Presentamos un protocolo para visualizar directamente las actividades metabólicas en células reguladas por aminoácidos utilizando microscopía de dispersión Raman estimulada con sonda de óxido de deuterio (agua pesada D2O) (DO-SRS), que se integra con microscopía de fluorescencia por excitación de dos fotones (2PEF).
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Artículo de método
Imagen química bioortogonal del metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos
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En este artículo
Resumen
Resumen
Los aminoácidos aromáticos esenciales (AAA) son componentes básicos para sintetizar nuevas biomasas en las células y mantener las funciones biológicas normales. Por ejemplo, un suministro abundante de AAA es importante para que las células cancerosas mantengan su rápido crecimiento y división. Con esto, existe una creciente demanda de un enfoque de imagen altamente específico y no invasivo con una preparación mínima de la muestra para visualizar directamente cómo las células aprovechan los AAA para su metabolismo in situ. Aquí, desarrollamos una plataforma de imágenes ópticas que combina el sondeo de óxido de deuterio (D2O) con la dispersión Raman estimulada (DO-SRS) e integra DO-SRS con fluorescencia de excitación de dos fotones (2PEF) en un solo microscopio para visualizar directamente las actividades metabólicas de las células HeLa bajo regulación AAA. En conjunto, la plataforma DO-SRS proporciona una alta resolución espacial y especificidad de proteínas y lípidos recién sintetizados en unidades celulares HeLa individuales. Además, la modalidad 2PEF puede detectar señales de autofluorescencia de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y flavina de forma libre de marcas. El sistema de imágenes descrito aquí es compatible con modelos in vitro e in vivo , lo que es flexible para varios experimentos. El flujo de trabajo general de este protocolo incluye el cultivo celular, la preparación de los medios de cultivo, la sincronización celular, la fijación celular y la obtención de imágenes de muestras con las modalidades DO-SRS y 2PEF.
Introducción
Al ser aminoácidos aromáticos esenciales (AAA), la fenilalanina (Phe) y el triptófano (Tryp) pueden ser absorbidos por el cuerpo humano para sintetizar nuevas moléculas para mantener las funciones biológicas normales1. La Phe es necesaria para la síntesis de proteínas, melanina y tirosina, mientras que Tryp es necesaria para la síntesis de melatonina, serotonina y niacina 2,3. Sin embargo, el consumo excesivo de estos AAA puede aumentar la diana de la vía de la rapamicina (mTOR) en los mamíferos, inhibir la proteína quinasa activada por AMP e interferir con el metabolismo mitocondrial, ....
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Protocolo
1. Preparación de los medios
- Prepare 10 mL de control y exceso de AAA en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 50% de D2O.
- Para el medio de control, mida y mezcle 10 mg de polvo de DMEM con 4,7 ml de agua bidestilada (ddH2O) en un tubo cónico de 15 ml. El polvo de DMEM contiene todos los aminoácidos en concentraciones estándar. Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada. Añadir 4,7 mL deD2O, 0,5 mL de suero fetal bovino (5% FBS) y 0,1 mL de penicilina/estreptomicina (1%). Realice un vórtice completo e invierta el tubo para as....
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Resultados
La adición de un exceso de AAA a concentraciones de 15x a los medios de cultivo celular que contienen D2O al 50% produjo distintas bandas C-D Raman de lípidos y proteínas recién sintetizados en células HeLa (Figura 2B). Los experimentos anteriores se realizaron con diferentes niveles de concentración, como 2x y 5x, y aunque no se presentan los datos, la concentración de 15x produjo las bandas C-D Raman más distintivas de lípidos y proteínas recién sintetizados. Específicamente, al.......
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Discusión
Las imágenes DO-SRS y 2PEF se han aplicado para investigar la dinámica metabólica en varios modelos ex vivo, incluyendo Drosophila y tejidos humanos 21,22,23,24,26,27,33. La modalidad de imagen utilizada en este estudio integra DO-SRS y microscopía 2PEF, que puede superar a otros mé.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos ni otros conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Yajuan Li y Anthony Fung por su apoyo técnico, y al laboratorio Fraley por la línea celular. Agradecemos los fondos iniciales de UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 y Hellman Fellow Award.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pipetas serológicas de 10 mL | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| Tubo de centrífuga cónico de 15 ml | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16 % de formaldehído, sin metanol | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| placa | de 24 pocillosFisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| Filtro de jeringa de 25 mm, 2 μ m PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Cubo de filtro | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| Adaptadores de CA de la fuente de alimentación para LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Suministro de energía al láser | |
| Filtro de paso de banda | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| Terminador BNC de 50 ohmios | Mini Circuitos | STRM-50 | |
| Cable BNC | Thorlabs | 2249-C | Cable Coaxial, BNC Macho/Macho |
| Banda Ancha Espejo | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Centrífuga | |||
| Condensador | Olympus | ||
| Cubierta de Vidrio | Corning | 2850-25 | Fuente |
| alimentación de CC | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 TopWard | 6302D | |
| Montaje dicroico | Thorlabs | KM100CL | |
| Reactivo de cultivo celular de sulfóxido de dimetilo | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| El águila modificada de Dulbecco' s Medio sin metionina, treonina y piruvato de sodio | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder Con bicarbonato de sodio y sin metionina, treonina y piruvato de sodio |
| Dulbecco' s Águila Modificada' s | Medium Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI | ImageJ ImageJ | Versión 1.53t 24 de agosto de 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Agua pesada (óxido de deuterio) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 | |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB& gclsrc=aw.ds |
| Filtro de paso de banda de alto diámetro exterior | Tecnología de croma | ET890/220m | Filtre el haz de Stokes y transmita el haz de la bomba |
| HyClone Suero fetal bovino (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsina 0.25% (1x) Solución | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Sistema Láser SRS Integrado | Física Aplicada & Electrónica, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD proporciona un pulso de salida a 1031 nm con un ancho de pulso de 6 ps y una tasa de repetición de 80 MHz, que sirve como haz de Stokes. El haz de frecuencia duplicada a 532 nm se utiliza para sembrar sincrónicamente un oscilador paramétrico óptico (OPO) de picosegundos para producir un tren de pulsos de modo bloqueado con un ancho de pulso de cinco ~ 6 ps (el haz loco del OPO está bloqueado con un filtro interferométrico). La longitud de onda de salida del OPO es sintonizable desde 720 – 950 nm, que sirve como haz de bombeo. La intensidad del haz de Stokes de 1031 nm es modulada sinusoidalmente por un EOM incorporado a 8 MHz con una profundidad de modulación de más del 90%. El haz de la bomba se superpone espacialmente con el haz de Stokes mediante el uso de un espejo dicroico dentro de picoEMERALD. La superposición temporal entre la bomba y los pulsos de Stokes se logra con una etapa de retardo incorporada y se optimiza mediante la señal SRS de D2O puro en el microscopio. |
| Microscopio de barrido láser invertido | Olympus FV1200MPE | ||
| IX3-CBH Caja de control | Olympus | Controle el microscopio de barrido láser | |
| Montaje de espejo cinemático | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Ajustadores hexagonales de perfil bajo |
| L-fenalinina | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-triptófano | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In | Amplifier Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Divisor de haz dicroico de paso largo | Semrock | Di02-R980-25x36 | láser de 980 nm BrightLine divisor de haz dicroico plano láser de un solo borde |
| MATLAB | MathWorks | Versión: R2022b | |
| https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html Portaobjetos de microscopio | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopía Software de Imagen | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[foco]=cmsContent11363 |
| Condensador de aceite NA | Olympus | 6-U130 | |
| https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser Esmalte de uñas | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origen | OriginLab | Origen 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Termofischer de penicilina/estreptomicina | - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Conjunto de periscopio | Thorlabs | RS99 | Incluye las unidades superior e inferior, Ø Poste de 1" y horquilla de apriete. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | |
| Caja blindada con conectores BNC | Pomona Electronics | 2902 | Caja de aluminio con cubierta, BNC Detector |
| de fotodiodos de silicio | N/A | DYI construidos | |
| Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ | |
| Espectroscopía Raman Espontánea | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Microscopía de Dispersión Raman Estimulada | Home Built | N/A | |
| Touch Controlador de panel | Olympus | Controle la dirección X-Y del microscopio de escaneo láser | |
| Azul de tripán 0,4% (0,85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Pinzas | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Microscopía de fluorescencia de excitación de fotones | construida en casa | N/A | |
| Papel de pesaje | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Controle el amplificador de bloqueo de Zúrich |
Referencias
- Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
- Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. Metabolism of amino acids in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837(2020).
- Parthasarathy, A., et al.
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Reimpresiones y permisos
