Artículo de método

Estandarización de un ensayo citométrico de perlas basado en anticuerpos de yema de huevo

DOI:

10.3791/65123

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19 de mayo de 2023

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1Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas - UFAM, 2Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia – Universidade Estadual do Amazonas/Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, 5Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe una metodología para la preparación de perlas de látex para ensayos con anticuerpos IgY para la detección de antígenos.

Resumen

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Los inmunoensayos son pruebas importantes para la detección de numerosas dianas moleculares. Entre los métodos disponibles en la actualidad, el ensayo citométrico de perlas ha ganado protagonismo en las últimas décadas. Cada microesfera que es leída por el equipo representa un evento de análisis de la capacidad de interacción entre las moléculas bajo prueba. Miles de estos eventos se leen en un solo ensayo, lo que garantiza una alta precisión y reproducibilidad del ensayo. Esta metodología también se puede utilizar en la validación de nuevos insumos, como los anticuerpos IgY, para el diagnóstico de enfermedades. Estos anticuerpos se obtienen a través de la inmunización de pollos con el antígeno de interés y luego la extracción de la inmunoglobulina de la yema de los huevos de los animales; Por lo tanto, este es un método indoloro y altamente productivo para obtener los anticuerpos. Además de una metodología para la validación de alta precisión de la capacidad de reconocimiento de anticuerpos de este ensayo, este artículo también presenta un método para extraer estos anticuerpos, determinar las mejores condiciones de acoplamiento para los anticuerpos y las perlas de látex, y determinar la sensibilidad de la prueba.

Introducción

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Entre las técnicas de inmunoensayo destinadas al diagnóstico de enfermedades, el ensayo de perlas citométricas se ha convertido en un enfoque altamente sensible y fiable, ya que permite el análisis de miles de partículas en un solo ensayo1. Esta técnica, además de tener una alta productividad y permitir el uso de volúmenes más pequeños de muestras, también presenta una gran flexibilidad, ya que permite la detección de varias moléculas, como citoquinas, moléculas de adhesión, isotipos de anticuerpos y proteínas 2,3.

Para el desarrollo de ....

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Protocolo

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NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Extracción de IgY de yemas de huevo

  1. Higienización de los óvulos
    1. Sumerja los huevos (recién puestos o hasta 4 días después de la puesta, del linaje Gallus gallus Dekalb White) en una solución diluida al 0,2% de hipoclorito de sodio, enjuague rápidamente con agua corriente y limpie suavemente para su uso posterior o inmediato.
      NOTA: Si no se utiliza inmediatamente, manténgalo a 4 °C durante un máximo de 15 días.

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Resultados

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La Figura 2 proporciona una representación gráfica del proceso de extracción de anticuerpos IgY mediante acidificación, seguido de la separación mediante ácido caprílico (Figura 2).

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Figura 2: Representación esquemática de la etapa de extracción de anticuerpos IgY.......

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Discusión

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El método de precipitación del anticuerpo IgY mediante la reducción del pH seguido de la separación de lípidos mediante ácido caprílico es eficaz para aislar los anticuerpos totales sin pérdida de funcionalidad. El método aquí propuesto es más sencillo y económico que el reportado por Redwan et al.11, que también utilizaron precipitación por acidificación y ácido caprílico, pero con un protocolo más complejo y laborioso. Este método también presenta ventajas sobre las metodologías comúnmente utili.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener posibles conflictos de intereses con respecto a la investigación, autoría y publicación de este artículo.

Agradecimientos

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Agradecemos a la FIOCRUZ (Programa de excelencia en pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA), al Programa de Posgrado en Biotecnología (PPGBIOTEC de la Universidade Federal do Amazonas - UFAM), a la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) y a la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) por la concesión de las becas. La Figura 2 y la Figura 4 se crearon con biorender.com.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anti-Chicken IgY (H+L), altamente adsorbido cruzado, CF  Anticuerpo 488A producido en el burroSigma-AldrichSAB4600031
Anti-ratón IgG (H+L), F(ab′)2Sigma-AldrichSAB4600388
BD FACSCanto IIBD BiocienciasBF-FACSC2
BD FACSDiva CS& Cuentas de investigación T (CS& T perlas de investigación)BD Biosciences655050
BD FACSDiva software 7.0BD Biosciences655677
Bio-Rad Ensayo de proteínas Colorante Reactivo ConcentradoBio-Rad#5000006
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA4503
Ácido caprílicoSigma-AldrichO3907
Centrífuga 5702 REppendorfZ606936
Cloruro 37% ácido de grado molecularNEON02618 NEON
CML látex, 4% c/vInvitrogenC37253
Megafuge 8RThermo ScientificTS-HM8R
N-(3-dimetilaminopropilo)-N′-etilcarbodiimida clorhidrato en polvo (EDC)Sigma-AldrichE7750-1G
N-Hidroxisuccinimida (NHS)Sigma-Aldrich130672-25G
Solución salina tamponada con fosfatoSigma-Aldrich1003335620
Hidróxido de sodioAcs CientificaP.10.0594.024.00.27
Hipoclorito de sodioAcs CientificaR09211000
Termomezclador Calor/FríoKASVIK80-120R

Referencias

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  1. Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407(2019).
  2. de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M.

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Etiquetas

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