Fabricación de micropartículas poliméricas pulsátiles que encapsulan el antígeno de la rabia

Resumen

Este método describe la encapsulación del antígeno de la rabia en micropartículas poliméricas biodegradables con propiedades estructurales y materiales que permiten la liberación pulsátil después de un retraso predeterminado. La evaluación del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) del antígeno recuperado del núcleo de la partícula confirma la presencia de glicoproteína intacta del virus de la rabia trimérica a través de la fabricación de partículas.

Resumen

Las directrices actuales para la profilaxis posterior a la exposición a la rabia requieren múltiples inyecciones administradas durante varias semanas. Esto puede ser desproporcionadamente oneroso para quienes viven en países de ingresos bajos y medianos (PIBM), donde se producen la mayoría de las exposiciones mortales a la rabia. Se han explorado diferentes estrategias de administración de fármacos para condensar los regímenes de vacunas en una sola inyección mediante la encapsulación de antígenos en partículas poliméricas. Sin embargo, los factores estresantes fuertes durante el proceso de encapsulación pueden causar la desnaturalización del antígeno encapsulado. Este artículo describe un método para encapsular el antígeno del virus de la rabia (RABV) en micropartículas poliméricas que exhiben liberación pulsátil sintonizable. Este método, denominado partículas uniformemente licuadas y selladas para encapsular fármacos (PULSED), genera micropartículas utilizando litografía blanda para crear moldes inversos de polidimetilsiloxano (PDMS) a partir de un molde maestro impreso en 3D con múltiples fotones. Las películas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) se moldean por compresión en los moldes PDMS para generar cilindros abiertos que se llenan con RABV concentrado utilizando un robot dispensador piezoeléctrico. Estas microestructuras se sellan calentando la parte superior de las partículas, permitiendo que el material fluya y forme una barrera polimérica continua y no porosa. Después de la fabricación, se utiliza un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) específico para la detección de glicoproteína intacta del virus trimérico de la rabia para confirmar la alta recuperación del antígeno inmunogénico de las micropartículas.

Introducción

La vacunación es una herramienta sanitaria extremadamente eficaz, ya que ha evitado más de 37 millones de muertes entre 2000 y 2019¹. A pesar de esta eficacia, las enfermedades prevenibles por vacunación siguen planteando un riesgo significativo para la salud mundial, especialmente en los países de ingresos bajos y medianos (PIBM), donde las altas tasas de vacunación insuficiente y no vacunada contribuyen a 1,5 millones de muertes prevenibles por vacunación al año². La rabia no es una excepción a estas disparidades. A pesar de su condición de la enfermedad más mortal conocida por la humanidad, siendo casi universalmente mortal, la rabia es totalmente tratable y está clasificada como erradicada en muchos países de altos ingresos. En cambio, la carga de la rabia es soportada desproporcionadamente por las personas que viven en partes de Asia y África, donde la enfermedad tiene resultados devastadores en los seres humanos y el ganado ^3,4.

La vacunación es fundamental para gestionar el impacto mundial de la rabia⁵. El costo de la vacunación prohíbe la implementación generalizada de la profilaxis previa a la exposición (PrEP), considerando la baja incidencia general de la enfermedad. Además, en los PIBM, la utilidad de la profilaxis posterior a la exposición (PEP) está limitada por las presiones socioeconómicas sobre los pacientes que buscan atención médica. Los factores logísticos, como la distancia de viaje a los puntos de acceso a la atención médica, la pérdida de salarios durante la recepción del tratamiento, el costo del tratamiento, las citas que interfieren con las actividades diarias y el olvido, resultan en tasas de adhesión a la PEP tan bajas como 60%^6,7. Esta alta tasa de deserción de pacientes presenta una oportunidad para refinar los enfoques para abordar las brechas en la vacunación contra la rabia con el fin de combatir la enfermedad.

Los sistemas de vacunación de inyección única (SI) que controlan la liberación de antígenos se han explorado como formas de obtener la inmunización completa en una sola inyección. Eliminar la necesidad de múltiples visitas a un proveedor de atención médica mitiga las cargas que impiden que las personas busquen la atención adecuada. Para lograr la vacunación contra el SI, un antígeno generalmente se encapsula dentro de una matriz polimérica biodegradable que a menudo toma la forma de micropartículas inyectables. Una vez inyectado, el polímero se degrada y libera el antígeno secuestrado. Hasta la fecha, se han seguido dos estrategias de liberación primaria para lograr la vacunación contra la IS. En un enfoque, el antígeno se libera continuamente durante un período prolongado de tiempo. Aunque está destinado a mejorar la inmunogenicidad de una sola inyección, no está claro si este enfoque es suficiente para provocar una respuesta inmune protectora contra el virus de la rabia (RABV) en humanos⁸. En el otro, el antígeno se libera después de un retraso predeterminado para imitar un régimen de vacuna de refuerzo convencional y probado. Los métodos de fabricación de micropartículas basados en el secado por atomización y la evaporación de emulsión/disolvente exhiben la estrategia anterior, y se han utilizado para encapsular con éxito tanto las vacunas modelo⁹ como los antígenos altamente estables, como el toxoide tetánico¹⁰. Sin embargo, estos métodos de encapsulación involucran factores estresantes, incluyendo calor, interacción con solventes y fuerzas físicas, que pueden desnaturalizar antígenos¹¹.

Las partículas uniformemente licuadas y selladas para encapsular medicamentos (PULSED) es un método de fabricación recientemente desarrollado que se puede emplear para encapsular productos biológicos en micropartículas biodegradables. El micromoldeo se utiliza para generar partículas que se llenan con una carga útil líquida y se calientan para permitir que el polímero refluya y encapsule completamente el depósito central de carga dentro de una capa contigua del polímero biodegradable. Esta microestructura da como resultado la liberación pulsátil de la carga útil, después de una duración que depende de la velocidad de degradación de la cubierta polimérica¹². Este manuscrito demuestra la encapsulación de RABV inactivado dentro de micropartículas compuestas de ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA), un polímero biodegradable utilizado en muchas formulaciones aprobadas por la FDA¹³, utilizando el método de fabricación PULSED para encapsular el antígeno RABV estable evaluado por un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Al combinar partículas de PLGA con diferentes pesos moleculares y / o grupos finales, este enfoque tiene el potencial de imitar el curso actual de vacunación contra la rabia después de una sola inyección.

Protocolo

1. Generación de moldes maestros de partículas

NOTA: El proceso de impresión 3D se puede realizar con cualquier impresora 3D con suficiente resolución espacial; sin embargo, el protocolo actual describe el proceso para una impresora 3D multifotónica.

1. Diseñe estructuras de micropartículas utilizando un programa de diseño asistido por computadora (CAD).
   NOTA: Las especificaciones de diseño son las siguientes: 308 partículas (diámetro = 400 μm, altura = 500 μm y espesor de pared = 100 μm) están dispuestas en una matriz de 22 por 14, con 600 μm de espacio entre ellas. El diseño también contiene una estrella de cuatro puntas y una estrella de cinco puntas como fiduciarios inmediatamente fuera de la matriz (Figura suplementaria 1).
2. Exporte el diseño final como un archivo STL (Supplementary Coding File 1) y cargue el archivo en un software capaz de definir los parámetros de impresión como se muestra a continuación. Luego, guárdelo como un archivo compatible con la impresora 3D (consulte Tabla de materiales).
   NOTA: Distancia de corte = 5 μm, distancia de rayado = 1 μm, contorno de la carcasa = 50 μm, recuento de cortes base = 5 μm, andamios = hueco, modo de escaneo = galvo, eje z = unidad z del microscopio, velocidad de escaneo = 100,000, potencia = 100.
3. Pre-tratar un sustrato de impresión de silicio (ver Tabla de materiales) usando un proceso de limpieza por plasma (gas: O₂; potencia: 200 vatios; temperatura: 25 °C; flujo: 20; tiempo: 5 min), luego sumergir inmediatamente el sustrato en una solución de 30 ml de etanol y 60 μl de 3-(trimetoxisilil) metacrilato de propilo en una placa de Petri de vidrio. Cubrir con papel de aluminio y dejar incubar durante la noche.
   NOTA: Este paso aumenta la adhesión de la impresión al sustrato, lo cual es importante durante la separación PDMS (paso 2.6).
4. Cargue el archivo de impresión en la impresora 3D multifotónica, aplique la resina de impresión al sustrato tratado, cargue la lente 10x (consulte Tabla de materiales) e imprima las microestructuras.
5. Una vez terminado, sumerja la impresión en acetato de éter metílico de propilenglicol (consulte la Tabla de materiales) durante 45 minutos para eliminar la fotorresistencia no expuesta, luego sumerja la impresión en alcohol isopropílico durante 5 minutos. Post-curado del molde maestro exponiéndolo a la luz UV a 254 nm durante 120 min.
   NOTA: Si está disponible, la luz UV en el rango de 405 a 365 nm se puede utilizar durante ~ 20 minutos para post-curar las estructuras impresas.

2. Generación de moho de polidimetilsiloxano (PDMS)

1. Trate la superficie del molde maestro impreso en 3D colocándolo en una cámara de vacío que contenga un portaobjetos de vidrio con 40 μL de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H, -perfluorooctil) (consulte la Tabla de materiales) silano agregado a la superficie. Tire del vacío (presión relativa: -20 in. Hg) durante 1 h.
   NOTA: Este paso garantiza una fácil separación al desmoldear (paso 2.6).
2. Mientras se trata la superficie del molde maestro, mezcle bien la base del prepolímero de polidimetilsiloxano (PDMS) con el agente de curado de prepolímero PDMS en una proporción de 9: 1 por masa (se necesitan al menos 10 g de material para cada molde maestro). Una vez bien mezclado, transfiera el PDMS sin curar a un tubo de centrífuga de 50 ml y centrifugar a 300 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
3. Una vez que se complete el tratamiento de la superficie, coloque el molde maestro en un plato de papel de aluminio y vierta el PDMS sin curar sobre el molde, asegurándose de que las características estén completamente sumergidas. Coloque el plato de papel de aluminio en una cámara de vacío y tire del vacío (presión relativa: -20 in. Hg) durante 1 h para eliminar las burbujas de aire.
4. Retire el plato de papel de aluminio de la cámara de vacío. Coloque espaciadores de 800 μm en los extremos del molde maestro y superponga un tobogán de vidrio limpio sobre el molde maestro, teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas de aire. Utilice clips aglutinantes para sujetar el molde y la corredera juntos, localizando la fuerza de sujeción sobre los espaciadores (Figura complementaria 2).
5. Coloque la estructura en un horno a 120 °C durante al menos 4 h para curar el prepolímero en moldes PDMS.
6. Retire la estructura del horno, suelte con cuidado los clips aglutinantes y separe cuidadosamente el molde maestro del molde PDMS curado con una cuchilla de afeitar.
   NOTA: El molde maestro impreso en 3D se puede reutilizar para generar moldes PDMS adicionales.

3. Fabricación de películas PLGA

1. Pesar 450 mg de PLGA (consulte la Tabla de materiales) y colóquelo en una lámina de polímero antiadherente de 76 mm por 76 mm dentro de una cuña de anillo de 250 μm de espesor, con un diámetro interior de 50,8 mm. Coloque una segunda lámina de polímero antiadherente sobre el PLGA y comprima la pila entre dos bloques de aluminio con una abrazadera C de 101,6 mm hasta que quede apretada con los dedos.
   NOTA: 502H PLGA se utilizó exclusivamente en este estudio; sin embargo, otros tipos de PLGA son compatibles con este proceso.
2. Coloque el conjunto con sujeción en C en un horno de vacío ajustado a 120 °C durante 30 minutos al vacío, con una presión relativa de -30 in.Hg. Luego, retire el conjunto y apriete firmemente la abrazadera antes de volver a colocarla en el horno de vacío durante otros 30 minutos.
   NOTA: El propósito principal de usar una aspiradora es evitar la degradación de PLGA, que se acelera a altas temperaturas.
3. Retire el conjunto del horno y déjelo enfriar durante 4 h en un desecador.
4. Una vez que esté fría, afloje la abrazadera, retire la película PLGA de las láminas de polímero antiadherente y coloque la película en una placa de Petri etiquetada. Guarde la placa de Petri dentro de un desecador para su uso posterior.

4. Generación de partículas PLGA

1. Trate la superficie del molde PDMS como se describió anteriormente en el paso 2.1.
2. Usando pinzas y/o un bisturí, corte y coloque una porción de la película PLGA de 250 μm, aproximadamente del tamaño de la matriz, en el molde PDMS tratado.
3. Superponga un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio sobre la película PLGA y el molde PDMS y sujete los componentes colocando una abrazadera de resorte directamente sobre la matriz y la película PLGA.
4. Coloque el conjunto de molde sujeto en el horno de vacío ajustado a 120 ° C y tire del vacío con una presión relativa de -30 pulgadas. Hg durante 1 h.
   NOTA: El tiempo necesario para formar las partículas depende del PLGA, y puede variar de 1 a 12 h.
5. Retire el conjunto de molde sujetado del horno y déjelo enfriar pasivamente a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos, o hasta que se enfríe al tacto.
6. Con una cuchilla de afeitar, aplique presión suavemente entre el molde PDMS y la matriz de partículas PLGA para separar los dos. Almacene las partículas de PLGA en un desecador para su uso futuro.

5. Concentración y purificación de antígenos

1. Descongele una alícuota del antígeno RABV disponible comercialmente (ver Tabla de materiales) a temperatura ambiente.
2. Ensamble la configuración de filtración colocando dos filtros centrífugos de centrifugado con un corte de peso molecular de 100 kDa (MWCO; consulte la Tabla de materiales) en dos tubos de recolección.
3. Prehumedezca los dos filtros centrífugos de centrifugado añadiendo 500 μL de agua UltraPure.
4. Haga girar los filtros a 2.400 x g durante 1 minuto en una centrífuga de sobremesa a temperatura ambiente.
5. Retire el agua de los compartimentos superior e inferior de la configuración de filtración utilizando una pipeta de 200 μL.
   NOTA: No deje que el filtro de centrifugado prehumedecido se seque.
6. Añadir 400 μL de agua destilada al compartimento superior de cada filtro de centrifugado, añadir a continuación 100 μL del antígeno RABV descongelado y mezclar con la pipeta.
   NOTA: Este estudio concentró el antígeno aproximadamente cinco veces y redujo la concentración de excipientes <100 kDa en ~ 50 veces.
7. Cargue los dos filtros centrífugos de centrifugado en una centrífuga de sobremesa, asegurándose de que los filtros miren hacia el centro de la centrífuga. Marque qué lado del filtro mira hacia el centro de la centrífuga.
   NOTA: Si se orientan incorrectamente, las soluciones no se filtrarán / concentrarán correctamente.
8. Centrifugar los filtros a 14.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
9. Recupere los filtros de la centrífuga. Los tubos de recolección contendrán el filtrado, mientras que los filtros contendrán la muestra concentrada (Figura complementaria 3A).
10. Retire el filtrado de los tubos de recogida con una pipeta y deséchelo.
11. Agregue 450 μL de agua destilada filtrada a cada filtro y mezcle la muestra concentrada y el agua pipeteando hacia arriba y hacia abajo seis veces.
12. Centrifugar los dos filtros de centrifugado por segunda vez a 14.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Asegúrese de que los filtros miran hacia el centro de la centrífuga en la misma orientación que en el paso 5.7.
13. Recupere las unidades filtrantes de la centrífuga y, al igual que antes, retire y deseche el filtrado de cada tubo con una pipeta.
14. Retire los filtros de centrifugado de los tubos de recogida y tape las carcasas del filtro utilizando la parte superior de los tubos de recogida (figura complementaria 3B).
15. Coloque la parte inferior de las carcasas del filtro de centrifugado directamente sobre un vórtice y un vórtice a 3.000 rpm durante 30 s mientras mantiene las carcasas del filtro en posición vertical y en ángulos de 45° (Figura complementaria 3C).
    NOTA: Este paso está destinado a resuspender cualquier antígeno RABV que formó un pellet durante el proceso de centrifugación.
16. Retire con cuidado la tapa de los tubos de recolección de las carcasas del filtro de centrifugado. Vuelva a colocar las carcasas del filtro en los tubos de recolección provistos y realice un giro rápido (2-3 s) para recoger cualquier volumen que pueda haber quedado atrapado en la tapa.
    NOTA: Este giro rápido debe realizarse en una microcentrífuga de sobremesa. Los filtros deben ser tangenciales a la centrífuga, opuestos a la configuración anterior, para garantizar que no se pierda solución a través de los filtros.
17. Invierta cada unidad de filtro de centrifugado en un nuevo tubo de recolección provisto con el kit de filtro de centrifugado (consulte la Tabla de materiales) y centrifugar durante 2 minutos a 1,000 x g a temperatura ambiente para recolectar las muestras concentradas.
18. Consolide las muestras concentradas de los dos tubos de recolección en un tubo de recolección. Mida y registre el volumen resultante.
    NOTA: La muestra resultante tendrá 5 veces la concentración inicial de antígeno que el stock, tendrá una pequeña concentración de excipiente (<100 kDa) aproximadamente 50 veces menor que el stock y aparecerá ligeramente blanca lechosa. El volumen total debe ser de aproximadamente 44-48 μL.
19. Conservar el antígeno concentrado lavado dos veces a 4 °C hasta el momento de la dispensación, pero no más de 16 h. Antes de llenar las partículas con esta solución, centrifugar el tubo a 1.000 x g durante 1 minuto para eliminar cualquier burbuja. La solución podrá diluirse con agua destilada para alcanzar la concentración nominal prevista para la dispensación.

6. Relleno de partículas

1. Filtre al vacío 500 ml de agua desionizada a través de un filtro de vacío de 0,22 μm, luego desgasifique la solución aplicando un vacío (presión relativa: -20 in. Hg) mientras estaba bajo sonicación durante 20 min.
2. Durante este tiempo, conecte los capilares de dispensación piezoeléctrica (PDC; consulte la Tabla de materiales) al dispensador piezoeléctrico.
3. Prepare la máquina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales) y coloque la diapositiva con las partículas de PLGA en el área de dispensación.
4. Configure "Buscar puntos de referencia de destino", Ejecutar y, a continuación, configure el "Sustrato de destino", de acuerdo con la Figura complementaria 4.
5. Cargue 25 μL del antígeno concentrado en la placa fuente y cárguelo en la máquina. Usando las PDC, aspire 10 μL de antígeno concentrado en la punta de dispensación, lave el exterior de la punta y luego calibre la alineación de dispensación (Figura complementaria 5).
6. Introduzca "Parámetros de configuración de destino" y haga clic en Ejecutar (Figura complementaria 6).
7. Una vez completado, retire las partículas llenas y verifique que estén llenas bajo un estereoscopio.
8. Vaya directamente al siguiente paso del protocolo.

7. Sellado y recolección de partículas

1. Coloque un bloque de acero inoxidable (consulte la Tabla de materiales) en una placa calefactora. Coloque dos portaobjetos de microscopio en el bloque de acero inoxidable para que queden paralelos. Asegúrese de que el bloque de acero inoxidable esté nivelado, luego encienda la placa calefactora y ajuste la temperatura para que la temperatura de la superficie del acero inoxidable sea de 200 ° C. Verifique la temperatura de la placa calefactora antes de sellarla.
2. Suspenda las partículas de PLGA llenas por encima de la placa calefactora colocándolas en los dos portaobjetos de vidrio y, a continuación, inicie inmediatamente un temporizador durante 18 s.
   NOTA: La cantidad de tiempo y partículas de calor necesarias para sellar variará dependiendo de las propiedades químicas del PLGA utilizado para hacer las partículas. Se puede usar un soporte de diapositivas impreso en 3D personalizado para manejar las diapositivas a una distancia segura de la placa calefactora. El archivo STL se proporciona como archivo de codificación suplementario 2.
3. Una vez sellada, retire la matriz de partículas de la placa calefactora y colóquela sobre el banco de laboratorio colocando la matriz de partículas en dos portaobjetos de vidrio separados. Deje que las partículas se enfríen durante 1 minuto.
4. Una vez enfriadas, las partículas se pueden cosechar usando un bisturí mientras se mira a través de un estereoscopio. Sostenga el bisturí con la cuchilla en un ángulo de 45° con respecto al portaobjetos y aplique presión a la base de la partícula para separarla del portaobjetos de vidrio.
5. Una vez cosechadas, use el bisturí para transferir las partículas a tubos de unión de 0,5 ml bajos en proteínas (consulte la Tabla de materiales). Luego, llene los tubos con 250 μL de una solución tampón fosfato (PBS) 1x que contenga 30 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) y 1 mg/ml de glucosa.
   NOTA: La solución de glucosa de 30 mg/ml de BSA y 1 mg/ml preparada en PBS mantendrá la estabilidad del antígeno RABV.
6. Aplaste las partículas bajo un estereoscopio usando un par de pinzas de punta fina. Asegúrese de que el antígeno RABV en el núcleo de la partícula esté disponible para disolverse en la solución circundante. Guarde las muestras en una nevera a 4 °C hasta que se pueda evaluar la potencia del antígeno mediante un ELISA. Las muestras deben ejecutarse en un ELSIA dentro de los 7 días posteriores a la preparación.

8. Evaluación del antígeno por ELISA

PRECAUCIÓN: No deje que las microplacas se sequen en ningún momento. Siempre apile los platos y siempre cubra la placa superior con un sello de plástico, un plato vacío o una tapa para evitar que se seque.

1. Prepare los búferes como se indica en el Archivo complementario 1.
2. Preparar 5 ml de solución de recubrimiento (tampón de carbonato-bicarbonato, pH 9.6) a una concentración de 2.5 μg/ml agregando 25 μL del anticuerpo de recubrimiento a 4975 μL de tampón de recubrimiento a pH 9.4-9.6.
   NOTA: Se necesitan 5 ml para recubrir 96 pocillos con 50 μL cada uno (con volumen adicional para la pérdida de pipeteo). Aumente el volumen total en 5 ml por cada placa ELISA adicional necesaria.
3. Utilice una pipeta multicanal para dispensar 50 μL de la solución de recubrimiento en cada pocillo de la microplaca. La solución debe usarse para el recubrimiento inmediatamente después de prepararla.
4. Golpee suavemente a lo largo de los bordes de la placa en una palma enguantada para asegurarse de que el fondo de cada pocillo esté cubierto uniformemente con líquido.
5. Selle la placa con una película adhesiva y colóquela a 37 °C durante 1 h, luego transfiérala a 4 °C durante la noche.
6. Recupere las placas de la cámara frigorífica y lávelas tres veces con 200 μL de tampón de lavado en cada pocillo.
7. Retire el tampón de lavado y dispense 300 μL de tampón de bloqueo en cada pocillo.
   PRECAUCIÓN: Cuando se repiten varias placas con las mismas muestras en diferentes placas, es importante proceder placa por placa (es decir, llenar la placa 1 con el material antes de proceder a la placa 2, y luego a la placa 3 y así sucesivamente). No aplique el material X a todas las placas y luego el material Y, etc., ya que esto aumentaría el riesgo de que los pozos se sequen. Después del paso final de lavado, el tampón de lavado debe permanecer en los pocillos de la placa y solo desecharse inmediatamente antes de agregar muestras a la placa. Se debe usar una tapa de placa de plástico de 96 pocillos para cubrir todos los pocillos de la placa ELISA que no se dispensan de inmediato, y la tapa se mueve secuencialmente para revelar pozos adicionales que se llenarán con material.
8. Selle las placas con una película plástica adhesiva (consulte la Tabla de materiales) y colóquelas en una incubadora durante 60 ± 5 min a 37 ± 2 °C.
9. Preparar la curva estándar y las muestras de ensayo que se evaluarán durante esta incubación.
   NOTA: El antígeno que se está evaluando debe diluirse previamente en tampón diluyente a una dilución recomendada de 0,125 UI/ml, con un exceso de volumen de al menos 40 μL para tener en cuenta la pérdida de pipeteo. Todas las muestras se evalúan por duplicado (dos réplicas técnicas) en cada placa ELISA. Para la curva estándar, se debe incluir una serie de dilución doble para un total de ocho puntos en las columnas 2 y 3 de cada placa ELISA. Se puede realizar una serie de dilución para todas las demás muestras con un número apropiado de puntos basado en la cantidad prevista de antígeno que se está evaluando. Aunque es menos riguroso para un mayor rendimiento, se puede utilizar una sola dilución de muestra como alternativa al recubrimiento descrito anteriormente. Sin embargo, la concentración esperada de una sola dilución debe estar dentro del rango de curva estándar.
10. En placas de proteína de bajo enlace de 96 pocillos, o tubos de proteína de baja unión (consulte la Tabla de materiales), realice una serie de dilución doble de cada muestra a lo largo de las columnas de la placa.
11. Cargue el inicio de la serie de dilución en la fila A para cada muestra respectiva al doble del volumen final requerido (por placa, se requieren 100 μL de muestra por pocillo, por lo que todos los pocillos en A2-A11 deben contener al menos 240 μL de una muestra, con un volumen adicional de 40 μL para tener en cuenta la pérdida de pipeteo).
12. Cargue 120 μL de tampón diluyente en todos los demás pocillos de la placa de proteína de baja unión, excluyendo las columnas 1 y 12 (es decir, B2 a H11).
13. Utilizando una pipeta multicanal cargada con 10 puntas, realice una dilución en serie transfiriendo 120 μL de muestra de A2-A11 a B2-B11 y pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar evitando salpicaduras y burbujas. Repita este proceso, moviéndose por la placa a lo largo de las columnas hasta los pozos H2-H11. Deseche el volumen restante de 120 μL aspirado de la última fila de pocillos.
    NOTA: Las muestras ya están listas para su análisis. Si la fase de bloqueo no se ha completado en este momento, asegúrese de que las muestras se mantengan en hielo.
14. Al final de la etapa de incubación, lave las placas tres veces con 200 μL de tampón de lavado.
15. Utilizando una pipeta multicanal, transfiera 100 μL de tampón diluyente a las columnas 1 y 12 como "espacios en blanco".
16. Usando una pipeta multicanal, transfiera 100 μL de cada pocillo de la placa de 96 pocillos de proteína de baja unión que contiene diluciones de muestra a la placa ELISA lavada. Repita el procedimiento para todas las placas ELISA que se estén ejecutando.
17. Selle las placas con una película plástica adhesiva y colóquelas en una incubadora durante 60 ± 5 min a 37 ± 2 °C.
18. Preparar la solución de anticuerpos de detección (ver Tabla de materiales) a una concentración de 0,2 μg/ml añadiendo 4,4 μL de la solución de anticuerpos a 10.995,6 μL del tampón diluyente y mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
    NOTA: Se necesita un total de 11 ml para 96 pozos de 100 μL cada uno (con volumen adicional para pérdidas de pipeteo). Aumente el volumen total en 11 ml por cada placa ELISA adicional que se evalúe. La solución debe utilizarse inmediatamente después de la preparación.
19. Al final de la etapa de incubación, lave las placas cinco veces con 200 μL de tampón de lavado.
20. Aspirar el tampón de lavado restante y dispensar 100 μL de la solución de anticuerpos de detección en cada pocillo de la microplaca utilizando una pipeta multicanal.
21. Selle las placas con una película plástica adhesiva y colóquelas en una incubadora durante 60 ± 5 min a 37 ± 2 °C.
22. Prepare el conjugado hacia el final de la etapa de incubación de anticuerpos de detección agregando 4.4 μL de solución conjugada de estreptavidina-peroxidasa (ver Tabla de materiales) a 10,995.6 μL de tampón de lavado.
    NOTA: Se necesita un total de 11 ml para 96 pocillos de 100 μL cada uno (con volumen adicional para pipeteo multicanal). Aumente el volumen total en 11 ml por cada placa ELISA adicional que se evalúe.
23. Lave las placas cinco veces con 200 μL de tampón de lavado.
24. Aspirar el tampón de lavado restante y dispensar 100 μL de la solución conjugada en cada pocillo.
25. Selle las placas con una película plástica adhesiva y colóquelas en una incubadora a 37 °C durante 60 ± 5 min a 37 ± 2 °C.
26. Prepare el sustrato durante el paso final de lavado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Para cada placa, disuelva una tableta de diclorhidrato de o-fenilendiamina (OPD; consulte la Tabla de materiales) en 9 ml de agua desionizada en la oscuridad, luego rellene con 1 ml de tampón de peróxido estable 10x. Ajustar el número de comprimidos y el volumen total de solución (10 ml) según el número de placas evaluadas.
27. Lave las placas cinco veces con 200 μL de tampón de lavado.
28. Dispensar 100 μL del sustrato a cada pocillo utilizando una pipeta multicanal.
29. Selle las placas con una película plástica adhesiva y déjelas en el banco durante 10-20 minutos, protegidas de la luz, utilizando papel de aluminio.
    NOTA: Supervise visualmente el desarrollo del color para evitar la saturación.
30. Añadir 50 μL de solución de parada a cada pocillo y la placa de lectura inmediatamente para una absorbancia a 492 nm y una absorbancia de referencia de 620 nm.
31. Analice los datos utilizando la lectura de absorbancia corregida (lectura a 492 nm menos la lectura a 620 nm) y reste el promedio del espacio en blanco de todas las muestras. Utilice un método de interpolación sigmoidal 4PL para convertir los valores de absorbancia a UI/ml. Finalmente, multiplique por los 250 μL (volumen total de la muestra) para convertir a UI.
    NOTA: Este análisis se puede realizar utilizando software de análisis de datos.

Resultados

El sellado y llenado de partículas son dos de los pasos más críticos en este protocolo. Las partículas se llenaron con sal de sodio fluoresceína para demostrar el llenado ideal y algunos errores comunes. Se utilizó sal de sodio fluoresceína en lugar del antígeno RABV para facilitar la visualización. Durante el llenado, es importante dispensar la solución en el fondo de los núcleos de partículas, luego dejar suficiente tiempo para que el solvente / agua se evapore. Una vez completado, un depósito del soluto permanece en el fondo del núcleo de la partícula (Figura 1A). Una vez lleno, es fundamental sellar las partículas correctamente. La Figura 1B muestra varios resultados (exitosos y no exitosos) del proceso de sellado. Después de 12 s de tiempo de sellado, queda una vía distinta desde el centro de la partícula hasta el exterior de la partícula, lo que demuestra una partícula que no está completamente sellada. Por el contrario, si se deja sellar durante 36 s, el PLGA se funde casi por completo, lo que resulta en una microestructura con un perfil poco profundo. La morfología ideal se puede visualizar cuando las partículas están selladas durante 18 y 24 s, ya que contienen carga completamente encapsulada por el polímero mientras mantienen una estructura de partícula. La Figura 1C muestra varios resultados potenciales después del llenado y sellado. Durante la dispensación, si el solvente no llega al fondo de la partícula, deja el soluto seco en el medio del núcleo de la partícula (relleno incorrectamente); Aunque estas partículas aún pueden sellarse, la carga deficiente de la carga puede limitar la eficiencia de carga. Si las partículas se llenan con demasiada carga (sobrellenadas), el proceso de sellado se inhibe, ya que la carga evita que el PLGA fluya sobre la abertura. Cuando se llenan y sellan correctamente, las partículas de esta geometría son lo suficientemente pequeñas como para caber fácilmente dentro de una aguja de 19 G. Además, 10 partículas fluyeron consistentemente a través de una aguja de 19 G (100% ± 0%) cuando se inyectaron con una solución viscosa como carboximetilcelulosa al 2% (Figura suplementaria 7).

Figura 1: Problemas comunes con el proceso de llenado y sellado . (A) Las imágenes muestran la evaporación del disolvente después de un ciclo de llenado, donde las partículas se cargan con 6 nL de sal de sodio fluoresceína de 100 mg / ml disuelta en agua. (B) Imágenes representativas de partículas de PLGA 502H eliminadas del proceso de sellado a los 0, 12, 18, 24 y 36 s. (C) Diferentes resultados del proceso de sellado cuando las partículas se llenan correctamente, incorrectamente o sobrellenadas. Las imágenes se generan apilando varias imágenes y fusionándolas utilizando el software de apilamiento de enfoque. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Procesar el antígeno a través de un filtro de espín antes de cargarlo en las partículas es importante por dos razones. En primer lugar, la centrifugación sirve para eliminar los excipientes madre en la solución de la vacuna, que pueden limitar la capacidad de carga de partículas mientras retienen el antígeno RABV. El protocolo actual purifica el antígeno aproximadamente 50 veces. En segundo lugar, el antígeno también se concentra durante este proceso. La Figura 2A muestra una micrografía de viriones RABV intactos en la muestra concentrada de antígeno. Este antígeno está aproximadamente 4,4 veces más concentrado que la solución madre inicial (Figura 2B). La cantidad de antígeno inicialmente cargado en los filtros centrífugos de centrifugado puede modificarse para modular la concentración de pliegue final alcanzada. Por ejemplo, la carga de 40 μL de antígeno madre da como resultado una concentración aproximada de 1,75 veces. La figura suplementaria 8 demuestra la importancia del vórtice (paso 5.15) en el proceso de concentración. Descuidar el vórtice o vortex incorrectamente las muestras limita el proceso de concentración.

Figura 2: Concentración de antígeno. La concentración de antígeno por filtración centrífuga mostrada por microscopía electrónica de transmisión (A) y confirmada por ELISA (B). Las barras de error indican la desviación estándar. El análisis estadístico se realiza utilizando las múltiples pruebas de comparación de Tukey con ANOVA unidireccional. **p < 0.01, ****p < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La figura 3A muestra el antígeno concentrado rellenado en partículas selladas y sin sellar. Aunque una cantidad significativa de antígeno se carga en las partículas (0,0469 ± 0,0086 UI), este material comprende el <90% de la capacidad de partículas, dejando un amplio espacio para la carga de antígeno adicional. Curiosamente, las partículas no selladas solo contienen 0.0396 ± 0.0077 UI, que comprenden solo el 85% ± el 16% de la cantidad total cargada. Aunque es una pérdida estadísticamente insignificante, parte del antígeno RABV puede haberse desnaturalizado durante la rehidratación y el secado repetidos en el proceso de llenado. Después del sellado, el 69% ± el 5% del antígeno permanece encapsulado en forma bioactiva. Aunque esto sugiere que se produce una pérdida significativa durante el proceso de sellado debido al estrés térmico, la mayor parte del antígeno viral inactivado permanece intacto (Figura 3B). La coencapsulación de excipientes estabilizadores junto con el antígeno es una posible estrategia para aumentar aún más la estabilidad del antígeno durante todo el proceso de fabricación, y anteriormente ha tenido éxito con otros antígenos de virus inactivados^14,15.

Figura 3: Antígeno RABV bioactivo después de la fabricación de partículas . (A) Las imágenes muestran partículas no selladas y selladas que contienen el antígeno RABV. (B) Estabilidad del antígeno a través del proceso de fabricación de partículas (n = 4). El control de carga se genera al dispensar el antígeno directamente en la solución. Las barras de error indican la desviación estándar. Barra de escala = 200 μm. El análisis estadístico se realiza utilizando las múltiples pruebas de comparación de Tukey con ANOVA unidireccional. *p < 0,05. Las imágenes se generan apilando varias imágenes y fusionándolas utilizando el software de apilamiento de enfoque. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Dimensiones de partículas, fiduciales y matrices. La figura muestra las propiedades geométricas de la estrella fiducial de cuatro puntas (A), la micropartícula cilíndrica (B), la estrella fiducial de cinco puntas (C) y una matriz de partículas con fiduciales (D) mostradas en el software CAD. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Esta figura muestra una sección transversal de la estructura colocada en el horno para curar moldes PDMS. Las flechas indican dónde se aplican las abrazaderas aglutinantes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Técnica adecuada para recuperar eficientemente antígeno concentrado. Al final del primer giro, la muestra concentrada marcada en rojo (A) se retiene en el filtro, mientras que el filtrado se recoge en el fondo del tubo de recolección (tubo exterior más grande). Para resuspender el antígeno granulado, la unidad de filtro centrífugo se tapa utilizando el tubo de recolección (B) en preparación para el vórtice. Al vortex, la punta del tubo se mantiene en contacto con la almohadilla de vórtice y el extremo de la tapa gira mientras se mantiene un ángulo de 45 ° con la almohadilla de vórtice (C). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: Dispensador piezoeléctrico de programación previa a la ejecución. (A) Configure la función "Buscar puntos de referencia de destino" navegando desde la "pestaña principal" a la función Configuración del robot > función >div. Miscelánea > Buscar puntos de referencia de destino. Utilice los botones resaltados en azul para establecer las marcas fiduciarias. Primero, seleccione Aprender plantilla y dibuje un cuadro alrededor de la marca fiduciaria de interés, verifique la precisión de la plantilla haciendo clic en Buscar plantilla y guarde la plantilla. Haga esto para las estrellas de cuatro y cinco puntas y guarde los nombres de archivo de acuerdo con las instrucciones en Usar dos imágenes de plantilla diferentes. A continuación, asegúrese de que todos los parámetros de las cajas negras coincidan. Cargue la estrella fiducial de cuatro puntas utilizando la plantilla de carga (cuadro verde). Guarde el programa "Buscar puntos de referencia de destino" seleccionando Lista de tareas (cuadro naranja). (B) Configure la opción Ejecutar navegando a la pestaña Configuración del robot > Tareas, luego cargue la secuencia de tareas que se muestra en el cuadro azul agregando tareas de la Lista de tareas (cuadro negro) utilizando las selecciones Tarea en ejecución (cuadro verde). Finalmente, guarde la tarea (cuadro naranja). (C) Configure el "Sustrato objetivo" navegando hasta la Configuración del robot > Sustrato objetivo, luego agregue un objetivo (cuadro azul). (D) Introduzca los parámetros que se muestran aquí y seleccione Guardar (cuadro azul). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 5: Carga del antígeno y calibración de la alineación de la desgastación. (A) Navegue hasta la pestaña Configuración de la boquilla > Tarea de tareas y aspire 10 μL del antígeno en la punta dispensadora seleccionando TakeProbe10 uL (caja negra) y haciendo clic en DO (caja negra). (B) Esto abre una ventana separada. Seleccione el pocillo en el que se cargó el antígeno concentrado y seleccione OK (cuadro azul). (C) Después de que el antígeno haya sido aspirado, lave la punta seleccionando la caja azul y repita este lavado dos veces más. Seleccione la cámara (caja negra) y determine el volumen de caída seleccionando el volumen de caída (caja verde). Asegúrese de que se está formando una caída estable con una desviación estándar de volumen (%) <2 (caja naranja). (D) Siguiendo estos pasos se abrirá la Snap Drop Cam; seleccione Imagen (cuadro azul) en el menú desplegable y seleccione Nozzle Head Camera Wizard (Asistente para cámara de cabeza de boquilla). Esto abre una nueva ventana. Realice la siguiente secuencia de pasos rápidamente. (E) Asegúrese de que el objetivo establecido en la Figura suplementaria 4 esté cargado, luego seleccione Mover al destino (cuadro azul). Ajuste las gotas a 15 y seleccione Spot (caja negra). Una vez detectado, seleccione inmediatamente Mover (cuadro verde). Asegúrese de que la opción Búsqueda automática esté seleccionada y elimine el tamaño de partícula = 12, luego haga clic en Inicio (cuadros naranjas). Si la detección automática falla, repita este proceso después de moverse a un área diferente en la diapositiva (cuadro púrpura). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 6: Programación de la matriz de detección y comienzo de la ejecución. (A) Desplácese hasta la configuración del destino > destino, luego complete los parámetros que se muestran en el cuadro azul. (B) A continuación, navegue hasta la pestaña "Configuración de campo" e ingrese 20 en el no. del campo Gotas (cuadro azul), seleccione un pocillo (cuadro negro) y, a continuación, seleccione los objetivos/partículas en los que desea dispensar (cuadro verde). Al seleccionar un pozo diferente y volver a seleccionar los objetivos / partículas, se realizan ciclos de llenado adicionales durante una sola ejecución. (C) En la pantalla principal, asegúrese de que la ejecución y el destino creados en la Figura complementaria 5 estén seleccionados. (D) Navegue hasta la pestaña "Ejecutar" y seleccione Iniciar ejecución (cuadro azul). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 7: Inyectabilidad de micropartículas. (A-C) Imágenes estereoscópicas apiladas de enfoque de micropartículas llenas de sal de fluoresceína sódica y selladas en una aguja de 19 G. (D) Se inyectaron un total de 10 partículas a través de una aguja de 19 G utilizando una solución de carboximetilcelulosa al 2% (n = 8). Barra de escala = 1 mm. Las barras de error indican la desviación estándar. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 8: Problemas potenciales con la concentración de antígenos. La línea roja indica el aumento esperado del pliegue en la concentración. Las barras de error indican la desviación estándar. El análisis estadístico se realizó utilizando las múltiples pruebas de comparación de Tukey con ANOVA unidireccional. p < 0,001, ****p < 0,0001. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1: Preparación de tampones y soluciones para RABV ELISA. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 1: archivo STL que contiene matriz de partículas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación complementaria 2: archivo STL que contiene geometría para el portaportaobjetos personalizado utilizado para sellar partículas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Es posible alterar la geometría de las partículas para necesidades específicas; Sin embargo, para estructuras cilíndricas, los autores recomiendan mantener una relación 5:4:1 de la altura:diámetro:espesor de pared descrita en el protocolo. Esta relación de aspecto garantiza que haya suficiente material PLGA presente para sellar las partículas y permanecer mecánicamente lo suficientemente robusto para su manipulación. Las dimensiones y formas de las partículas se pueden alterar fácilmente durante el proceso CAD, lo que permite generar una gran cantidad de geometrías. La combinación de la flexibilidad del CAD con la impresión 3D permite la rápida iteración de diseños de micropartículas. Aunque este protocolo utiliza una impresora 3D multifotónica, cualquier impresora 3D con especificaciones capaces de imprimir las dimensiones de la microestructura en un material apropiado se puede utilizar para generar el molde maestro inicial. Además, la fotolitografía se ha utilizado previamente para hacer estructuras similares en matrices mucho más grandes que las producidas en este protocolo; Sin embargo, la mano de obra, el retraso en el pedido de fotomáscaras hechas a medida y la accesibilidad del equipo ralentizarían el proceso de diseño iterativo¹⁶. Finalmente, la generación de moldes maestros puede subcontratarse a empresas de pago por servicio si la fabricación interna de moldes maestros no es factible. Independientemente de la impresora 3D o el método utilizado para generar los moldes maestros, la adhesión de la impresión al sustrato es fundamental para los pasos posteriores. Específicamente, si la adhesión es inadecuada durante la generación del molde PDMS, las partículas impresas permanecerán alojadas en el molde PDMS, lo que requerirá la eliminación manual de las partículas impresas y la destrucción del molde maestro.

El llenado de partículas es otro aspecto crítico a considerar. Las micropartículas tienen capacidades de llenado limitadas, por lo que la filtración se utiliza no solo para concentrar el antígeno RABV, sino también para eliminar excipientes de stock que de otro modo ocuparían una gran parte del volumen del núcleo de micropartículas. Sin embargo, dado el gran tamaño del antígeno RABV (aproximadamente 60 nm por 180 nm)¹⁷, es posible eliminar parcialmente el antígeno durante las etapas de centrifugación. Por esta razón, es importante resuspender el antígeno mediante pipeteo o vórtice después de la centrifugación para lograr una alta recuperación del antígeno RABV. Una solución altamente concentrada es ideal para la dispensación, ya que reduce los ciclos de dosificación y, por lo tanto, limita la degradación del antígeno durante el llenado. Sin embargo, la viscosidad es una limitación importante de los robots dispensadores piezoeléctricos que forman una gota estable, por lo que dispensar una solución de muy alta concentración puede no ser posible o aconsejable. Diluir la solución de llenado es la forma más fácil de lograr una formación de gota estable, pero se debe considerar la estabilidad del antígeno durante los ciclos de llenado adicionales necesarios para lograr la carga deseada y la mayor cantidad de tiempo requerido para llenar las partículas.

Limitaciones
Este método requiere equipos altamente especializados para producir los moldes iniciales y un instrumento de llenado especializado para la producción de micropartículas. Aunque la necesidad de una impresora 3D con una resolución de impresión capaz de generar los moldes maestros iniciales puede ser subvertida por un enfoque de pago por servicio, la accesibilidad a un robot dispensador piezoeléctrico es limitante. La adquisición de un robot dispensador piezoeléctrico requiere una inversión inicial significativa, a menudo en el rango de $ 80,000 a $ 200,000, dependiendo de la marca, el rendimiento y las capacidades. Aunque varios otros métodos de llenado son alternativas potenciales, estos métodos no han sido validados utilizando el antígeno RABV¹².

Aplicaciones futuras
Una proporción sustancial del antígeno RABV encapsulado permaneció estable durante el proceso de sellado. En teoría, al incorporar este antígeno en partículas compuestas de diferentes tipos de PLGA que imitan la línea de tiempo de administración del tratamiento profiláctico posterior a la exposición, todas las dosis podrían administrarse en una sola inyección. Eliminar la necesidad de repetir las visitas al hospital para administrar dosis adicionales mejorará el cumplimiento del paciente, lo que resultará en mejores resultados del tratamiento. Además, habiendo demostrado la capacidad de retener la reactividad ELISA del virus de la rabia inactivado altamente complejo, es probable que otros antígenos, incluidas las vacunas de subunidades, sean compatibles con este método de encapsulación. El uso de otros antígenos profilácticos con micropartículas PULSADAS podría salvar millones de vidas en los PIBM al aumentar las tasas de vacunación de las poblaciones insuficientemente vacunadas. Sin embargo, para lograr esto, las vacunas deben permanecer estables no solo a través de la encapsulación sino también de la liberación, lo que puede ser un desafío ya que la carga útil estará sujeta a temperaturas elevadas y un microambiente potencialmente ácido debido al calor corporal y los productos de degradación de PLGA¹⁸. El trabajo futuro buscará estrategias de estabilización del antígeno a través de la liberación, lo que abriría el potencial para una plataforma de vacunación de inyección única que sea ampliamente aplicable para prevenir muchas enfermedades infecciosas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 y micro; m Filtro PES	Cole-Parmer+B4B2:B63	04396-26
0.25 mm Calzas	McMaster Carr	98090A935
0.75 pulgadas Clips de carpeta	Grapas	480114
10 mL Jeringa	Becton, Dickinson and Company	309604
10 mL  Pipetas serológicas desechables de poliestireno estéril con raya de lupa	Fisherbrand	13-678-11E
101.6 mm C-Clamp	Amazon	PT-SD-CP01A	El mango negro eventualmente se caerá. Use alicates para ajustar una vez que esto suceda.
aguja de 19 g	EXCELINT	26438
25 mL  Pipetas serológicas desechables de poliestireno estéril con raya de lupa	Fisherbrand	13-678-11
3-(trimetoxisilil) metacrilato de propilo	Millipore Sigma	M6514-25ML
5 mL  Pipetas serológicas desechables de poliestireno estéril con raya de lupa	Eppendorf	22431081
50 mL Tubos de centrífuga	Corning
50 mL  Pipetas serológicas desechables de poliestireno estéril con raya de lupa	Fisherbrand	13-678-11F
Bloque de aluminio
Papel de aluminio	VWR	89079-069
Filtros centrífugos Amicon Ultra 0,5 mL, 100 kDa	Millipore Sigma	C82301
Anticuerpo antirrábico contra el virus de la rabia, anticuerpo sin suero, clon 1112-1, 100	Fisherbrand	13-678-11D
Anticuerpo monoclonal contra el virus de la rabia para ratones, clon D1-25, biotinilado	Fisherbrand	14-388-100
carboximetilcelulosa	Tokyo Chemical Industries	C0045
ClipTip 300, filtro, bastidor	Fisherbrand	13-678-11
Costar 0.65 mL Tubo de microcentrífuga de tapa a presión de baja unión Corning		3206
Costar 1.7 mL Tubo de microcentrífuga con tapa a presión de baja ligación	, Corning	3207
Describir	Nanoscribe		El software utilizado para definir los parámetros de impresión de la impresora 3D Nanoscribe es el paso 1.2. Software proporcionado con la impresora.
Desecador	Fisher Scientific	10529901	o equivalente
Grapas	de cinta adhesiva de doble cara	649280
DPBS (10x), sin calcio, sin magnesio	Gibco	14200075
etanol	VWR	89370-084
F1-ClipTip Pipetas multicanal, de 30 a 300 y micro; L	Fisherbrand	13-678-11E
Fisherbrand SureOne Puntas de pipeta de barrera contra aerosoles, 0.1 – 10 µ L	Fisherbrand	13-678-11F
Fisherbrand SureOne Puntas de pipeta de barrera de aerosol, 100 – 1000 µ L	Fisherbrand	03-448-17
Fisherbrand SureOne Puntas de pipeta de barrera de aerosol, 2 – 20 µ L	Fisherbrand	FB14955202
Fisherbrand SureOne Puntas de pipeta de barrera de aerosol, 20 – 200 µ L	Fisherbrand	13-374-10
Fisherbrand  Kit de pipetas Elite	Fisherbrand	05-408-137
Fisherbrand  Controlador de pipetas	Fisherbrand	FB14955202
Placa de Petri de vidrio, 90 mm	VWR	470313-346
Portaobjetos de vidrio	Globe Scientific	1380-10
Helicon Focus 8	HeliconSoft		Software utilizado para enfocar imágenes de pila
IP-Q Resina	Nanoscribe		La resina de la impresora es compatible con la lente 10x y se utiliza para imprimir microestructuras grandes en el Nanoscribe Photonic Professional GT2
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermopair	Amazon	5053485896236	O equivalente
Caja de portaobjetos de microscopio	Millipore Sigma	Z374385-1EA	O equivalente
Nanoscribe Fotónico Profesional GT2 con objetivo 10X	Nanoscribe
NanoWrite	Nanoscribe		Software utilizado para interactuar con la impresora 3D nanoscrive. Software proporcionado con la impresora.
Nunc MaxiSorp Placa de fondo plano de 96 pocillos	Invitrogen	44-2404-21
OPD Tabletas de sustrato (o-fenilendiamina diclorhidrato)	Fisherbrand	02-707-432
Parafilm M Película de envoltura, 4 pulg.	Fisherbrand	13-374-10
PDC 60 con recubrimiento tipo 3	Scienion	P-2020
PDMS Moldes de partículas	Rice University	n/a	N/A- Las partículas son 400 μ m de diámetro con un espesor de pared de 100 μ m, y una altura de 500 μ m, lo que da como resultado un diámetro interior de 200 μm. Las matrices son de 14 x 22 partículas espaciadas 600 μ m separados unos de otros. Las estrellas de 4 y 5 puntas se utilizan como fiduciales, colocadas 600 μ m a la derecha y a la izquierda de las partículas superior derecha y superior izquierda de la matriz.
Placa de Petri	Fisher Scientific	08-757-100D
Pierce Tampón de sustrato de peróxido estable (10x)	Fisherbrand	02-707-430
Vasos de plástico	Fisher Scientific	S04170
Película PLGA, 502H	Sigma	502H: 719897-1G
Acetato de éter monometílico de propilenglicol	Millipore Sigma	484431
Rabies Antigen	Chiron Behring y Bharat Biotech International		Material fue adquirida mediante la celebración de un acuerdo de transferencia de materiales con la empresa.
Hojas de afeitar	VWR	55411-050
Bisturí	VWR	21899-530 y 76457-512
SciFLEXARRAYER S3 con PCD 60	Scienion		o equivalente
Cinta de sellado para placas de 96 pocillos	Thermo Scientific	15036
Oblea de silicio	University Wafer	1025
Abrazaderas de resorte	IRWIN
Bloque de acero inoxidable	McMaster Carr	9083K12
Estreptavidina− Polímero de peroxidasa, ultrasensible	Fisherbrand	02-707-404
Sylgard 184	DOW	2646340
Lámina de teflón	McMaster Carr	9266K12	Se utiliza para fabricar películas PLGA. Debe cortarse en trozos del tamaño adecuado.
Lámina de teflón, 0,8 mm de espesor	McMaster Carr	9266K81
Tricloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silano	Sigma	448931-10G
Pinzas	Pixnor	ESD-16
UltraPure Distilled	Water Fisher Scientific	10977015
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker	UVP	95-0174-01	O
equivalente Desecador	de vacío Bel-Art F420100000		Tenga en cuenta que necesitará dos de estos. Uno se utilizará exclusivamente para pretratar muestras con tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silano para evitar la contaminación.
Horno de vacío capaz de alcanzar 120 ° C	VWR	97027-664	O equivalente
Aspiradora, CRVpro4	Welch	3041-01	O equivalente
Depresores de lengua de madera	Ciencias de la microscopía electrónica	72320