Enriquecimiento de vesículas extracelulares nativas y recombinantes de micobacterias

Praapti Jayaswal; Mohd Ilyas; Kuljit Singh; Saurabh Kumar; Lovely Sisodiya; Sapna Jain; Rahul Mahlawat; Nishant Sharma; Vishal Gupta; Krishnamohan Atmakuri

doi:10.3791/65138

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Artículo de método

Enriquecimiento de vesículas extracelulares nativas y recombinantes de micobacterias

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DOI:

10.3791/65138

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8 de diciembre de 2023

Praapti Jayaswal¹ , Mohd Ilyas¹ , Kuljit Singh¹^,² , Saurabh Kumar¹^,³ , Lovely Sisodiya¹ , Sapna Jain¹ , Rahul Mahlawat¹ , Nishant Sharma¹^,⁴ , Vishal Gupta¹ , Krishnamohan Atmakuri¹

¹Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, ²Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, ³ICAR-Research Complex for Eastern Region, ⁴Public Health Research Institute, Rutgers University

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Resumen

Este protocolo detalla el enriquecimiento de vesículas extracelulares micobacterianas nativas (mEVs) de cultivos axénicos de Mycobacterium smegmatis (Msm) y cómo se pueden diseñar y enriquecer msmEVs recombinantes que contienen mCherry (un reportero fluorescente rojo). Por último, se verifica el novedoso enfoque con el enriquecimiento de MsmEVs que contienen la proteína EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Resumen

La mayoría de las bacterias, incluidas las micobacterias, generan vesículas extracelulares (VE). Dado que las VE bacterianas (bEV) contienen un subconjunto de componentes celulares, incluidos metabolitos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, varios grupos han evaluado las versiones nativas o recombinantes de las bEV por su potencia protectora como candidatas a vacunas de subunidades. A diferencia de los VE nativos, los VE recombinantes están diseñados molecularmente para contener uno o más inmunógenos de interés. A lo largo de la última década, diferentes grupos han explorado diversos enfoques para generar bEVs recombinantes. Sin embargo, aquí informamos sobre el diseño, la construcción y el enriquecimiento de las VE micobacterianas recombinantes (mEV) en micobacterias. Para ello, utilizamos Mycobacterium smegmatis (Msm), una micobacteria avirulenta del suelo como sistema modelo. En primer lugar, describimos la generación y el enriquecimiento de los vehículos eléctricos nativos de MSM. A continuación, describimos el diseño y la construcción de mEVs recombinantes que contienen mCherry, una proteína reportera fluorescente roja, o EsxA (Esat-6), un inmunógeno prominente de Mycobacterium tuberculosis. Logramos esto fusionando por separado mCherry y EsxA N-terminal con el extremo C-terminal de una pequeña proteína Msm Cfp-29. Cfp-29 es una de las pocas proteínas abundantemente presentes de MsmEVs. El protocolo para generar y enriquecer mEVs recombinantes a partir de Msm sigue siendo idéntico a la generación y enriquecimiento de EVs nativos de Msm.

Introducción

A pesar del desarrollo y la administración de una amplia gama de vacunas contra enfermedades infecciosas, incluso hasta el día de hoy, ~ 30% de todas las muertes humanas todavía ocurren por enfermedades transmisibles¹. Antes de la llegada de la vacuna contra la tuberculosis (TB) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - la tuberculosis era la principal causa de muerte (~10.000 a 15.000/100.000 habitantes)². Con la administración de BCG y el fácil acceso a medicamentos antituberculosos de primera y segunda línea, para 2022, las muertes relacionadas con la tuberculosis se han reducido drásticamente a ~ 1 millón/año para 2022 (es ....