Artículo de método
El presente artículo tiene como objetivo proporcionar protocolos detallados y adecuados para el aislamiento de hongos endófitos asociados a plantas, la preservación a largo plazo de aislados, la caracterización morfológica y la extracción de ADN total para su posterior identificación molecular y análisis metagenómicos.
Las plantas micoheterótrofas presentan una de las formas más extremas de dependencia micorrícica, habiendo perdido totalmente su capacidad autótrofa. Tan esencial como cualquier otro recurso vital, los hongos con los que estas plantas se asocian íntimamente son esenciales para ellas. De ahí que algunas de las técnicas más relevantes en el estudio de especies micoheterótrofas sean las que permiten la investigación de hongos asociados, especialmente aquellos que habitan en raíces y órganos subterráneos. En este contexto, se aplican comúnmente técnicas para identificar hongos endófitos dependientes e independientes del cultivo. El aislamiento de endófitos fúngicos proporciona un medio para identificarlos morfológicamente, analizar su diversidad y mantener los inóculos para aplicaciones en la germinación simbiótica de semillas de orquídeas. Sin embargo, se sabe que existe una gran variedad de hongos no cultivables que habitan en los tejidos vegetales. Por lo tanto, las técnicas de identificación molecular independientes del cultivo ofrecen una cobertura más amplia de la diversidad y abundancia de especies. El objetivo de este artículo es proporcionar el apoyo metodológico necesario para iniciar dos procedimientos de investigación: uno dependiente de la cultura y otro independiente. En cuanto al protocolo dependiente del cultivo, se detallan los procesos de recolección y mantenimiento de muestras de plantas desde los sitios de recolección hasta las instalaciones de laboratorio, junto con el aislamiento de hongos filamentosos de órganos subterráneos y aéreos de plantas micoheterótrofas, el mantenimiento de una colección de aislados, la caracterización morfológica de las hifas mediante la metodología de cultivo de portaobjetos y la identificación molecular de hongos mediante la extracción total de ADN. Abarcando metodologías independientes del cultivo, los procedimientos detallados incluyen la recolección de muestras de plantas para análisis metagenómicos y la extracción total de ADN de órganos de plantas aclorofílicas utilizando un kit comercial. Por último, también se sugieren protocolos de continuidad (p. ej., reacción en cadena de la polimerasa [PCR], secuenciación) para los análisis, y aquí se presentan técnicas.
Los hongos endófitos son, por definición, aquellos que habitan en el interior de los órganos y tejidos de las plantas en infecciones discretas (es decir, sin causar daño a su huésped)1,2. Estos hongos pueden interactuar de forma neutra o beneficiosa con las plantas hospederas, pueden conferir resistencia a patógenos y condiciones ambientales desfavorables, y pueden contribuir a la síntesis de compuestos beneficiosos para la planta (por ejemplo, factores de crecimiento y otras fitohormonas)1,3. Los endófitos micorrícicos son hongos que establecen asocia....
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1. Recogida de muestras de plantas
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En el protocolo de aislamiento, considerando que existe contaminación por el agua utilizada en el último lavado y que la contaminación también se detecta en las placas de Petri con fragmentos inoculados, se pueden tomar diferentes acciones, dependiendo del tipo de contaminante (Tabla 1). Este procedimiento debe repetirse desde el principio en caso de contaminantes fúngicos altamente esporulantes, que también presentan un crecimiento acelerado, y bacterias de multiplicació.......
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La desinfestación superficial de muestras de plantas es una de las etapas más críticas en el protocolo presentado. Es muy deseable que no se contaminen las antenas PDA con gotas del último lavado. Las bacterias se observan con frecuencia como contaminantes en las placas de aislamiento, generalmente más que los hongos esporulantes en el aire, considerando que las bacterias endófitas también son comunes dentro de los tejidos vegetales 3,11. Por lo tanto, la adición.......
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Los autores no tienen nada que revelar ni ningún conflicto de intereses.
Agradecemos el financiamiento de la FAPESP (2015/26479-6) y del CNPq (447453/2014-9). JLSM agradece al CNPq por las becas de productividad (303664/2020-7). El MPP agradece a la Capes (beca de maestría, proceso 88887.600591/2021-00) y al CNPq.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cinta | adhesiva (de cualquier empresa, para el montaje de cinta adhesiva en análisis micromorfológicos) | ||
| Ampicilina | Sigma-Aldrich | A5354 | (para la instalación de fragmentos de plantas; se pueden utilizar otros antibióticos - comprobar paso 2.2.1) |
| Autoclave | (de cualquier empresa, para la esterilización de materiales en muchos pasos) | ||
| Agar bacteriológico | Sigma-Aldrich | A1296 | (para muchos pasos) |
| Soluciones C1, C2, C3, C4, C5 y C6 | Qiagen | 12888-50 | (comprado con el kit DNeasy PowerSoil) |
| Centrífuga | Merck/Eppendorf | 5810 G | (para la extracción total de ADN a partir de aislados de hongos) |
| Tubos de centrífuga | Merck | CLS430828 | (para la recogida de muestras) |
| Cloroformo | Sigma-Aldrich | C2432 | (para la extracción total de ADN a partir de aislados de hongos) |
| Congo rojo | Supelco | 75768 | (para tinción de hifas) |
| Criotubos Merck | BR114831 | (para muchos pasos) | |
| Etanol | Supelco | 100983 | Será necesario realizar las diluciones adecuadas (para muchos pasos) |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | (para la extracción total de ADN de aislados de hongos)Papel de |
| filtro | Merck | WHA10010155 | (para muchos pasos) |
| Tubos de ensayo de vidrio | Merck | CLS7082516 | (para criopreservación en granos de arroz sin cáscara) |
| Lana de vidrio | Supelco | 20411 | (para la criopreservación en granos de arroz sin cáscara) |
| Glucosa | Sigma-Aldrich | G8270 | O dextrosa (para la criopreservación en vermiculita) |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | O glicerina (para la criopreservación en vermiculita, para la preparación de LPCB) |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | (para la extracción total de ADN de hongos aislados) |
| Ácido láctico | Sigma-Aldrich | 252476 | (para la preparación de LPCB - tinción de hifas) |
| Solución de azul de lactofenol (LPCB) | Sigma-Aldrich | 61335 | (para la tinción de hifas) |
| flujo laminar | (clase I, de cualquier empresa, para muchos pasos) | ||
| Microscopio | óptico(de cualquier empresa, para la observación de hifas) | ||
| MB Spin Columnas | Qiagen | 12888-50 | (adquiridas con el kit DNeasy PowerSoil) |
| Azul de metilo (azul algodón) | Sigma-Aldrich | M5528 | (para la preparación de LPCB - tinción de hifas) |
| Tubo de microcentrífuga (1,5 mL) | Merck | HS4323 | (para la extracción total de ADN de aislados de hongos) |
| Tubo de microcentrífuga (2 mL) | Merck | BR780546 | (para muchos pasos) |
| Aceite mineral | (para la conservación de aislados de hongos) | ||
| Bolsas | Tamaño medio 150 mm x 200 mm (para la recogida de muestras) | ||
| Placa de Petri (Vidrio, 120 mm x 20 mm) | Merck/Pyrex | SLW1480/10D | (esterilizable en autoclave, para el cultivo de hongos, preferir los más altos) |
| Placa de Petri (Vidrio, 50 mm x 17 mm) | Merck/Aldrich | Z740618 | (para la purificación de aislados de hongos); alternativamente: placas de Petri de poliestireno (estériles, γ-irradiadas, no esterilizables en autoclave) |
| Placa de Petri (Vidrio, 80 mm x 15 mm) | Merck/Brand | BR455732 | (para la instalación de fragmentos de plantas); alternativamente: placas de Petri de poliestireno (estériles, γ-irradiadas, no esterilizables en autoclave) |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | (para la extracción total de ADN de aislados de hongos, para la preparación de LPCB) |
| Porcelana mortero | Sigma-Aldrich | Z247464 | (para la extracción total de ADN de aislados de hongos) |
| Mortero de porcelana | Sigma-Aldrich | Z247502 | (para la extracción total de ADN de aislados de hongos) |
| Agar patata dextrosa (PDA) | Millipore | P2182 | (para muchos pasos) |
| Tubos PowerBead | Qiagen | 12888-50 | (comprado con el kit DNeasy PowerSoil) |
| Montaje rápido medio (Entellan) | Sigma-Aldrich | 1.0796 | para cultivo de hongos en portaobjetos) |
| Gel de sílice | Supelco | 717185 | (para la criopreservación en granos de arroz sin cáscara) |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | (para la extracción total de ADN de aislados de hongos) |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Lauril sulfato sal de sodio (para la extracción de ADN total de aislados de hongos) |
| Hipoclorito de sodio (con 2% de cloro activo) | (producto comercial, para la desinfestación superficial) | ||
| Kit de extracción de ADN en el suelo (DNeasy PowerSoil kit) | Qiagen | 12888-50 | (para la extracción total de ADN de los órganos de las plantas) |
| Espectrofotómetro - Nanodrop 2000/2000c | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | (para la extracción total de ADN de los órganos de las plantas) |
| Microscopio estereoscópico | (=microscopio de disección, de cualquier empresa, para análisis macromorfológicos) | ||
| Tetraciclina | Sigma-Aldrich | T7660 | (para la instalación de fragmentos de plantas) |
| Thermoblock | Merck/Eppendorf | EP5362000035 | (o de otras empresas) |
| Homogeneizador de tejidos y lyzer celular | SPEX SamplePrep | 2010 Geno/Grinder - Homogeneizador de tejidos automatizado y Cell Lyzer (para la extracción total de ADN de los órganos de las plantas) | |
| Azul de toluidina O | Sigma-Aldrich/Harleco | 364-M | (para la tinción de hifas) |
| Trehalosa | Sigma-Aldrich | T9531 | (para la criopreservación en vermiculita) |
| Tris Base Solution (Tris) | Sigma-Aldrich | T1699 | (para la extracción total de ADN de aislados de hongos) |
| Granos de arroz sin cáscara | (para criopreservación) | ||
| Sigma-Aldrich | Y1625 | (para la criopreservación en vermiculita) |
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Juliana Lishcka Sampaio Mayer
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Juliana Lischka Sampaio Mayer