Formulación y caracterización de nanodiscos que contienen agentes bioactivos

Summary

Aquí, describimos la producción y caracterización de agentes bioactivos que contienen nanodiscos. Los nanodiscos de anfotericina B se toman como ejemplo para describir el protocolo de manera gradual.

Abstract

El término nanodisco se refiere a un tipo discreto de nanopartícula compuesta por un lípido formador de bicapa, una proteína de andamio y un agente bioactivo integrado. Los nanodiscos están organizados como una bicapa lipídica en forma de disco cuyo perímetro está circunscrito por la proteína del andamio, generalmente un miembro de la familia de apolipoproteínas intercambiables. Numerosos agentes bioactivos hidrófobos se han solubilizado eficientemente en nanodiscos mediante su integración en el medio hidrofóbico de la bicapa lipídica de la partícula, produciendo una población en gran medida homogénea de partículas en el rango de 10-20 nm de diámetro. La formulación de nanodiscos requiere una proporción precisa de componentes individuales, una adición secuencial apropiada de cada componente, seguida de la sonicación en baño de la mezcla de formulación. La proteína del andamio anfipático contacta y reorganiza espontáneamente la bicapa dispersa formando una mezcla de lípidos / agentes bioactivos para formar una población discreta y homogénea de partículas de nanodiscos. Durante este proceso, la mezcla de reacción pasa de una apariencia opaca y turbia a una muestra clarificada que, cuando está completamente optimizada, no produce precipitado tras la centrifugación. Los estudios de caracterización implican la determinación de la eficiencia de solubilización del agente bioactivo, microscopía electrónica, cromatografía de filtración en gel, espectroscopia de absorbancia ultravioleta visible (UV / Vis) y / o espectroscopia de fluorescencia. Esto normalmente es seguido por una investigación de la actividad biológica utilizando células cultivadas o ratones. En el caso de los nanodiscos que albergan un antibiótico (es decir, el antibiótico polieno macrólido anfotericina B), se puede medir su capacidad para inhibir el crecimiento de levaduras u hongos en función de la concentración o el tiempo. La relativa facilidad de formulación, versatilidad con respecto a las partes componentes, tamaño de partícula a nanoescala, estabilidad inherente y solubilidad acuosa permite innumerables aplicaciones in vitro e in vivo de la tecnología de nanodiscos. En el presente artículo, describimos una metodología general para formular y caracterizar nanodiscos que contienen anfotericina B como agente bioactivo hidrófobo.

Introduction

Las lipoproteínas discoidales de alta densidad (HDL) nacientes son progenitores naturales del HDL esférico mucho más abundante presente en el sistema circulatorio humano. Estas partículas nacientes, también denominadas pre-ß HDL, poseen propiedades estructurales únicas y distintivas¹. De hecho, en lugar de existir como una partícula esferoidal, las HDL nacientes tienen forma de disco. Extensos estudios de caracterización estructural en HDL discoidales naturales y reconstituidas han revelado que están compuestas por una bicapa de fosfolípidos cuyo perímetro está circunscrito por una apolipoproteína anfipática intercambiable (apo), como apoA-I. E....

Protocol

1. Transformación, expresión y purificación del componente proteico del andamio

1. Transformación bacteriana BL21 con plásmido que contiene apoE4-NT
   1. Descongele un tubo de células competentes BL21 (DE3) en hielo durante 10 min.
   2. Una vez que todo el hielo se haya derretido, mezclar suave y cuidadosamente pipetear 50 μL de las células en un tubo de transformación sobre hielo.
   3. Añadir 5 μL que contengan 50 ng de ADN plásmido (para la secuencia, véase la Tabla suplementaria 1) a la mezcla celular. Mueva cuidadosamente el tubo cuatro o cinco veces para mezclar. No vorágice.
   4. Coloque la mezcla en h....

Results

Proceso de formulación de nanodiscos de agentes bioactivos
En el procedimiento de formulación de nanodiscos ampB descrito, la reacción se considera completa cuando la apariencia de la muestra pasa de turbia a clara (Figura 1). Este cambio indica que se han formado nanodiscos y que el agente bioactivo ha sido solubilizado. A menudo, los agentes bioactivos absorben la luz en la región de longitud de onda visible (por ejemplo, ampB, curcumina, luteína, coenzima Q₁₀

Discussion

La formulación de un agente bioactivo que contiene nanodiscos proporciona un método conveniente para solubilizar compuestos hidrófobos insolubles. Debido a que los nanodiscos de agentes bioactivos del producto son completamente solubles en medios acuosos, proporcionan un método de administración útil para una amplia gama de moléculas hidrófobas (Tabla 1). Estos incluyen moléculas pequeñas, drogas naturales y sintéticas, fitonutrientes, hormonas, etc. La estrategia de formulación generalmente sigue un pro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anfotericina B	Cayman Chemical Company	11636	ND Formulación & Preparación estándar
Ampicilina	Fisher Scientific	BP17925	Transformación & Expansión
ApoE4-NT Plásmido	GenScript	N/A	Transformación
Matraz deflector	New Brunswick Scientific	N/A	Expansión & Expresión
BL21 competente E coli New	England Biolabs	C2527I
Frascos de centrífuga de	Nalgene	3140-0250	Expresión
Cloroformo	Fisher Scientific	G607-4	ND Formulación
DMSO	Sigma Aldrich	472301	Prepartación estándar
Dimiristoilfosfatidilcolina	Avanti Lípidos	850345P	ND Formulación
Matraz Erlenmeyer	Bellco Biotechnology	N/A	Expansión & Expresión
Tubos Falcon	Sarstedt Ag & Co	D51588	Ensayo de viabilidad de levadura
Tubos de borosilicato de vidrio	VWR	47729-570	ND Formulación
GraphPad (software)	Dotmatics	N/A	Ensayo de viabilidad de levadura
Baño de sonicación calentado	VWR	N/A	ND Formulaton
Módulo de calentamiento y nitrógeno	Thermo Scientific	TS-18822	ND Formulación
HiTrap Heparina HP (5 mL)	GE Healthcare	17-0407-03	Purificación
de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido	Fisher Scientific	BP1755	Expresión
J-25 Centrífuga	Beckman Coulter	J325-IM-2	Expresión
JA-14 Rotor	Beckman Coulter	339247	Expresión
Liofilizador	Labconco 7755030		ND
Formulación Metanol	Fisher Scientific	A452-4	ND
Formulación Nitrógeno gaseoso	Praxair	UN1066	ND Formulación
NZCYM medios	RPI Productos de investigación	N7200-1000.0	Expansión & Expresión
Vector Pet-22B	GenScript	N/A	Transformación
Placa de Petri	Fisher Scientific	FB0875718	Transformación &
Cubetas de cuarzo	Fisher Brand	14385 928A	Incubadora de agitación de análisis espectral
	New Brunswick Scientific	M1344-0004	Transformación, expansión y
Expresión Slide-A-Lyzer boyas	Thermo Scientific	66430	Purificación
SnakeSkin tubo de diálisis	Thermo Scientific	68100	Purificación
SnakeSkin tubo de diálisis	Thermo Scientific	88243	purificación
cloruro de sodio	Fisher Scientific	S271	purificación
fosfato de sodio dibásico	Fisher Scientific	S374-500	Purificación
Fosfato de sodio monobásico	Fisher Scientific	BP329-500
Purificación Spectra/POR Tapones ponderados	Spectrum Medical Industries	132736
Espectrofotómetro	Shimadzu UV-1800	220-92961-01	análisis espectral
Centrífuga de mesa	Beckman Coulter	366816	ND Formulación
UVProbe 2.61 (Software)	Shimadzu	N/A	Análisis espectral
Filtro de vacío	Millipore	9004-70-0	Expression & Bomba
vacío	GAST Manufacturing Inc	DOA-P704-AA	Expression & Vórtice de purificación
	Fisher Scientific	12-812	ND Formulación
Levadura	N/A	BY4741	Ensayo de viabilidad de levadura
Extracto de levadura-Peptona-Dextrosa	BD	242820	Ensayo de viabilidad de levadura