Oligonucleótidos antisentido como herramienta para la desactivación prolongada de lncRNAs nucleares en líneas celulares humanas

Resumen

Para analizar la función de los lncRNAs en procesos dependientes del tiempo, como la inestabilidad cromosómica, se debe lograr un efecto de derribo prolongado. Para ello, se presenta aquí un protocolo que utiliza oligonucleótidos antisentido modificados para lograr un knockdown efectivo en líneas celulares durante 21 días.

Resumen

Los ARN largos no codificantes (lncRNA) desempeñan funciones reguladoras clave en la expresión génica a nivel transcripcional. La evidencia experimental ha establecido que una fracción sustancial de lncRNA se acumula preferentemente en el núcleo. Para el análisis de la función de los lncRNAs nucleares, es importante lograr una descomposición eficiente de estos transcritos dentro del núcleo. En contraste con el uso de la interferencia de ARN, una tecnología que depende de la maquinaria de silenciamiento citoplasmático, una tecnología de oligonucleótidos antisentido (ASO) puede lograr la eliminación de ARN mediante el reclutamiento de ARNasa H a los dúplex ARN-ADN para la escisión del ARN nuclear. A diferencia del uso de herramientas CRISPR-Cas para la ingeniería del genoma, donde pueden ocurrir posibles alteraciones en el estado de la cromatina, los ASO permiten la eliminación eficiente de transcripciones nucleares sin modificar el genoma. Sin embargo, uno de los principales obstáculos para el derribo mediado por ASO es su efecto transitorio. Para el estudio de los efectos duraderos del silenciamiento del lncRNA, es necesario mantener un knockdown eficiente durante mucho tiempo. En este estudio, se desarrolló un protocolo para lograr un efecto de derribo durante más de 21 días. El propósito fue evaluar los efectos cis-reguladores de la knockdown de lncRNA en el gen codificante adyacente RFC4, que está relacionado con la inestabilidad cromosómica, una condición que solo se observa a través del tiempo y el envejecimiento celular. Se utilizaron dos líneas celulares humanas diferentes: PrEC, células epiteliales primarias normales de la próstata, y HCT116, una línea celular epitelial aislada del carcinoma colorrectal, logrando una eliminación exitosa en las líneas celulares analizadas.

Introducción

La gran mayoría del genoma humano está transcrito, lo que da lugar a una amplia variedad de transcripciones, incluidos los lncRNAs, que, en número, superan el número de genes codificantes anotados en el transcriptoma humano¹. Los LncRNAs son transcripciones de más de 200 nucleótidos que no codifican proteínas ^2,3 y han sido examinados recientemente por sus importantes funciones reguladoras en la célula⁴. Se ha demostrado que sus funciones dependen de su localización subcelular⁵, como el núcleo donde se acu....

Protocolo

NOTA: Este protocolo está destinado a ser realizado únicamente por personal de laboratorio con experiencia en procedimientos de seguridad de laboratorio. Es fundamental leer correctamente las fichas de datos de seguridad de todos los reactivos y materiales utilizados en este protocolo antes de comenzar a manipular materiales y equipos peligrosos. Es esencial leer, comprender y cumplir con todos los requisitos de seguridad indicados en el manual de seguridad de laboratorio de su institución a lo largo de todo el protocolo. La eliminación de todos los residuos biológicos y químicos debe realizarse de acuerdo con el manual de gestión y e....

Resultados

En el presente protocolo, el uso de ASOs se adaptó a la KD de un lncRNA nuclear durante un tiempo prolongado en las líneas celulares humanas PrEC y HCT116.

Ciertamente, el experimento KD fue exitoso en la línea celular PrEC durante 21 días del experimento, como se observa en la Figura 4. Para confirmar esta afirmación, además de analizar la expresión en los días de paso celular (Figura 4 A-C), analizamos los puntos de.......

Discusión

Como se mencionó anteriormente, los lncRNAs tienen funciones reguladoras clave en la célula; Por lo tanto, la desregulación de estas transcripciones puede estar involucrada en enfermedades. El cáncer es una de estas enfermedades caracterizadas por la desregulación del lncRNA^43,44. En esta enfermedad, se sabe que los lncRNAs desempeñan importantes funciones reguladoras como oncogenes⁴⁵ o supresores tumorale.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de centrífuga de 15 ml - Tubos cónicos de 15 ml	Thermo Fisher Scientific	339650
Corning 100 mm TC tratado con plato de cultivo	Corning	430167	Superficie:55 cm2
Corning 35 mm Plato de cultivo tratado con TC Corning		430165	Superficie: 9 cm2
DPBS, sin calcio, sin magnesio	Thermo Fisher Scientific	14190144
Suero Fetal Bovino (FBS)	ATCC	30-2020
HCT 116 línea celular	ATCC	CCL-247
HEPES, 1M Solución tampón	Thermo Fisher Scientific	15630122
Integrated DNA Technologies	NA	NA https://www.idtdna.com/
Reactivo de lipofectamina RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778150
el medio 5A de McCoy	ATCC	30-2007
Células epiteliales de próstata primarias humanas normales (HPrEC)	ATCC	PCS-440-010
Explosión de nucleótidos NCBI	NA	NA https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM Medios de suero reducidos	Thermo Fisher Scientific	31985070
PBS (10X), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific
Célula Epitelial de Próstata Medio Basal	ATCC	PCS-440-030
Kit de Crecimiento de Células Epiteliales de Próstata	ATCC	PCS-440-040
Complemento inverso herramienta en línea	NA	NA	https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServer	NA	NA	http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
Tubos de microfuga sin RNasa, 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	AM12400
TrypLE Express Enzyme (1X), sin rojo fenol	Thermo Fisher Scientific	12604013	Solución de tripsina-EDTA
Solución neutralizante de tripsina	ATCC	PCS-999-004
Tripsina-EDTA para células primarias	ATCC	PCS-999-003
UCSC Navegador del genoma, humano (GRCh38/hg38)	NA	NA https://genome.ucsc.edu/