Artículo de método

Oligonucleótidos antisentido como herramienta para la desactivación prolongada de lncRNAs nucleares en líneas celulares humanas

DOI:

10.3791/65124

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1 de septiembre de 2023

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer, Instituto Nacional de Cancerología-Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnológico de Monterrey

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para analizar la función de los lncRNAs en procesos dependientes del tiempo, como la inestabilidad cromosómica, se debe lograr un efecto de derribo prolongado. Para ello, se presenta aquí un protocolo que utiliza oligonucleótidos antisentido modificados para lograr un knockdown efectivo en líneas celulares durante 21 días.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los ARN largos no codificantes (lncRNA) desempeñan funciones reguladoras clave en la expresión génica a nivel transcripcional. La evidencia experimental ha establecido que una fracción sustancial de lncRNA se acumula preferentemente en el núcleo. Para el análisis de la función de los lncRNAs nucleares, es importante lograr una descomposición eficiente de estos transcritos dentro del núcleo. En contraste con el uso de la interferencia de ARN, una tecnología que depende de la maquinaria de silenciamiento citoplasmático, una tecnología de oligonucleótidos antisentido (ASO) puede lograr la eliminación de ARN mediante el reclutamiento de ARNasa H a los dúplex ARN-ADN para la escisión del ARN nuclear. A diferencia del uso de herramientas CRISPR-Cas para la ingeniería del genoma, donde pueden ocurrir posibles alteraciones en el estado de la cromatina, los ASO permiten la eliminación eficiente de transcripciones nucleares sin modificar el genoma. Sin embargo, uno de los principales obstáculos para el derribo mediado por ASO es su efecto transitorio. Para el estudio de los efectos duraderos del silenciamiento del lncRNA, es necesario mantener un knockdown eficiente durante mucho tiempo. En este estudio, se desarrolló un protocolo para lograr un efecto de derribo durante más de 21 días. El propósito fue evaluar los efectos cis-reguladores de la knockdown de lncRNA en el gen codificante adyacente RFC4, que está relacionado con la inestabilidad cromosómica, una condición que solo se observa a través del tiempo y el envejecimiento celular. Se utilizaron dos líneas celulares humanas diferentes: PrEC, células epiteliales primarias normales de la próstata, y HCT116, una línea celular epitelial aislada del carcinoma colorrectal, logrando una eliminación exitosa en las líneas celulares analizadas.

Introducción

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La gran mayoría del genoma humano está transcrito, lo que da lugar a una amplia variedad de transcripciones, incluidos los lncRNAs, que, en número, superan el número de genes codificantes anotados en el transcriptoma humano1. Los LncRNAs son transcripciones de más de 200 nucleótidos que no codifican proteínas 2,3 y han sido examinados recientemente por sus importantes funciones reguladoras en la célula4. Se ha demostrado que sus funciones dependen de su localización subcelular5, como el núcleo donde se acumulan una fracción significativa de lncRNAs y participan activamente en la regulación transcripcional6 y para el mantenimiento de la arquitectura nuclear7, entre otros procesos biológicos 8,9,10.

Para la caracterización funcional de los lncRNAs nucleares, se deben utilizar métodos capaces de inducir knockdown (KD) en el núcleo, y los ASO son una poderosa herramienta para silenciar las transcripciones nucleares. En general, los ASOs son secuencias de ADN monocatenario de ~20 pares de bases de longitud que se unen al ARN complementario mediante el emparejamiento de bases de Watson-Crick11,12,13 y pueden modificar la función del ARN a través de mecanismos que dependen de su estructura química y modificaciones13,14. Las modificaciones químicas del ASO se pueden dividir en 2 grandes grupos: modificaciones de la columna vertebral y modificaciones del anillo de azúcar 2'15, ambas destinadas a aumentar la estabilidad al conferir una alta resistencia a las nucleasas, pero también a mejorar el efecto biológico deseado13,16. Entre las modificaciones de la columna vertebral, los enlaces fosforamidato morfolino (PMO), tiofosforamidato y morfolino se utilizan ampliamente para fines como la interferencia en el empalme17,18 al servir como agentes bloqueantes estéricos19, pero no para inducir la degradación de la transcripción. Otra modificación de la columna vertebral es el enlace fosforotioato (PS), una de las modificaciones más utilizadas en los ASO. A diferencia de las modificaciones mencionadas anteriormente, los enlaces PS no interfieren con el reclutamiento de RNasaH 12,20, lo que permite la eliminación del ARN. Sin embargo, también existe una amplia variedad de modificaciones del anillo de azúcar 2'21; sin embargo, para el propósito de la eliminación del ARN, entre las modificaciones que inducen efectos de silenciamiento eficientes se encuentran los ácidos nucleicos bloqueados (LNAs)22, 23 y la modificación 2'-O-metilo24. A pesar de que los LNA han demostrado ser altamente efectivos para el knockdown en comparación con otras modificaciones25, pueden inducir efectos no deseados como hepatotoxicidad26 e inducción de apoptosis in vivo e in vitro27.

Con el fin de eliminar el ARN, los ASO con las modificaciones adecuadas mencionadas anteriormente pueden reclutar ARNasa H1 y H220,28, y estas enzimas se reclutan para los híbridos ADN-ARN y escinden el ARN objetivo, liberando el ASO13. Los productos de ARN de esta escisión son procesados por la maquinaria de vigilancia del ARN, lo que resulta en la degradación del ARN29 sin modificar la región genómica de interés, a diferencia de otras técnicas como los sistemas CRISPR-Cas, donde las modificaciones en el estado de la cromatina pueden crear efectos biológicos no deseados30. A pesar de las ventajas de la tecnología ASO, los efectos de silenciamiento temporal debidos a la división celular o a la degradación del ASO a lo largo del tiempo son un obstáculo a superar cuando se estudian procesos dependientes del tiempo, como la inestabilidad cromosómica (CIN)31.

En particular, la NIC se define como un aumento de la tasa de cambios en el número y la estructura de los cromosomas en comparación con los de las células normales32 y surge de errores en la segregación cromosómica durante la mitosis, lo que conduce a alteraciones genéticas que originan la heterogeneidad intratumoral33 a lo largo del tiempo. Por lo tanto, la NIC no se puede evaluar solo mediante la búsqueda de un cariotipo aneuploide. Para el correcto estudio y evaluación de la NIC en cultivo celular, es importante realizar un seguimiento de las células a lo largo del tiempo. Para el estudio de los efectos de un KD de lncRNA sobre la NIC, se necesita una metodología que permita un efecto prolongado de la KD. Para ello, se utilizaron ASOs en este protocolo, donde lncRNA-RFC4 se silenció con éxito en las líneas celulares humanas HCT115 y PrEC durante 18 y 21 días, respectivamente. Este transcrito es un lncRNA no caracterizado de 1,2 kb de longitud, y su ubicación genómica se encuentra en el cromosoma 3 (q27.3). Es adyacente al gen codificante de proteínas RFC4, un gen asociado con la NIC en diferentes tipos de cáncer humano 34,35,36.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Este protocolo está destinado a ser realizado únicamente por personal de laboratorio con experiencia en procedimientos de seguridad de laboratorio. Es fundamental leer correctamente las fichas de datos de seguridad de todos los reactivos y materiales utilizados en este protocolo antes de comenzar a manipular materiales y equipos peligrosos. Es esencial leer, comprender y cumplir con todos los requisitos de seguridad indicados en el manual de seguridad de laboratorio de su institución a lo largo de todo el protocolo. La eliminación de todos los residuos biológicos y químicos debe realizarse de acuerdo con el manual de gestión y eliminación de residuos de la institución. Si no se manejan con cuidado y de acuerdo con las prácticas seguras de laboratorio, los materiales y equipos utilizados en este protocolo pueden causar lesiones graves. Siga siempre el manual de laboratorio de seguridad y los procedimientos de seguridad de la institución.

1. Diseño de ASOs

  1. Diseñe manualmente los ASO como se describe a continuación.
    1. Obtener la secuencia completa de la transcripción objetivo y analizarla en el RNAfold WebServer, Universidad de Viena37 (Tabla de Materiales), utilizando los parámetros predeterminados en el sitio web para obtener la estructura secundaria de energía libre mínima (MFE).
    2. Cuando los resultados estén listos, vaya al dibujo de la estructura plana de MFE y haga clic en Ver en Forna para abrir la estructura secundaria de MFE en el sitio web, y el software mostrará la estructura secundaria predicha de la transcripción analizada.
    3. A partir de la estructura secundaria MFE predicha, seleccione una región de 20 pb de longitud en el ARN, evitando las cadenas G (secuencias de 3 guaninas seguidas) al diseñar los oligonucleótidos. Para seleccionar la mejor región objetivo para el ASO, utilice las regiones que se predice que tienen una menor probabilidad de emparejamiento de bases internas (Figura 1).
    4. A partir de la región seleccionada de 20 pb, cree la secuencia de complemento inversa. Cree manualmente el complemento inverso o utilice la herramienta en línea del complemento inverso (Tabla de materiales). La secuencia inversa del complemento será el ASO que se debe sintetizar para el experimento.
    5. Analice la secuencia ASO utilizando Nucleotide Blast NCBI (blastn) y UCSC Genome Browser en humanos (GRCh38/hg38). Asegúrese de que los ASO no muestren homología con otras transcripciones u otras regiones genómicas del genoma humano.
      NOTA: La síntesis y purificación de ASO fue realizada por una empresa comercial (Tabla de Materiales).
  2. Asegúrese de que los oligonucleótidos sintetizados tengan las siguientes características.
    1. Asegurar los enlaces PS a lo largo de toda la secuencia del oligonucleótido38 (Figura 2A). Asegúrese de que los ASO sean quiméricos, con 5 nucleótidos flanqueando los extremos 5' y 3' con anillos de azúcar modificados con 2'-O-metilo (Figura 2B).
    2. Asegúrese de que los 10 nucleótidos en el medio tengan un anillo de azúcar no modificado para apoyar la unión a la ARNasa H (Figura 2C).
    3. Pida a la empresa que realice la purificación utilizando desalinización estándar y HPLC de fase inversa (RP)39.
    4. Pedido de entrega de ASO en formato liofilizado.
  3. Disolver los ASO liofilizados en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco sin calcio y magnesio hasta una concentración final de 200 μM. Conservar a -20 °C.
  4. Prepare la solución de trabajo de ASO diluyendo el material concentrado a una concentración de 20 μM. Prepare la dilución utilizando DPBS. Conservar a -20 °C.
    NOTA: Para este estudio, se diseñaron dos ASOs dirigidos a lncRNA-RFC4. Para la optimización de la concentración de ASO para la transfección y eficiencia, se siguió el protocolo de Zong et al.40 . Se diseñaron y optimizaron experimentalmente dos ASOs de acuerdo con el protocolo de Zong: ASO-lncRFC4 y ASO-lncRFC4-2. Después de la optimización, se seleccionó un ASO eficaz dirigido a lncRNA-RFC4, ASO-lncRFC4, para el protocolo de derribo prolongado (Figura complementaria 1). Como control positivo, se utilizó un ASO eficiente previamente confirmado dirigido al lncRNA MALAT18 : ASO-MALAT1. Para el control negativo, se diseñó un ASO dirigido al gen lacZ de Escherichia coli , ASO-lacZ (número de acceso NCBI: FN297865).

2. Preparación de las células

NOTA: Trabaje dentro de la cubierta de cultivo celular cada vez que se manipulen líneas celulares, soluciones, material o cualquier producto que se utilice durante la manipulación de cultivos celulares. Al manipular líquidos para el cultivo celular, utilice siempre pipetas serológicas esterilizadas o micropipetas con puntas esterilizadas. Cumplir y seguir siempre todos los requisitos de seguridad indicados en el manual de seguridad del laboratorio de la institución durante todo el protocolo.

  1. Prepare el medio de cultivo celular completo para cada línea celular como se describe a continuación.
    1. Para HCT116, prepare el medio 5A de McCoy con 10% de suero fetal bovino (FBS).
    2. Para la PrEC, prepare el medio basal de células epiteliales de próstata con el kit de crecimiento de células epiteliales de próstata.
  2. Utilice tres placas de cultivo de 100 mm (55cm2 de superficie) para los experimentos de KD, una para cada oligonucleótido que se vaya a utilizar: ASO dirigido al lncRNA, ASO que se utilizará como control positivo (ASO-MALAT1) y ASO que se utilizará como control negativo (ASO-lacZ).
  3. Utilice dos placas de cultivo de 35 mm (9cm2 de superficie) para ser utilizadas como puntos de control para KD entre los pasajes celulares, una de las cuales se transfectará con medios de transfección completos para ASO-lncRFC4 y la otra para ASO-lacZ.
    NOTA: La transfección se planificó de acuerdo con los procedimientos y protocolos del fabricante del reactivo de transfección a base de lípidos (ver Tabla de Materiales) informados anteriormente41,42.
  4. Células de siembra a una densidad de 1 x 104 células/cm2 en placas de cultivo celular. Incubar a 37 °C en la incubadora utilizando 5% de CO2 en el aire hasta que las células alcancen el 50% de confluencia (cuando el 50% de la superficie esté cubierta por la monocapa celular). Con una confluencia del 50%, las células están listas para ser transfectadas para este protocolo.
    NOTA: Para la transfección de ASO-lncRFC4 y ASO-lacZ, se sembró una placa de 100 mm y una placa de 35 mm. Para la transfección de ASO-MALAT1, solo se sembró una placa de 100 mm (Figura 3A).

3. Transfección

  1. Calentar el medio sérico reducido a 37 °C antes del inicio del procedimiento.
  2. Para la transfección con ASO-lacZ y ASO-lncRFC4, siga los pasos que se describen a continuación.
    NOTA: La transfección con ASO-lacZ y ASO-lncRFC4 está prevista para células con una superficie de 55cm2; Cuando se utilizan diferentes áreas, los volúmenes se pueden ajustar en consecuencia. Este procedimiento debe realizarse para cada ASO utilizado en las mismas condiciones.
    1. Prepare el tubo 1 dentro de la cubierta de cultivo celular disolviendo 43,75 μL de ASO (20 μM) en 1,4 mL de medio sérico reducido tibio en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL.
    2. Prepare el tubo 2 dentro de la campana de cultivo celular mezclando 18,66 μL de reactivo de transfección a base de lípidos con 1,4 mL de medio sérico reducido tibio en un tubo de microfuga libre de ARNasa de 1,5 mL.
    3. Incubar los tubos 1 y 2 dentro de la campana de cultivo celular a temperatura ambiente durante 10 min.
    4. Añadir la solución contenida en el tubo 2 (reactivo de transfección + suero reducido) directamente al tubo 1 (ASO + suero reducido) lentamente, gota a gota, para evitar que los reactivos se extiendan por la superficie del tubo.
    5. Incubar la mezcla contenida en el tubo 1 durante 20 min dentro de la campana de cultivo a temperatura ambiente.
    6. Añadir medio sérico reducido tibio al tubo 1 hasta un volumen final de 8,75 mL.
      NOTA: El medio de transfección final contenía ASO a una concentración de 100 nM.
    7. Retire el medio de cultivo de la placa de cultivo celular que contiene las células que se van a transfectar y agregue 7,5 mL del medio de transfección a la placa de cultivo de 100 mm y 1 mL a la placa de cultivo de 35 mm directamente en la monocapa celular, gota a gota. Asegúrese de que el medio se distribuya uniformemente a lo largo de toda la superficie agitando suavemente el plato.
    8. Incubar en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2 en el aire durante 6 h.
    9. Después de 6 h de incubación en el medio de transfección, agregue 7,5 mL de medio completo a las células en la placa de cultivo de 100 mm y 1 mL de medio completo a las células en la placa de cultivo de 35 mm. Incubar a 37 °C y 5% deCO2.
  3. Para la transfección con ASO-MALAT1, realice los experimentos que se describen a continuación.
    NOTA: La transfección con ASO-MALAT1 está prevista para células con una superficie de 55cm2.
    1. Prepare el tubo 1 dentro de la cubierta de cultivo celular disolviendo 37,5 μL de ASO (20 μM) en 1,2 mL de medio sérico reducido tibio en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL.
    2. Prepare el tubo 2 mezclando 16 μL de reactivo de transfección a base de lípidos con 1,2 mL de medio sérico reducido tibio.
    3. Incubar los tubos 1 y 2 a temperatura ambiente durante 10 min dentro de la campana de cultivo celular.
    4. Añadir la solución contenida en el tubo 2 (reactivo de transfección a base de lípidos + suero reducido) directamente al tubo 1 (ASO + suero reducido) lentamente, gota a gota, para evitar que los reactivos se extiendan por la superficie del tubo.
    5. Incubar la mezcla contenida en el tubo 1 durante 20 min dentro de la campana de cultivo a temperatura ambiente.
    6. Añadir medio sérico reducido tibio al tubo 1 hasta un volumen final de 7,5 mL. El medio de transfección final contenía ASO a una concentración de 100 nM.
    7. Retire el medio de cultivo de la placa de cultivo celular que contiene las células que se van a transfectar y agregue 7,5 ml del medio de transfección directamente a la monocapa celular gota a gota para garantizar que el medio se distribuya uniformemente a lo largo de toda la superficie agitando suavemente la placa.
    8. Incubar a 37 °C en una incubadora utilizando 5% de CO2 en el aire durante 6 h.
    9. Después de 6 h de incubación con el medio de transfección, añadir 7,5 mL de medio completo a las células e incubar en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
  4. Evalúe las células microscópicamente cada 12-24 h hasta que las células estén listas para la siguiente ronda de transfección.
    NOTA: A continuación, se debe realizar la transfección cuando las células alcancen una confluencia del 70%. Si es necesario, cambie el medio de cultivo y reemplácelo por un medio de cultivo completo.
  5. Cuando las células estén confluentes en un 70% en la placa de cultivo celular, repita el procedimiento (pasos 3.1 a 3.4) y realice la siguiente ronda de transfección.
    NOTA: Después de la segunda transfección, las células deben evaluarse microscópicamente cada 12-24 h. La recolección y el paso de las células deben realizarse cuando las células alcanzan una confluencia del 80%-85%. Si es necesario, cambie el medio de cultivo y reemplácelo por un medio de cultivo completo.

4. Recolección y paso de células

NOTA: La recolección y el paso de células se realizan después de cada 2 rondas de transfección y después de la2ª,4ª y6ª rondas de transfección. El tiempo medio de recolección en las células HCT116 fue de 6 días después de la1ª,3ª y 5ª transfecciones, y para las células PrEC, el tiempo medio fue de 7 días después de la 1ª,3ª y 5ª transfecciones. El punto de tiempo para la transfección difiere para las dos líneas celulares utilizadas en este protocolo. Para HCT116, la2ª, 3ª,4ª,5ª y6ª transfecciones se realizan 3, 6, 9, 12 y 15 días después de la primera transfección, respectivamente. En el caso de la PrEC, la2ª,3ª,4ª,5ª y6ª transfección se realizan 3, 7, 10, 14 y 18 días después de la primera transfección, respectivamente. Consulte la línea de tiempo de la Figura 3 para verificar los puntos de tiempo para la transfección, el paso y la cosecha.

  1. Realice la recolección y el paso de células para los experimentos de KD en placas de cultivo de 100 mm como se describe a continuación.
    1. Proceda a la recolección de células y paso cuando las células alcancen una confluencia del 80%-85%.
    2. Calentar todo el medio y lavar las soluciones a 37 °C. Calentar el reactivo de disociación a temperatura ambiente. Calentar la solución neutralizante para el reactivo de disociación a temperatura ambiente.
      NOTA: Las soluciones de lavado, los reactivos de disociación y las soluciones neutralizantes difieren para las dos líneas celulares utilizadas en este protocolo. Las células HCT116 se lavan con PBS (solución salina tamponada con fosfato) y se disocian con una solución de tripsina-EDTA. La neutralización del reactivo de disociación se realiza con medios de cultivo completos para células HCT116. En el caso de la PrEC, se utiliza una solución salina tamponada con HEPES como solución de lavado. La tripsina-EDTA se utiliza como reactivo de disociación. Para la neutralización del reactivo de disociación, utilice una solución neutralizante de tripsina.
    3. Dentro de la campana de cultivo, retire los medios de cultivo de la placa de cultivo celular y lave suavemente con 3 ml de solución de lavado, luego deseche la solución de lavado. Repita este paso 2 veces.
    4. Añadir 2 mL de reactivo de disociación según la línea celular a la monocapa celular e incubar a 37 °C durante 3-5 min. Evalúe las células cada 2 minutos hasta que se complete la disociación.
    5. Agregue 2 mL de solución neutralizante de acuerdo con la línea celular y transfiera todo el volumen de la suspensión celular de la placa de cultivo celular a un tubo centrífugo cónico de 15 mL.
    6. Para la extracción de ARN, tome 500 μL de la suspensión celular y transfiérala a un tubo de centrífuga de 1,5 mL. Coloque el tubo en hielo y continúe con el paso 5.1 para la extracción de ARN y RT-qPCR.
    7. Centrifugar el resto de la suspensión celular a 120 x g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
    8. Vuelva a suspender el pellet de células en 2 mL de medio de cultivo completo y proceda al recuento de células de acuerdo con los procedimientos estándar.
    9. Para el cariotipo, las células de siembra a una densidad de 1 x 104 células/cm2 en una placa de cultivo celular de 35 mm de diámetro (superficie de 9cm2), incuban en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 en el aire durante 24 h y proceden al cariotipo de acuerdo con los procedimientos estándar.
    10. Para continuar los experimentos de KD en el siguiente paso celular, las células de siembra a una densidad de 1 x 104 células/cm2 en una nueva placa de cultivo celular de 100 mm de diámetro. Este plato será el pasaje número 2 para el experimento. Incubar a 37 °C en incubadora utilizando 5% de CO2 en el aire hasta que las células alcancen una confluencia del 50%.
      NOTA: Si se desea, las células restantes se pueden utilizar para la extracción de proteínas y/o la congelación de acuerdo con los procedimientos estándar.
    11. Repita los pasos 3.1 a 4.1.10 para la transfección y la recolección del pasaje 2 y del pasaje 3.
  2. Siga el siguiente procedimiento para la recolección de células para los puntos de control de los experimentos KD en placas de cultivo de 35 mm.
    NOTA: La recolección para el primer punto de control en el experimento KD se realiza 2 días después de los procedimientos de2ª y4ª transfección.
    1. Calentar los medios completos y las soluciones de lavado a 37 °C. Calentar el reactivo de disociación a temperatura ambiente. Calentar la solución neutralizante para el reactivo de disociación a temperatura ambiente.
    2. Dentro de la campana de cultivo, retire los medios de cultivo de la placa de cultivo celular y lave suavemente con 0,5 ml de solución de lavado y luego deseche la solución de lavado. Repita este paso 2 veces.
    3. Después de desechar las soluciones de lavado, agregue 0,5 mL de reactivo de disociación de acuerdo con la línea celular e incube a 37 °C durante 3-5 min. Evalúe las células cada 2 minutos hasta que se complete la disociación.
    4. Agregue 0,5 mL de solución neutralizante de acuerdo con la línea celular y transfiera todo el volumen de la suspensión celular de la placa de cultivo celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y colóquelo en hielo.
    5. Continúe con el paso 5.1 para la extracción de ARN y qPCR.

5. Extracción de ARN y RT-PCR

  1. Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 2 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Lavar el pellet de celda con 600 μL de PBS frío (4 °C).
  2. Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 2 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
    Utilice el pellet de célula para la extracción de ARN de acuerdo con los procedimientos estándar.
  3. Proceda al tratamiento con DNasa del ARN purificado de acuerdo con el procedimiento estándar seguido en el laboratorio. En el punto de pausa, almacene el ARN purificado a -80 °C durante períodos prolongados.
  4. Utilice el ARN para la síntesis de ADNc estándar con cada muestra de ARN obtenida. En el punto de pausa, almacene el ADNc a -20 °C durante períodos prolongados.
  5. Realice qPCR estándar según los pasos que se describen a continuación.
    1. Para la qPCR, los oligonucleótidos amplifican los siguientes transcritos: lncRNA de interés, MALAT1 y un gen expresado constitutivamente como control interno (Tabla 1). Para este protocolo, se utilizó la expresión RPS28 como control interno.
    2. Realizar reacciones de qPCR para amplificar el control interno, el lncRNA de interés y MALAT1 utilizando ADNc de la muestra ASO-LacZ. Este ejemplo se utilizará para normalizar la expresión de los otros ejemplos.
    3. Realizar reacciones de qPCR para amplificar el control interno RPS28 y el lncRNA de interés utilizando cDNA de la muestra de ASO-lncRNA.
    4. Realice reacciones de qPCR para amplificar los controles internos RPS28 y MALAT1 utilizando ADNc de la muestra ASO-MALAT1. Siga la configuración de la reacción y las condiciones del termociclador como se describe en la Tabla 2.
    5. Analice los datos de qPCR mediante la normalización ΔΔCt de la expresión de la transcripción de interés frente al control interno y, a continuación, normalice la expresión de la transcripción de interés (lncRNA o MALAT1) frente a la expresión de la misma transcripción en la muestra ASO-LacZ para obtener el nivel de expresión relativo de la transcripción.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En el presente protocolo, el uso de ASOs se adaptó a la KD de un lncRNA nuclear durante un tiempo prolongado en las líneas celulares humanas PrEC y HCT116.

Ciertamente, el experimento KD fue exitoso en la línea celular PrEC durante 21 días del experimento, como se observa en la Figura 4. Para confirmar esta afirmación, además de analizar la expresión en los días de paso celular (Figura 4 A-C), analizamos los puntos de...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Como se mencionó anteriormente, los lncRNAs tienen funciones reguladoras clave en la célula; Por lo tanto, la desregulación de estas transcripciones puede estar involucrada en enfermedades. El cáncer es una de estas enfermedades caracterizadas por la desregulación del lncRNA43,44. En esta enfermedad, se sabe que los lncRNAs desempeñan importantes funciones reguladoras como oncogenes45 o supresores tumorale...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Montiel-Manríquez, Rogelio es estudiante de doctorado del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y ha recibido una beca CONACyT con el número de CVU CONACyT: 581151.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de centrífuga de 15 ml - Tubos cónicos de 15 mlThermo Fisher Scientific339650
Corning 100 mm TC tratado con plato de cultivoCorning 430167Superficie:55 cm2
Corning 35 mm Plato de cultivo tratado con TC Corning 430165Superficie: 9 cm2
DPBS, sin calcio, sin magnesioThermo Fisher Scientific14190144
Suero Fetal Bovino (FBS)ATCC30-2020
HCT 116 línea celularATCCCCL-247
HEPES, 1M Solución tampónThermo Fisher Scientific15630122
Integrated DNA Technologies NANA https://www.idtdna.com/
Reactivo de lipofectamina RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150
el medio 5A de McCoy ATCC30-2007
Células epiteliales de próstata primarias humanas normales (HPrEC)ATCCPCS-440-010
Explosión de nucleótidos NCBI NANA https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM Medios de suero reducidosThermo Fisher Scientific31985070
PBS (10X), pH 7.4Thermo Fisher Scientific
Célula Epitelial de Próstata Medio BasalATCCPCS-440-030
Kit de Crecimiento de Células Epiteliales de PróstataATCCPCS-440-040
Complemento inverso herramienta en líneaNANAhttps://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServerNANAhttp://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
Tubos de microfuga sin RNasa, 1,5 mLThermo Fisher ScientificAM12400
TrypLE Express Enzyme (1X), sin rojo fenolThermo Fisher Scientific12604013Solución de tripsina-EDTA
Solución neutralizante de tripsinaATCCPCS-999-004
Tripsina-EDTA para células primariasATCCPCS-999-003
UCSC Navegador del genoma, humano (GRCh38/hg38)NANA https://genome.ucsc.edu/

Referencias

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