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Ferritinofagia: evaluación de la degradación selectiva del hierro por autofagia en fibroblastos humanos

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DOI:

10.3791/65110

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23 de febrero de 2024

 , 
1Interfaculty Institute of Cell Biology, Eberhard Karls University Tübingen

En este artículo

Resumen

Este protocolo proporciona instrucciones detalladas para realizar evaluaciones de ferritinofagia de alto rendimiento basadas en inmunofluorescencia en fibroblastos humanos primarios derivados de la piel.

Resumen

Las mutaciones en el gen de autofagia WDR45/WIPI4 son la causa de la neurodegeneración asociada a la hélice beta (BPAN), un subtipo de enfermedades humanas conocidas como neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro (NBIA) debido a la presencia de depósitos de hierro en el cerebro de los pacientes. Los niveles intracelulares de hierro están estrechamente regulados por una serie de mecanismos celulares, incluido el mecanismo crítico de la ferritinofagia. Este artículo describe cómo se puede evaluar la ferritinofagia en fibroblastos humanos primarios derivados de la piel. En este protocolo, utilizamos condiciones moduladoras del hierro para inducir o inhibir la ferritinofagia a nivel celular, como la administración de bafilomycina A1 para inhibir la función del lisosoma y los tratamientos con citrato de amonio férrico (FAC) o deferasiox (DFX) para sobrecargar o agotar el hierro, respectivamente. A continuación, estos fibroblastos tratados se someten a imágenes de alto rendimiento y a un análisis de localización cuantitativa basado en CellProfiler de ferritina endógena y marcadores autofagosómicos/lisosomales, en este caso LAMP2. Sobre la base del nivel de ferritina autofagosómica/lisosomal, se pueden sacar conclusiones sobre el nivel de ferritinofagia. Este protocolo se puede utilizar para evaluar la ferritinofagia en fibroblastos primarios derivados de pacientes con BPAN u otros tipos de células de mamíferos.

Introducción

Las proteínas WIPI (WD-repeat interacting with phosphoinositides) son efectores PI3P conservados evolutivamente con funciones distintas en la autofagia1. Las cuatro proteínas WIPI humanas (WIPI1 a WIPI4) se pliegan en hélices de β de siete palas con dos regiones conservadas evolutivamente en las que los aminoácidos homólogos e invariantes se agrupan en sitios opuestos de la hélice. Un sitio está alineado con la región de unión a fosfoinositida en las palas de la hélice 5 y 6. El otro sitio está alineado con la región de interacción proteína-proteína, donde los WIPIs se asocian con distintos miembros de la maquinaria de autofagia o factores reguladores de la autofagia2.

WIPI4 funciona en el control de la regulación de la autofagia impulsada por la energía y en el nivel de control del tamaño del creciente autofagosomanaciente 3. Una mutación en el gen WIPI4 , denominada WDR45, es causante de la neurodegeneración asociada a la hélice beta (BPAN), un subtipo de neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro (NBIA) en pacientes humanos que se caracteriza por un halo de hierro hipointenso en la sustancia negra y el globo pálido4. La presencia de depósitos anormales de hierro en los pacientes con BPAN provoca un daño neuronal que se traduce en encefalopatía, retraso global del desarrollo, convulsiones y, en última instancia, parkinsonismo, demencia y espasticidad5.

La homeostasis del hierro está estrechamente regulada por múltiples mecanismos celulares, y la concentración de hierro citosólico está controlada por los niveles de expresión y la funcionalidad de los transportadores de hierro, los transportadores de hierro y las proteínas de almacenamiento de hierro6 . La concentración de hierro citosólico, a su vez, determina si están involucradas vías de degradación como la ferritinofagia7 o el aclaramiento proteasómico de ferritinaoxidada 8 .

Durante la ferritinofagia, la ferritina es reclutada selectivamente a los autofagosomas por el receptor de carga NCOA4 y dirigida a la degradación lisosomal en respuesta a niveles bajos de hierro intracelular7. Dado el papel de WIPI4 en la regulación del tamaño de las membranas autofagosomales3, es razonable predecir que la pérdida de esta función específica puede afectar al secuestro selectivo de ferritina en los autofagosomas y, por lo tanto, a la ferritinofagia. El estudio de este paso clave en el metabolismo del hierro puede abrir las puertas a opciones terapéuticas para los pacientes con BPAN; Sin embargo, los protocolos comúnmente utilizados para estudiar la ferritinofagia en células humanas solo ahora se están desarrollando.

Este artículo describe un método de alto rendimiento basado en fluorescencia para evaluar la ferritinofagia en células humanas. La aplicación de este ensayo a las células BPAN derivadas de pacientes puede proporcionar información valiosa sobre cómo difiere la ferritinofagia en comparación con las células humanas sanas y puede servir como punto de referencia para comprender los mecanismos moleculares que subyacen a esta rara enfermedad humana.

Protocolo

1. Cultivo y siembra de células primarias

  1. Tome el frasco con células congeladas del tanque de nitrógeno líquido y manténgalo en hielo hasta que llegue a la sala de cultivo celular. En una capucha previamente esterilizada, sostenga el vial en la mano para que la suspensión celular se descongele. Resuspender las células y transferirlas a una placa de cultivo celular de 10 cm con 9 mL de DMEM precalentado con 10% de suero fetal de ternera (FCS) y 1% de penicilina-estreptomicina (P/S). Agitar suavemente para que las células se distribuyan uniformemente en la placa e incubar durante la noche a 37 °C y 5% de CO2
  2. A la mañana siguiente, mire las celdas para confirmar que están unidas. Cambie el medio a DMEM fresco + 10% FCS + 1% P/S, y deje que las células crezcan hasta que alcancen el 80% de confluencia.
  3. Retirar el medio de cultivo, lavar 2 veces con DPBS, añadir 1 mL de tripsina a la placa e incubar a 37 °C y 5% deCO2 durante 10 min. Agregue 9 mL de DMEM + 10% FCS a la placa y vuelva a suspender las células.
  4. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 mL. Determine el recuento de células manualmente utilizando una cámara de Neubauer y diluya la suspensión celular en DMEM + 10% FCS hasta alcanzar una concentración celular de 40.000 células/mL.
  5. En una placa de 96 pocillos con fondo de vidrio, siembre 100 μL/pocillo de la suspensión celular. Incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 16 h.

2. Tratamientos

  1. Prepare los siguientes tratamientos de acuerdo con la Tabla de Materiales: medio de control, medio de control más deferasiox (DFX) para la quelación del hierro, o medio de control más citrato de amonio férrico (FAC) para la carga de hierro. Preparar todos los tratamientos tanto en presencia como en ausencia de un inhibidor lisosomal (bafilomycina A1) para la evaluación del flujo de ferritinofagia.
  2. Retire el medio de cultivo de la placa y reemplácelo con el tratamiento correspondiente (100 μL/pocillo).
  3. Incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 6 h.

3. Fijación y tinción

  1. Aspire el medio de tratamiento y lave 2 veces con DPBS (Tabla de Materiales).
  2. Agregue 100 μL de paraformaldehído al 3,7% (PFA, Tabla de Materiales) por pocillo. Fije las celdas durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
  3. Retire el PFA y lave las celdas 2 veces con PBS/T (Tabla de Materiales).
  4. Bloque en PBS/T que contiene 1% de albúmina sérica bovina (BSA) durante 1 h a 4 °C.
  5. Prepare la mezcla de anticuerpos primarios (Tabla de materiales) en PBS/T (anticuerpo de ferritina 1:50, anticuerpo LAMP2 1:50).
  6. Lave las células 2 veces con PBS/T y aplique 50 μL de la mezcla de anticuerpos por pocillo. Envuelva las placas con parafilm e incube durante la noche a 4 °C.
  7. A la mañana siguiente, prepare la mezcla de anticuerpos secundarios (Tabla de Materiales) (1:200) en PBS/T.
  8. Lave las células 2 veces con PBS/T y aplique 50 μL de la mezcla de anticuerpos secundarios por pocillo. Incubar a 4 °C durante 1 h en la oscuridad.
  9. Prepare 5 μg/μL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Tabla de Materiales) en PBS a temperatura ambiente.
  10. Lave las células 2 veces con PBS/T y añada 100 μL/pocillo de tinción DAPI. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
  11. Lave las celdas 2 veces con PBS y agregue 50 μL de PBS a cada pocillo. Envuelva las placas con parafilm y guárdelas a 4 °C en la oscuridad.

4. Imágenes automatizadas mediante microscopía de barrido láser confocal

  1. Cambie el PBS de la placa por 50 μL de PBS fresco a temperatura ambiente.
  2. Cubra la placa con papel de aluminio y llévela a la sala de microscopía.
  3. Encienda el microscopio de escaneo láser confocal, coloque un soporte de muestras para placas de 96 pocillos en la mesa del microscopio y seleccione un objetivo apropiado (aquí: 40x). Consulte la Tabla 1 para obtener más detalles.
  4. Ajuste la configuración de imágenes (Tabla 1).
    1. En Smart Setup, seleccione los láseres y filtros, y asígnelos a pistas (pistas 1-3) para obtener una calidad de imagen y una velocidad óptimas (Tabla 1).
    2. Al seleccionar el tipo de experimento, haga clic en Mosaicos para habilitar la opción de seleccionar y guardar las posiciones X,Y determinadas en la placa.
    3. En el módulo Configuración de imágenes , visualice los canales de adquisición, las pistas asignadas a ellos y sus longitudes de onda de excitación y emisión (Tabla 1).
    4. En el módulo Modo de adquisición, seleccione lo siguiente: Velocidad de escaneo: 6; Dirección: bidireccional; Promedio: 2x; Bits por píxel: 8.
    5. En el módulo Canales , ajuste la potencia del láser, el estenopeico y la ganancia maestra para cada canal individualmente (Tabla 2). Ajuste estos parámetros para lograr imágenes correctamente expuestas sin sobresaturarlas.
    6. Haga clic en el módulo Estrategia de enfoque .
      1. Seleccione Combinar enfoque automático de software y enfoque definido.
      2. En Canal de referencia y desplazamientos, seleccione el canal más estable/brillante como referencia (normalmente DAPI o 488 nm).
      3. En Repeticiones y frecuencia de eventos de estabilización, seleccione Estándar.
    7. En el módulo Enfoque automático de software , seleccione lo siguiente: Modo | Intensidad; Buscar | Inteligente; Muestreo | Multa; Rango relativo.
    8. Haga clic en el módulo Mosaicos .
      1. Seleccione Posiciones | posiciones individuales.
      2. En Configuración avanzada, navegue por la placa, identifique una posición para la obtención de imágenes y haga clic en el botón + en la pestaña Configuración de posición .
      3. Etiquete cada posición con información adicional que se registrará en los metadatos de la imagen. Para ello, abra la pestaña Propiedades , haga clic en el icono de la rueda junto al menú desplegable Categoría y haga clic en Nuevo para abrir un nuevo cuadro de diálogo donde se introducirá el nuevo nombre de la categoría. Para asignar una categoría a una posición determinada, seleccione la posición, haga clic en la pestaña Propiedades , vaya al menú desplegable Categorías y seleccione la etiqueta correspondiente.
        NOTA: Se recomienda crear una categoría para cada tratamiento para etiquetar cada posición con el tratamiento al que se sometieron las células.
      4. En Portador de muestras, seleccione Fondo de vidrio Multiwell 96-Cellvis #0. Haga clic en Calibrar para calibrar el microscopio con la superficie de la placa. Elija entre calibración de 1 punto o 7 puntos en función de las especificaciones del sistema.
      5. En Opciones, seleccione una superposición de mosaicos del 10%. En Viajar en regiones de mosaicos, seleccione Peine. Marque lo siguiente: usar la velocidad de la etapa desde el control de etapa, usar la aceleración de la etapa desde el control de etapa y la pirámide de imágenes durante la adquisición.
  5. Ejecute la adquisición de imágenes y guarde los resultados de la imagen (archivos czi) y los metadatos de la imagen (archivos csv) en un disco duro portátil.
  6. Exporte las imágenes como archivos TIFF.

5. Análisis de imágenes de alto rendimiento

  1. Cree un archivo de hoja de cálculo de metadatos independiente con las siguientes columnas: Posición, Pozo, Condición, Serie y Conjunto. Los datos apropiados para rellenar estas columnas se recuperan del archivo de metadatos original que proviene de la microscopía de barrido láser confocal.
  2. Descargue el software de código abierto CellProfiler 4.2.4 (https://cellprofiler.org/previous-releases).
  3. Inicie CellProfiler 4.2.4 haciendo doble clic e importe la canalización de CellProfiler (archivo complementario 1) arrastrando y soltando.
    NOTA: A continuación, encontrará los pasos para compilar la canalización de CellProfiler (Archivo complementario 1) para el reconocimiento automatizado de fibroblastos mediante tinción DAPI (Módulo 1, reconocimiento de núcleos, consulte la Tabla 2) y fluorescencia de fondo en células individuales derivadas de AF488 (Módulo 2, reconocimiento celular, consulte la Tabla 2). El reconocimiento de puntos (denominados objetos) está determinado por el tamaño de los puntos y la intensidad de fluorescencia de los puntos sobre el fondo (Módulo 3, reconocimiento de puntos, véase la Tabla 2). Finalmente, de acuerdo con los límites de las celdas, los puntos reconocidos por el software se asignan a las celdas correspondientes (Asignar relaciones). Anteriormente se ha publicado una descripción detallada de cómo implementar una canalización de CellProfiler para estudios de autofagia9. Además, la tabla 2 contiene la configuración de CellProfiler utilizada en este estudio. Además, el archivo complementario 2 muestra la canalización de CellProfiler (archivo complementario 1) con capturas de pantalla tomadas en orden consecutivo y que hacen referencia a los módulos detallados en la tabla 2.
  4. Antes de adaptar la canalización de CellProfiler (archivo complementario 1), arrastre y suelte archivos de imagen .czi individuales o una carpeta que contenga varios archivos de imagen .czi en el módulo Imagen .
  5. Personalice la canalización de reconocimiento de imágenes. En el módulo Nombres y tipos , sustituya el código c1-c3 por un código que permita al software identificar y ordenar las imágenes de un solo canal que se van a analizar.
  6. Ajuste la configuración de la canalización para los módulos IdentifyPrimaryObjects e IdentifySecondaryObjects optimizando las entradas numéricas de los módulos. Los valores utilizados en este estudio se presentan en la Tabla 2.
  7. Para realizar un seguimiento de los ajustes, seleccione la opción Modo de prueba haciendo clic en el botón Iniciar modo de prueba . A continuación, haga clic en el botón Paso entre los módulos. Espere a que aparezcan ventanas emergentes (la imagen de entrada original, los contornos de reconocimiento dibujados sobre la imagen original y el resultado del análisis) que muestren cómo se analizaría una imagen con la configuración que se acaba de introducir.
  8. Una vez optimizada la canalización, finalice el modo de prueba. Ejecute el análisis activando el modo de prueba de salida, seguido de clic en el botón Analizar imágenes .
  9. Una vez completado el análisis, compruebe la precisión de la detección de celdas y puntos comparando las imágenes de entrada con las salidas de superposición (límites de celda, puntuación) generadas por CellProfiler. Si no es satisfactorio, ajuste los valores numéricos en los diferentes módulos (Tabla 2) hasta que el resultado del análisis sea lo suficientemente preciso.

6. Análisis de datos

  1. Después de ejecutar el análisis, espere a que el software cree un conjunto de archivos de texto tabular con los resultados. Si usa la canalización CellProfiler proporcionada (archivo complementario 1), busque los siguientes archivos de salida:
    1. El archivo CellProfilerOutputCells , que enumera el número de imagen asignado por el software, el número de celda asignado a celdas individuales, el nombre del archivo original y la ruta que indica dónde se almacenan los archivos, el número de puntos (ferritina, LAMP2) por celda y el área media de puntos (ferritina, LAMP2) por celda.
    2. El archivo CellProfilerOutputExperiment , que proporciona información sobre los detalles técnicos relacionados con el experimento (por ejemplo, la versión del software, los canales de imagen, las etiquetas de metadatos).
  2. Abra estos archivos como hojas de cálculo.
  3. Proceda a realizar el análisis estadístico de los recuentos de puntos y los números de colocalización de puntos utilizando el software de estadísticas preferido (Tabla de Materiales).

Resultados

Se prepararon fibroblastos primarios derivados de la piel humana (F-CO-60) de donantes sanos (Figura 1A) para las evaluaciones de ferritinofagia utilizando el tratamiento con baflomycin A1 seguido de inmunotinción de ferritina endógena y LAMP2, análisis de imágenes automatizado y análisis basado en CellProfiler (Figura 1B).

La colocalización de la ferritina endógena y de la LAMP2 aumentó tras el bloqueo de la degradación lisosomal de la ferritina mediante la adición de bafilomycina A1, lo que es coherente con su capacidad para inhibir las enzimas V-ATPasa lisosomales y, por tanto, bloquear la ferritinofagia7 (Figura 2). Además, se muestran como ejemplo el reconocimiento celular basado en software, así como el reconocimiento de ferritina y LAMP2 (Figura 2).

En este sentido, debe tenerse en cuenta que la cartera de productos de CellProfiler descrita aquí es extremadamente versátil y se puede adaptar a lecturas adicionales y/o alternativas, como para evaluar los efectos de ciertas mutaciones de BPAN en el crecimiento celular, las mitocondrias u otros orgánulos en el contexto de sistemas funcionales de marcadores unicelulares.

figure-results-1
Figura 1: Resumen experimental. Representación gráfica de (A) el proceso de ferritinofagia y (B) el flujo de trabajo experimental para evaluar la ferritinofagia en fibroblastos humanos primarios derivados de la piel, tal y como se describe en este protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Imágenes representativas. Los fibroblastos humanos primarios derivados de la piel en medio control (condiciones de alimentación) en (A) ausencia o (B) presencia de bafilomycina A1 se sometieron a un análisis de inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos anti-ferritina y anti-LAMP2, mientras que los núcleos celulares se tiñeron con DAPI. Se presentan ejemplos de imágenes de fluorescencia adquiridas con la automatización de la microscopía de barrido láser confocal (barras de escala: 10 μm). Se observaron cambios en la abundancia y colocalización de ferritina y LAMP2 tras la inhibición lisosomal tras la administración de bafilomycin A1. También se muestra el análisis basado en CellProfiler, que muestra las superposiciones de imágenes derivadas del software de reconocimiento celular (púrpura), núcleos (azul), ferritina (verde), LAMP2 (rojo) y puncta de ferritina/LAMP2 (amarillo) de colocalización. (C) Secciones de imagen ampliadas (barra de escala = 10 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Configuración de la microscopía confocal de barrido láser utilizada en este estudio. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Configuración numérica de CellProfiler utilizada en este estudio. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 1: La canalización de CellProfiler utilizada en este estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Visualización de la canalización de CellProfiler (consulte el archivo complementario 1) con capturas de pantalla tomadas en orden consecutivo (consulte la tabla 2). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este método, que utiliza microscopía de fluorescencia automatizada combinada con análisis de imágenes basado en CellProfilerde acceso abierto 9 para evaluar la localización intracelular de factores clave de ferritinofagia, fue diseñado para proporcionar información valiosa sobre la eficacia del aclaramiento de ferritina lisosomal a través de la autofagia selectiva, conocida como ferritinofagia7. Este protocolo permite el manejo de grandes conjuntos de muestras con múltiples líneas celulares y tratamientos simultáneamente y la evaluación de las lecturas deseadas, como los números de ferritina puncta y los números de ferritina puncta que colocalizan con LAMP2, que es un marcador lisosomal típico para evaluar el flujo de ferritinofagia. Sin embargo, debe enfatizarse aquí que el análisis de imágenes preciso y automatizado depende de la calidad de la imagen, que, a su vez, depende de la especificidad del anticuerpo y de la imagen óptima. Por lo tanto, el análisis de imágenes basado en software solo debe realizarse con imágenes de alta calidad.

La modulación de los niveles de hierro en las células puede proporcionar información valiosa sobre los mecanismos que se activan para regular la homeostasis del hierro en el contexto de la enfermedad. En este artículo se describe un método para estudiar las enfermedades causadas por el BPAN en células derivadas de pacientes tratadas con agentes quelantes y cargadores de hierro. Deferasiox (DFX) es un conocido quelante de hierro utilizado ampliamente en el campo10. Tras la aplicación, atrapa el hierro libre en el citoplasma y desencadena una respuesta celular a la inanición de hierro. Dado que el objetivo de este estudio era evaluar la ferritinofagia, privar a las células de hierro fue una forma directa de promover la degradación de la ferritina a través de la autofagia como mecanismo de compensación para reponer la reserva celular de hierro. El citrato de amonio férrico (FAC), por el contrario, se utiliza para cargar células con hierro. Las células activan la síntesis de ferritina como respuesta a concentraciones excesivas y, por lo tanto, tóxicas de hierro citosólico11. Por lo tanto, el citrato de amonio férrico promueve la síntesis de ferritina y el atrapamiento de hierro dentro de los heteropolímeros de ferritina, que pueden, a su vez, activar la ferritinofagia.

Para estudiar el flujo ferritinofágico, en este protocolo, teñimos selectivamente a los actores clave en el proceso, la ferritina y los lisosomas (aquí marcados por LAMP2), y evaluamos su colocalización. Un alto porcentaje de puntos colocalizadores es indicativo de una degradación lisosomal efectiva de la ferritina. Para maximizar la información obtenida de dichos experimentos, se pueden utilizar colorantes adicionales o anticuerpos marcadores.

Cabe destacar que existen desafíos técnicos inherentes a este método. Los fibroblastos primarios derivados de diferentes donantes humanos pueden proliferar y crecer de manera diferente in vitro. Por lo tanto, para obtener resultados comparables, se deben sembrar diferentes celdas en el mismo pasaje. Por lo tanto, es aconsejable realizar un experimento de prueba antes de proceder con este protocolo para examinar los tiempos de duplicación de las células o líneas celulares que se van a utilizar.

Este método no se limita al estudio de la ferritinofagia; Simplemente cambiando los tratamientos y los anticuerpos utilizados, se puede reutilizar para evaluar otras vías de autofagia selectiva; por ejemplo, la mitofagia se puede examinar mediante el uso de CCCP como inductor del estrés mitocondrial y anticuerpos optineurina, LC3 y LAMP2 para la tinción12.

En general, la combinación de la adquisición automatizada de imágenes y el análisis CellProfiler constituye una poderosa herramienta para la evaluación funcional de alto rendimiento de fibroblastos humanos individuales. Esto es especialmente relevante para el estudio de enfermedades humanas, para las que el análisis y la comparación de grandes cohortes de células derivadas de pacientes y células sanas derivadas de donantes son de gran interés.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) Project-ID 259130777 - SFB 1177 (proyecto E03). La Figura 1 se creó utilizando BioRender.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
la piel Biopsia de piel, donante humano sano, Biobanco Clínica Universitaria Tü bingen, Aprobación ética 389/2019BO2F-CO-60, pasaje 9
Tratamientos de cultivo celularConcentración final (compuesto)
Medio de controlDMEM 10%FCS(solo DMSO)
Medio de control + bafilomicina A1DMEM 10%FCS100 nM bafilomycin A1
Medio de control + deferasiox (DFX)DMEM 10%FCS30 y micro; M DFX
Control medio + DFX + bafilomycinA1DMEM 10%FCS30 µ M DFX, 100 nM bafilomicicina A1
Medio de control + citrato de amonio férrico (FAC)DMEM 10%FCS0,05 mg/mL FAC
Medio de control + FAC + bafilomycinA1DMEM 10%FCS0,05 mg/mL FAC, 100 nM bafilomicina A1
Material
albúmina [BSA] Fracción VAppliChemA1391
Alexa 488 cabra a-conejoLife TechnologiesA-11008
Alexa 546 cabra a-ratónLife TechnologiesA-11003
Bafilomycin A1Sigma Aldrich196000
BioLite Placas de 10 cm tratadas con cultivo celularThermo Scientific130182
DAPIAppliChemA4099
Deferasiox (ICL-670)SelleckchemS1712
DMEM GlutamaxGibco31966
DMSO AppliChemA3672
DPBS sin calcio ni magnesioGibco14190094
Suero fetal bovino (FCS)Gibco10437-028
Citrato de amonio férrico (FAC)MerckF5879
Anti-FERRITINA (Bazo humano)Rockland200-401-090-0100
LAMP2 (H4B4)Santa CruzSc-18822
Paraformaldehído (PFA)Sigma-Aldrich441244
PBS 10x Dulbecco' sAppliChemA0965
PenStrep (1,00U/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina)Life Technologies15140-122
Tripsina-EDTA (0.05%) con rojo de fenolGibco25300
Tween20AppliChemA4974
96 pocillos con fondo de vidrio #0 placas CellvisP96-0-N
Solution
3.7% paraformaldehído (PFA)PFA disuelto en PBS, pH 7.5 
Bafilomycin A1 100 mM stockBafilomycin A1 diluida en DMSO
Citrato de amonio férrico (FAC) 100 mg/mL stockFAC diluido en agua bidestilada esterilizada en autoclave
PBS/TPBS, suplementado con 10% Tween20 
PBS/T + BSAPBS, complementado con 10% Tween20, 1% BSA 
Software
CellProfiler 4.2.4https://cellprofiler.org/
GraphPad PrismDotmatics
Microsoft Excel versión 16.50Microsoft Office Plus 365

Referencias

  1. Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome. Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).
  2. Proikas-Cezanne, T., et al. WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy. Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).
  3. Bakula, D., et al. WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy. Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).
  4. Hayflick, S. J., et al. β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation. Brain. 36, 1708-1717 (2013).
  5. Wilson, J. A. -O., et al. Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration. Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).
  6. Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. Cellular iron metabolism and regulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).
  7. Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy. Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).
  8. Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants. Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).
  9. Schüssele, D. S., et al. Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis. Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).
  10. Goodwin, J. M., et al. Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9. Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).
  11. Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).
  12. Zachari, M., et al. Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform. Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).

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Homeostasis del hierrodegradaci n lisosomal de la ferritinamutaci n de genes de autofagiaim genes de alta resoluci nmicroscop a confocalan lisis con CellProfilerinmunotinci nmarcador LAMP2
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