulmonar macroscópicamente normal obtenido de pacientes sometidos a cirugía de resección por cáncer de pulmón en el Centro Médico de la Universidad de Leiden, Países Bajos. Los pacientes de los que se derivó este tejido pulmonar se inscribieron en el biobanco a través de un sistema de no objeción para el uso posterior anónimo codificado de dicho tejido (www.coreon.org). Sin embargo, desde el 01-09-2022, los pacientes se han inscrito en el biobanco utilizando el consentimiento informado activo de acuerdo con las regulaciones locales del biobanco LUMC con la aprobación del comité ético médico institucional (B20.042/Ab/ab y B20.042/Kb/kb).

NOTA: Todos los procedimientos se realizan en un gabinete de seguridad biológica, de acuerdo con las normas locales de seguridad biológica, y bajo condiciones de trabajo estériles mientras se usan guantes quirúrgicos y una bata de laboratorio, a menos que se indique lo contrario. Para todos los medios, reactivos y otras soluciones utilizadas en el protocolo, consulte la Tabla de materiales y la Tabla complementaria 1. Consulte la Figura 1 para conocer los pasos detallados del protocolo

1. Aislamiento de células epiteliales bronquiales del tejido pulmonar humano

NOTA: Para obtener una tasa de éxito óptima para el aislamiento de células epiteliales bronquiales, el anillo bronquial extirpado debe mantenerse sumergido a 4 °C durante un máximo de 24 h en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con primocina añadida.

1. Preparativos antes del inicio del procedimiento
   1. Prepare una solución de recubrimiento en PBS, como se describe en la Tabla suplementaria 1, y cubra un número apropiado de placas de 6 pocillos con 1.5 ml de solución de recubrimiento por pocillo. Incubar durante 2 h en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% de_CO2.
      NOTA: El número de pocillos a recubrir depende del tamaño del tejido extirpado. Como pauta aproximada, se recubren cuatro placas de 6 pocillos cuando el anillo bronquial extirpado tiene 10 mm de diámetro y 4 mm de ancho.
   2. Preparar un medio completo sin suero de queratinocitos (c-KSFM), como se describe en la Tabla suplementaria 1; use 2 ml del medio por pocillo de una placa de 6 pocillos.
      NOTA: Este c-KSFM se puede almacenar a 4 °C durante 7 días. c-KSFM es un medio bajo en calcio utilizado para la expansión de las células epiteliales de las vías respiratorias mientras inhibe el crecimiento de fibroblastos contaminantes.
2. Limpie el anillo bronquial enjuagando suavemente el anillo con 10 ml de PBS estéril en una placa de Petri de 10 cm. Use pinzas para sostener cuidadosamente el anillo (solo toque afuera) y tijeras pequeñas para eliminar cualquier exceso de tejido conectivo y restos de sangre. Para su posterior procesamiento, corte el anillo en dos.
   NOTA: Todas las herramientas utilizadas en el proceso deben esterilizarse antes de su uso.
3. Sumergir las dos mitades del anillo bronquial en 10 ml de una solución precalentada de proteasa XIV (1,8 mg/ml) en la solución salina balanceada de Hank (HBSS), incluyendo Primocina en un recipiente estéril cerrado, e incubar durante exactamente 2 h a 37 °C en una incubadora de cultivo celular.
   NOTA: HBSS se utiliza como diluyente para la proteasa XIV para separar las células del tejido durante un período de incubación de 2 h. HBSS es una solución isotónica equilibrada que permite el mantenimiento de la viabilidad celular durante incubaciones a corto plazo.
4. Después de la incubación, transfiera los trozos de tejido a una placa de Petri con 10 ml de PBS caliente y raspe el interior del anillo con pinzas dobladas para obtener una solución celular.
   NOTA: El tejido parece más blando y algo expandido.
5. Deseche el anillo, transfiera la solución celular a un tubo de 50 ml y agregue PBS caliente para obtener un volumen final de 50 ml. Centrifugar durante 7 min a 230 x g y a temperatura ambiente (RT).
6. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 mL de PBS caliente. Además, enrasar el volumen hasta 50 ml con PBS caliente. Centrífuga durante 7 min a 230 x g en RT.
7. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en una cantidad adecuada de c-KSFM caliente que contenga Primocina.
   NOTA: La primocina se usa durante un mínimo de 7 días para eliminar cualquier bacteria, hongo o micoplasma (lo que es más importante) que pueda haber estado presente en el tejido; Después de 7 días, la adición de sólo penicilina/estreptomicina al medio es suficiente.
8. Aspire la solución de recubrimiento de las placas de 6 pocillos y agregue 2 ml de suspensión celular por pocillo.
9. Permita que las células crezcan hasta que se alcance una confluencia del 80% al 90% y cambie el medio tres veces por semana (por ejemplo, todos los lunes, miércoles y viernes). El grado de confluencia deseado suele alcanzarse entre 7 y 14 días; Si el tiempo requerido para alcanzar la confluencia deseada excede los 14 días, deseche las celdas.
   NOTA: En los primeros días, sólo un pequeño número de células comienzan a proliferar; Los grupos de células se notan después de unos días.

2. Criopreservación de células epiteliales bronquiales primarias humanas (PBEC)

NOTA: Cuando se trabaja con temperaturas de -80 °C y -196 °C, se utilizan guantes criogénicos para la protección y pinzas para transferir viales congelados. Cuando se trabaja con nitrógeno líquido, se utilizan guantes criogénicos y un protector facial para la protección personal.

1. Aspire el medio y lave los pocillos una vez con 2 ml de PBS caliente por pocillo.
2. Tripsinizar las células añadiendo 0,5 ml de tripsina blanda por pocillo (ver Tabla suplementaria 1 para la composición de la solución de tripsina blanda). Incubar las células durante 5 a un máximo de 10 min a 37 °C. Agite la solución de tripsina en la placa y libere las células golpeando suavemente la placa.
3. Transfiera las células desprendidas a un tubo de centrífuga de 50 ml que contenga 1,1 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja (SBTI; para inhibir la actividad de la tripsina) disuelto en KSFM con penicilina/estreptomicina. El volumen de SBTI debe ser el doble del volumen total de tripsina blanda (es decir, 1 ml por pocillo).
   NOTA: No agregue SBTI directamente a los pocillos, ya que las celdas se volverán a conectar en cuestión de minutos.
4. Centrifugar el tubo durante 7 min a 230 x g en RT.
5. Desechar el sobrenadante y resuspender las células granuladas en 10 ml de RT KSFM que contenga penicilina/estreptomicina, pero sin otros aditivos. Cuente las células con un hemocitómetro o un contador celular automatizado. Realice un recuento de células vivas/muertas agregando azul de tripano en una proporción de 1:1, o utilice un procedimiento alternativo de recuento de células vivas/muertas.
6. Creír las células a una concentración de 400.000 células por ml de medio de congelación (consultar la Tabla suplementaria 1 para la composición) y añadir 1 ml de esta suspensión por criovial. Transfiera los crioviales a un recipiente coolcell y colóquelo a -80 °C. Después de 24 h, transfiera los viales a -196 °C de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
   NOTA: Dos opciones son posibles para transferir las células al medio de congelación, las cuales funcionan bien: 1) Granular las células nuevamente por centrifugación y resuspenderlas en medio de congelación en frío a la concentración celular requerida; o 2) añadir medio de congelación en frío y ajustar la concentración del criopreservante (dimetilsulfóxido [DMSO]) en función del volumen de KSFM en el que están presentes las células.

3. Descongelar PBEC criopreservados y cultivarlos para su cultivo en insertos

1. Cubrir un matraz de cultivo celular T75 durante la noche con 10 ml de solución de recubrimiento en PBS con las tapas bien cerradas. Incubar el matraz en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% de_CO2.
2. Antes de descongelar los PBEC criopreservados, retire la solución de recubrimiento del matraz y llénela con 10 ml de c-KSFM. Dejar calentar a 37 °C en una incubadora de cultivo celular, con tapas ligeramente abiertas para dejar entrar el aire de la incubadora.
3. Descongele las células rápidamente en un baño de agua o cuentas a 37 °C.
   NOTA: Se prefiere un baño de cuentas a un baño de agua debido al menor riesgo de contaminación y menor consumo de energía.
4. Añadir el contenido completo del criovial al matraz T75 precalentado con medio (paso 3.2) y distribuir las células uniformemente.
   NOTA: No centrifugue las células en esta etapa, ya que no sobrevivirán al paso de centrifugación.
5. Después de aproximadamente 4 h, asegúrese de que las células estén suficientemente unidas. Reemplace el medio con 10 ml de c-KSFM fresco y caliente.
   NOTA: De esta manera, se elimina el DMSO del medio de congelación. Este paso debe tener lugar entre 4 h y 24 h después de sembrar las células en el matraz.
6. Cultive las células hasta alcanzar una confluencia del 80% al 90%, cambiando el medio todos los lunes, miércoles y viernes.

4. Establecimiento de un cultivo de interfaz aire-líquido con células epiteliales bronquiales primarias (ALI-PBEC)

NOTA: El siguiente procedimiento es para el cultivo de PBEC en insertos de 11,9 mm de diámetro interior.

1. Cubra un número adecuado de insertos de cultivo celular con 0,4 ml de solución de recubrimiento por inserto. Incubar durante la noche a 37 °C en una incubadora de cultivo celular.
2. Preparar el medio BD completo (medio cBD), como se describe en la Tabla suplementaria 1.
   NOTA: El medio cBD es un medio compuesto (ver Tabla Suplementaria 1) formulado para apoyar el crecimiento de las células epiteliales bronquiales durante períodos de tiempo más largos, al tiempo que permite su diferenciación después de un aumento en la concentración de ácido retinoico (AR) (o un análogo de la AR como se usa en el presente protocolo) y el cultivo en el ALI, como se describe en el paso 4.10.
3. Tripsinizar los PBEC en el matraz T75, utilizando 2 ml de tripsina blanda por matraz. Incubar las células durante 5 a 10 minutos para permitir que las células se desprendan (según la inspección visual). Después de 5 minutos de incubación, facilitar el desprendimiento de las células girando la tripsina en el matraz y golpeando suavemente el matraz (repetir si es necesario).
4. Añadir 4 ml de SBTI al matraz y transferir directamente la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 25 ml.
   NOTA: Las celdas se vuelven a conectar en cuestión de minutos. Por lo tanto, cuando se trabaje con más de un matraz, la suspensión celular obtenida en la etapa 4.4 debe transferirse directamente a un tubo de centrífuga antes de añadir SBTI a un segundo matraz. En el procedimiento, se procesan simultáneamente un máximo de cinco frascos.
5. Centrifugar los tubos durante 7 min a 230 x g en RT.
6. Resuspender las células en 6 ml de medio cBD y contar las células usando un hemocitómetro o contador celular automatizado. Realice un recuento de células vivas/muertas, por ejemplo, agregando azul de tripano en una proporción de 1:1, o utilizando otro procedimiento de conteo de células vivas/muertas.
7. Retire la solución de recubrimiento de los insertos de cultivo celular.
8. Diluir la suspensión celular, generada en el paso 4.6, con medio de cBD suplementado con 1 nM EC 23 a una concentración de 80.000 células por ml, y añadir 0,5 ml en la parte superior de la membrana en el inserto. Agregue 1.5 ml de medio de cBD suplementado con 1 nM EC 23 al pocillo debajo del inserto.
9. Cambie el medio con medio cBD suplementado con 1 nM EC 23 tres veces por semana hasta que los cultivos estén listos para la exposición al aire (es decir, 2 días después de alcanzar el 100% de confluencia). Cada vez, se agregan 0,5 ml del medio dentro del inserto (en las celdas) y se agregan 1,5 ml al compartimiento inferior (el pozo).
   NOTA: En general, la capa celular alcanza el 100% de confluencia aproximadamente 5 días después de sembrar los PBEC en los insertos. Sobre la base de la inspección visual de la confluencia de las células, se toma la decisión de transferir las células a la etapa ALI 2 días después.
10. Cuando las células estén listas para la transferencia al ALI (es decir, 2 días después de alcanzar el 100% de confluencia), retire el medio de los insertos y del pozo, no agregue un nuevo medio dentro del inserto y agregue un nuevo medio (1 ml de medio cBD suplementado con 50 nM EC 23) solo al pozo. Cambie el medio en los pozos tres veces por semana.
11. Para eliminar el exceso de moco y restos celulares, añadir suavemente 200 μL de PBS caliente en el lado apical de la capa celular dentro del inserto (preferiblemente a través del lado del inserto y no pipeteando directamente sobre las células) e incubar durante 10 min en una incubadora de cultivo celular a 37 °C. Luego, aspire el PBS para eliminar el exceso de moco y desechos celulares.
    NOTA: A partir de este punto en adelante (inicio del cultivo de ALI), antes de cambiar el medio del compartimiento inferior, lave el lado apical de las células con PBS cada vez.
12. Cultive las células en el ALI durante un mínimo de 2 semanas para asegurarse de que todos los tipos de células principales estén representados.

5. Establecimiento de un cultivo ALI-PBEC a partir de una población mixta de donantes

1. Utilice células de hasta cinco donantes individuales para iniciar cultivos PBEC de una población mixta.
2. Mezcle un número igual de células por donante utilizando las células generadas en el paso 4.7 para alcanzar un total de 150.000 células por inserto (es decir, 30.000 células por donante cuando se utilizan cinco donantes). Esto asegurará que la proliferación en el inserto se mantenga al mínimo y que el mismo número de células de los donantes individuales estén presentes en el cultivo.
3. Continuar con el cultivo ALI-PBEC como se describe en los pasos 4.9-4.12.

6. Control de calidad de la cultura ALI-PBEC

1. Monitorización de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) durante el cultivo celular
   NOTA: La medición de la resistencia eléctrica, basada en el uso de un voltohmímetro, se puede realizar en cualquier momento durante el cultivo ALI-PBEC y se realiza cada vez de acuerdo con el mismo protocolo en las mismas condiciones, ya que la medición de la resistencia eléctrica está influenciada por varias variables, incluida la posición del electrodo, la temperatura, el medio y el manejo. TEER se puede calcular utilizando la resistencia eléctrica medida aplicando la siguiente fórmula basada en la ley de Ohm: , donde R_m es la resistencia eléctrica medida, R_b es la resistencia eléctrica de referencia de un inserto sin recubrimiento y células, y SA es el área superficial de la membrana del inserto¹⁷.
   1. Agregue suavemente 200 μL de PBS caliente al lado apical de la capa celular para eliminar el moco y los desechos en las células. Incubar el inserto durante 10 minutos en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y retirar de nuevo el PBS.
   2. Agregue suavemente 700 μL de PBS caliente al lado apical de la capa celular e incube el inserto durante 10 minutos a RT para permitir la estabilización de la temperatura para las mediciones.
   3. Calibre el voltohmímetro usando la resistencia de prueba de 1,000 Ω, configure el voltohmímetro para medir ohmios y use un destornillador para ajustar el tornillo de calibración "R ADJ" hasta que se ajuste a 1,000 Ω.
   4. Enjuague el electrodo moviéndolo hacia arriba y hacia abajo varias veces en agua estéril (RT) y luego en PBS estéril (RT).
   5. Mida la resistencia eléctrica de la capa celular en los insertos. Con este fin, coloque el electrodo en posición vertical en el pozo con el brazo largo del electrodo tocando el fondo de la placa. De esta manera, el brazo corto está por encima de la capa celular dentro del inserto. Lea el valor que se muestra en el voltohmímetro.
      NOTA: El valor mostrado no se estabilizará completamente; Lea el valor en el momento en que el valor es intermitente.
   6. Entre mediciones, limpie el electrodo moviéndolo hacia arriba y hacia abajo varias veces en PBS estéril (RT).
   7. Limpie el electrodo cuando terminen las mediciones moviéndolo hacia arriba y hacia abajo varias veces en agua estéril (RT), PBS estéril (RT) y etanol al 70% (RT). Guarde el electrodo seco.
   8. Realice una medición de referencia de un inserto (sin recubrimiento) y celdas agregando 700 μL de PBS caliente dentro del inserto y 1 ml de PBS caliente al pocillo y midiendo la resistencia eléctrica junto con los otros insertos.
2. Evaluación de la composición celular del cultivo ALI-PBEC
   1. Durante la etapa ALI, verifique la diferenciación evaluando visualmente los cilios que vencen. Estos se pueden observar a través de microscopía estándar de campo claro tan pronto como 9 días después de la exposición al aire en el lado apical de las células.
      NOTA: Los cilios batidos son mejor visibles directamente después de lavar la superficie apical. Las células caliciformes producen moco y, por lo tanto, la presencia de moco, como se observa durante el lavado de la superficie apical, es un signo de que se forman células caliciformes. Sin embargo, el nivel de células caliciformes y la cantidad de moco producido depende en gran medida del donante. La presencia de moco se puede ver al aspirar el PBS después de lavar la superficie apical de la capa celular en el inserto; en este caso, el PBS aspirado es más viscoso, y se pueden observar hilos de moco mientras se aspira.
   2. La evaluación de la composición celular mediante inmunotinciones y microscopía fluorescente o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), o el análisis de la expresión génica mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) proporciona información importante sobre el estado de diferenciación del cultivo, pero su descripción está más allá del alcance de esta contribución.

Figura 1: Descripción esquemática del procedimiento de aislamiento, expansión y cultivo de células epiteliales bronquiales primarias . (A) El tejido pulmonar se obtiene durante la cirugía de resección del cáncer y el patólogo extirpa el tejido del anillo bronquial que es macroscópicamente normal y libre de tumor. (B) El anillo bronquial se limpia y se expone a un tratamiento enzimático para desprender y disociar la capa celular. (C) La suspensión celular recuperada se lava y las celdas se distribuyen en pocillos de una placa de 6 pocillos para su expansión. (D) Tras la expansión suficiente de las células aisladas en c-KSFM con Primocina, las capas celulares se disocian por tripsinización y las células se resuspenden en medio de congelación para la criopreservación. Cuando es necesario, las células criopreservadas se descongelan y se expanden nuevamente usando c-KSFM con penicilina/estreptomicina en matraces de cultivo celular. Después de la expansión, se siembran en medio cBD en insertos de cultivo celular; (e bis) El cultivo de ALI-PBEC tiene lugar en dos etapas principales: la etapa sumergida en medio cBD suplementado con 1 nM EC 23 hasta que las células alcancen la confluencia completa, seguida de la eliminación del medio apical y el cultivo en el ALI para permitir la diferenciación; en esta fase ALI, las células se cultivan en medio cBD suplementado con 50 nM EC 23. (Eb) Representación gráfica de las células basales que cubren el inserto durante el cultivo sumergido. (CE) Representación gráfica de la capa celular epitelial diferenciada obtenida tras el cultivo en el ALI en presencia de concentraciones aumentadas de EC 23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Expansión mediante cultivo sumergido
Usando el método presentado aquí, se puede obtener un promedio de ocho crioviales con 400,000 células / criovial de una placa de 6 pocillos para el almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido (Figura 2A). Para lograr esto, los PBEC aislados se cultivan en placas de 6 pocillos durante un mínimo de 7 días y un máximo de 14 días (Figura 2B) en presencia de Primocina para excluir la contaminación microbiana (especialmente micoplasma). La Figura 2A,B proporciona información sobre el número de células obtenidas y el tiempo de cultivo requerido entre diferentes aislamientos de varios donantes. Antes de cosechar las células por tripsinización para su almacenamiento en nitrógeno líquido, la confluencia debe ser superior al 80%. Si esto no se logra dentro de los 14 días, las células no deben ser criopreservadas. Es importante destacar que, al recolectar para almacenamiento y paso, la confluencia de la capa celular no debe exceder ~ 95% (Figura 2C). Después del almacenamiento en nitrógeno líquido, las células pueden descongelarse y cultivarse para su expansión hasta que se obtenga un número suficiente de células para cultivos ALU. El medio utilizado para la expansión de las células en esta etapa es c-KSFM, similar al del cultivo inicial después de la cosecha del anillo bronquial18. Sin embargo, no hay necesidad de Primocina en esta etapa, porque el riesgo de contaminación microbiana adicional originada en el tejido pulmonar está ausente y, por lo tanto, Primocina puede cambiarse por penicilina/estreptomicina. Este medio favorece a las células epiteliales sobre los fibroblastos y, por lo tanto, evita un posible crecimiento excesivo del cultivo al proliferar más rápidamentelos fibroblastos 19,20,21. Utilizando el medio c-KSFM, las células se extienden en el matraz y no se conectan entre sí, lo que es marcadamente diferente de la morfología de las células cultivadas sumergidas en esta etapa en medio cBD (Figura 2D, E). Después de 5 o 6 días de cultivo de las células descongeladas en un matraz T75, la capa celular debe ser 80% -95% confluente, lo que se traduce en aproximadamente 3 x 106 células en total (Figura 2F). A partir de esto, se pueden generar aproximadamente 75 insertos (tamaño de placa de 12 pocillos) para el cultivo ALI.

El método de aislamiento y cultivo descrito en esta contribución también se puede adaptar para su uso con biopsias bronquiales o cepillos bronquiales como material de partida.

Figura 2: Expansión basocelular antes y después de la criopreservación. Las células se aislaron de acuerdo con el protocolo descrito y se cultivaron utilizando c-KSFM. Se monitoreó el número de células generadas por donante, los recuentos de células vivas se realizaron utilizando un contador celular automatizado (A) al recolectar el paso 0 (P0) células de las placas de 6 pocillos (paso 2 del protocolo), n = 123 donantes, el recuento de células se presentó como el número de células cosechadas por pocillo; Cada punto representa un donante y la mediana se indica mediante una barra horizontal. (B) Como parte del control de calidad, el tiempo requerido por las células P0 para alcanzar una confluencia del 80% al 90% en las placas de 6 pocillos se monitorizó y se mostró como días después de comenzar el cultivo sumergido en c-KSFM (n = 127 donantes diferentes). Cada donante individual se indica con un punto, todos los puntos pertenecientes a 1 día se fusionan en una línea; cuanto más amplia es la línea, más donantes representa; La mediana del número de días que las células están en cultivo se indica mediante una barra horizontal más delgada. (C) Imagen representativa de campo claro de células P0 cultivadas sumergidas en c-KSFM en el momento en que las células fueron cosechadas para la criopreservación a largo plazo. (D) Imagen representativa de campo claro de células P1 cultivadas sumergidas en c-KSFM en el momento en que las células fueron cosechadas y transferidas a insertos y (E) células P1 cultivadas sumergidas en medio cBD. (F) El número de células vivas generadas por donante se controló utilizando un contador de células automatizado al extraer células P1 del matraz T75 (sección 4 del protocolo), n = 63 donantes diferentes; el recuento de células se presenta como el número de células por matraz T75, cada donante se indica con un punto y el recuento medio de células se indica con una barra horizontal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cultivo de interfaz aire-líquido (ALI)
A los 7 días de comenzar el cultivo ALI, se mide la resistencia eléctrica de la capa celular y debe ser superior a 300 Ω (Figura 3A); Si esto no se logra, el cultivo se considera fallido debido a una posible falta de formación de unión estrecha. Se recomienda excluir la posibilidad de obtener valores bajos de TEER causados por daños en la capa epitelial en insertos individuales como resultado, por ejemplo, del daño a la capa celular durante el lavado y la aspiración. Esto se puede verificar mediante una inspección microscópica visual de los insertos de cultivo. En nuestra experiencia, la variabilidad entre donantes en la resistencia eléctrica puede ser significativa (Figura 3B), que también se relata en la literatura14, y como se observa también está marcadamente influenciada por el origen del medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) utilizado (Figura 3C).

Figura 3: Resistencia eléctrica transepitelial como control de calidad de cultivos ALI-PBEC. Se aislaron y ampliaron los PBEC, y se establecieron cultivos ALI-PBEC bien diferenciados. En varios momentos durante el cultivo, se midió la resistencia eléctrica y, posteriormente, se calculó el TEER (Ω · cm2). (A) La resistencia eléctrica se midió en el transcurso de 14 días después de la LPA. n = 4 donantes diferentes. Los datos se representan como el valor medio ± desviación estándar (DE). (B) Como parte del control de calidad del cultivo celular ALI-PBEC, la resistencia eléctrica se midió en el día 7 (n = 50) y el día 14 después de ALI (n = 25); cada punto representa un donante y la mediana del TEER (Ω·cm2) se indica mediante una barra horizontal. La significancia de los datos se evaluó mediante una prueba no paramétrica de Mann-Whitney, y no se encontraron diferencias significativas. (C) Se probaron medios de tres proveedores diferentes de DMEM para evaluar la influencia en la formación de TEER. n = 4 donantes diferentes; los valores medios se representan ± DE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Mientras se establece un cultivo ALI-PBEC bien diferenciado, desde el inicio de la exposición al aire, la concentración de AR aumenta22. De esta manera, las células cambian de proliferación a diferenciación mucociliar, que es visible tan pronto como 9 días (dependiente del donante) después de la exposición al aire utilizando microscopía de campo claro. El movimiento de los primeros cilios es visible en este punto, y algo antes cuando se basa en la expresión génica de marcadores de células luminales diferenciadas23 (Figura 4).

Como se describe en el protocolo, la producción de moco también se puede observar al enjuagar la superficie apical durante el cambio de medio. La AR es muy sensible a la luz, lo que conduce a una actividad muy variable en la misma concentración de stock. Por esta razón, la AR se sustituye por el análogo sintético de la AR EC 23 y se utiliza en la misma concentración, con resultados similares a los determinados experimentalmente. Por esta razón y para evitar cambiar el procedimiento, la concentración EC 23 seleccionada se mantuvo igual a la concentración de AR (es decir, 50 nM) utilizada anteriormente24,25 (Figura 5). La Figura 5A muestra los valores de TEER alcanzados cuando se utilizan diferentes concentraciones de EC 23, mostrando un TEER máximo a 50 nM dentro de este rango de concentraciones probadas. Los resultados mostrados en la Figura 5B confirman que la expresión génica de los marcadores para células ciliadas y caliciformes es similar cuando se utiliza 50 nM EC 23 o AR. La EC 23 también se requiere durante el cultivo en la etapa sumergida (aunque a una concentración mucho menor), ya que omitirla en esta etapa sumergida y solo agregarla en la etapa ALI da como resultado un cultivo que nunca alcanza la confluencia completa. El tiempo necesario para generar un cultivo ALI-PBEC bien diferenciado con actividad de batido ciliar visible y producción de moco es de alrededor de 14 días, por lo que la mayoría de los experimentos se inician entre cultivos ALI de 14 a 21 días (Figura 4). Todos los principales tipos de células diferentes (células basales, ciliadas, caliciformes y clubes) se observan a los 14 días de cultivo de ALI, aunque los niveles de expresión son altamente dependientes del donante. Esto se demuestra mediante la evaluación de la expresión génica de TP63, FOXJ1, MUC5AC y SCGB1A1 por RT-qPCR, o expresión de proteínas utilizando anticuerpos dirigidos contra p63, α-tubulina, Muc5AC y CC-16 por tinción de fluorescencia inmune (IF), para detectar marcadores de células basales, ciliadas, caliciformes y clubes, respectivamente25,26. Sin embargo, mientras que 14-21 días pueden considerarse como una regla general para la mayoría de los experimentos, para experimentos seleccionados, se puede considerar una mayor duración de la diferenciación, como se encontró para el metabolismo xenobiótico, la infección por SARS-CoV-2 y la evaluación del aclaramiento mucociliar27,28,29.

Figura 4: Cultivo de interfaz aire-líquido (ALI). Se aislaron y ampliaron los PBEC, y se establecieron cultivos ALI-PBEC bien diferenciados. Los cultivos de ALI-PBEC se monitorizaron en el transcurso de 14 días después de la LPA. Los cultivos celulares se lisaron para el aislamiento de ARN en los días 0, 7 y 14 post-ALI. Se muestran los datos de dos donantes diferentes, cada punto representa un donante individual monitoreado a lo largo del tiempo, y la mediana se indica con una barra horizontal. La expresión génica de los marcadores basales, ciliados, caliciformes y de células club (TP63, FOXJ1, MUC5B y SCGB1A1, respectivamente) se midió mediante qPCR y se normalizó para la expresión génica de RPL13A y ATP5B (ver referencia 23 para más detalles). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Comparación del ácido retinoico (AR) y su análogo sintético EC 23. Se aislaron y ampliaron los PBEC, y se establecieron cultivos ALI-PBEC bien diferenciados. Al inicio de la exposición al aire de los cultivos PBEC, la AR (50 nM) fue reemplazada por varias concentraciones de EC 23. (A ) La resistencia eléctrica se midió en el día 14 post-ALI y posteriormente se calculó el TEER (Ω·cm 2), n =2 donantes, las barras representan el valor medio ± DE. ( B) En el día 14 post-ALI, los cultivos celulares se lisaron para el aislamiento de ARN y el posterior análisis de expresión génica de marcadores celulares para células respectivamente ciliadas y caliciformes (FOXJ1, MUC5AC) utilizando qPCR, y normalizado para RPL13A (n = 3 donantes). Se muestra un aumento de pliegues contra ALI-PBEC cultivado con 50 nM RA y representado como el valor medio ± DE. (Ver referencia 23 para más detalles) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En los últimos años, se ha examinado el rendimiento de productos alternativos en el sistema de cultivo, como los medios y los plásticos de cultivo. Hubo varias razones para tales evaluaciones, incluidos los cambios en la composición del medio por parte de los fabricantes, la introducción de nuevos medios, así como la escasez de productos durante la pandemia de COVID-19 (2020-2022). Se observó que productos similares de diferentes proveedores dan como resultado cultivos de células epiteliales diferenciadas basadas en la evaluación de marcadores de tipos de células epiteliales, aunque la composición celular final puede variar sustancialmente (Figura 6A), mientras que las diferencias en TEER fueron menos pronunciadas (Figura 6B). Por otro lado, el medio de diferentes proveedores dio lugar a diferencias sustanciales en la composición celular; cuando se utilizaron insertos de diferentes marcas, tales diferencias fueron limitadas (Figura 6C). En particular, cuando se utilizó el medio de cultivo de células epiteliales de las vías respiratorias PneumaCult de STEMCELL Technologies, se observó una morfología diferente y una formación más rápida de la actividad ciliar visible. Además de estas observaciones, también se observó una diferencia en los valores de TEER y una diferencia en la composición celular del ALI-PBEC en comparación con el medio cBD (Figura 6D).

Figura 6: Comparación de diferentes proveedores de medio celular epitelial e insertos de cultivo celular. Se aislaron los PBEC, se expandieron y se establecieron cultivos ALI-PBEC bien diferenciados. (A) Los ALI-PBEC se cultivaron durante 14 días, y luego las capas celulares se lisaron para el aislamiento de ARN. La expresión génica de los marcadores basales, ciliados, caliciformes y de células club (TP63, FOXJ1, MUC5AC y SCGB1A1, respectivamente) se midió mediante qPCR y se normalizó para RPL13A y ATP5B. n = 2 donantes; las barras representan el valor medio ± DE. (B) En el transcurso de 9 días después de la ALI, se midió la resistencia eléctrica y, posteriormente, se calculó el TEER (Ω·cm2). n = 3 donantes diferentes; Los valores medios se representan ± SD. (C) Los ALI-PBEC se cultivaron durante 14 días utilizando insertos de cultivo celular comprados a tres proveedores diferentes, y luego las capas celulares se lisaron para el aislamiento de ARN. La expresión génica de los marcadores ciliados, caliciformes y de células club (FOXJ1, MUC5AC y SCGB1A1, respectivamente) se midió mediante qPCR y se normalizó para RPL13A. n = 18 donantes diferentes, las barras representan el valor medio ± DE. Los datos se probaron para determinar su importancia mediante una prueba de Kruskal-Wallis no paramétrica ANOVA unidireccional y no se encontraron diferencias significativas. (D) Los ALI-PBEC se cultivaron en medio cBD o en medio PneumaCult (tecnologías STEMMCELL) durante 14 días después de ALI, y luego las capas celulares se lisaron para el aislamiento de ARN. La expresión génica de los marcadores basales, ciliados, caliciformes y de células club (TP63, FOXJ1, MUC5B y SCGB1A1, respectivamente) se midió mediante qPCR y se normalizó para RPL13A (las barras representan el valor medio ± DE), y la resistencia eléctrica se midió en los días 5 y 12 post-ALI y se utilizó para calcular el TEER (Ω·cm2). n = 2; el valor medio se representa ± SD (consulte la referencia 23 para obtener más detalles). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla complementaria 1: Composición de las soluciones y medios utilizados en el protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses relevantes.