Instilación intratraqueal no invasiva de lipopolisacáridos en ratones

La lesión pulmonar aguda (LPA) es un síndrome clínico común. Bajo una variedad de factores patógenos, la ruptura de la barrera fisiológica de las células epiteliales pulmonares y las células endoteliales vasculares conduce a un aumento de la permeabilidad alveolar, causando así disminución de la distensibilidad pulmonar, edema pulmonar e hipoxemia grave¹. El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) es la forma más grave de LPA. La inflamación incontrolada y el daño por estrés oxidativo se consideran las principales causas de ALI y el SDRA más grave². Cuando las células epiteliales alveolares se lesionan directamente debido a un traumatismo, se activa la cadena de respuesta inflamatoria de los macrófagos alveolares, lo que lleva a la inflamación en el pulmón³. A nivel mundial, hay más de 3 millones de pacientes con SDRA agudo por año, y representan aproximadamente el 10% de los ingresos en la unidad de cuidados intensivos; Además, la tasa de mortalidad en casos graves es tan alta como 46%^4,5,6. Por lo tanto, existe la necesidad de establecer un modelo animal adecuado de ALI para estudiar su patogénesis. El ratón es el animal experimental más utilizado en el estudio de la ALI, ya que su tracto respiratorio puede simular bien el tracto respiratorio humano para estudios de ALI. Además, ALI se manifiesta como infiltración masiva de células inflamatorias, aumento de la permeabilidad vascular pulmonar y edema pulmonar. Los cambios en las citocinas inflamatorias en suero y la relación pulmón peso seco-húmedo reflejan el grado de ALI⁷.

En la actualidad, los principales métodos para modelar la ALI inducida por LPS en ratones incluyen la intubación traqueal intranasal y quirúrgica ^8,9. Aquí, proponemos un nuevo método para administrar LPS en la tráquea a través de la intubación orofaríngea no invasiva. Este método utiliza un intubador iluminado para encontrar la tráquea del ratón y luego administra LPS en la tráquea y el pulmón. Este método administra LPS a los pulmones con mayor precisión que el método de administración intranasal. En comparación con la intubación traqueal quirúrgica, este método no requiere cirugía, evita causar heridas y reduce el dolor en ratones¹⁰. Por lo tanto, este método se puede utilizar para establecer un modelo de ratón más convincente de ALI.

El protocolo de experimentación con animales fue revisado y aprobado por el Comité de Gestión de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Registro No. 2021-11). Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57/BL (20-25 g, 6-8 semanas de edad). Los ratones se mantuvieron en una cámara de animales y fueron libres de beber y comer durante el experimento.

1. Preparación

1. Asegúrese de que la plataforma de intubación consista en una base, un elevador, un clip, dos bandas elásticas y algunas cuerdas. Tome una cuerda, pase la cuerda a través de los dos orificios en la parte superior del elevador y ate los dos extremos de la cuerda, respectivamente, a las pequeñas protuberancias en la parte superior del elevador.
   NOTA: Deje espacio para que la cabeza del ratón pase entre la cuerda y los dos agujeros.
2. Ate dos bandas elásticas a cada extremo del clip y pegue el clip con las bandas elásticas en la parte posterior del elevador. Finalmente, fije el elevador a la base a 90° (Figura 1).
3. Seleccione una cánula del tamaño y la longitud adecuados. Para un ratón de 20-30 g, se puede usar un catéter de 22 G (2.5-3.8 cm de largo)¹¹. Ensamble la cánula en un bolígrafo de cánula y encienda la luz de la pluma (Figura 2).
4. Prepare pequeños fórceps quirúrgicos y una pipeta Pasteur desinfectándolos con alcohol al 70%.

2. Preparación del compuesto problema

1. Pesar y disolver 3 mg de LPS en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.2) para formar una solución de LPS con una concentración de 3 mg/ml.
2. Pesar y disolver 10 mg de pentobarbital sódico en 1 ml de solución salina normal para formar una solución de pentobarbital sódico al 1%. Filtre y esterilice la solución con un filtro de jeringa de 0,45 μm.

3. Instilación orofaríngea no invasiva

1. Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% a una dosis de 50 mg/kg^12,13. Determinar la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta al reflejo de enderezamiento.
2. Coloque el ratón anestesiado en la plataforma de intubación. Fije los dientes frontales superiores con el hilo y los dos antepiés con las bandas elásticas (Figura 3).
3. Saque la lengua con pinzas y sosténgala con la mano izquierda. Empuje la cánula lentamente, a lo largo de la boca, con la mano derecha hacia arriba, hacia la epiglotis. Use la luz de la pluma de la cánula para encontrar la tráquea e insértela lentamente en la tráquea (Figura 4).
4. Después de insertar la cánula en la tráquea, retire la pluma de intubación lentamente y deje la cánula dentro. Inserte la pipeta Pasteur en la junta de la cánula y presione el cabezal (figura 5).
   NOTA: Si el pecho del ratón sobresale, entonces la intubación es exitosa (Figura 6).
5. Después de una intubación endotraqueal exitosa, instilar a los ratones 3 mg/ml de LPS a 3 mg/kg a través de la cánula utilizando una microjeringa de cabeza plana^14,15 (Figura 7).
6. Una vez hecho esto, retire la cánula y la microjeringa. Retire el ratón del andamio y colóquelo en una jaula por separado para recuperarse. Observar el estado respiratorio del ratón hasta que se haya recuperado y recuperado la conciencia.
   NOTA: A las 12 h después de la instilación traqueal de LPS, eutanasia a los ratones siguiendo el procedimiento aprobado por el comité de ética animal. Los ensayos séricos de TNF-α y las mediciones de peso pulmonar seco-húmedo se realizaron mediante procedimientos estándar.

El método propuesto para la instilación de LPS en ratones se verificó evaluando la expresión de la citoquina inflamatoria TNF-α y la relación de peso seco-húmedo del pulmón 12 h después de la instilación de LPS. Hubo cuatro grupos en el experimento: control en blanco (sin ningún tratamiento), intubación quirúrgica16, intranasal17,18 e intubación orofaríngea no invasiva (n = 6). En comparación con el grupo control en blanco, los niveles séricos de TNF-α en el grupo de intubación orofaríngea no invasiva aumentaron significativamente (Figura 8A). La relación pulmón peso seco-húmedo también aumentó (Figura 8B), alcanzando el mismo nivel que en el grupo de intubación traqueal quirúrgica. Los conjuntos de datos se analizaron estadísticamente con un ANOVA no apareado y pruebas post-hoc de comparaciones múltiples de Tukey Kramer. Todos los datos se presentan como media ± SEM, y un nivel de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Figura 1: Accesorios y montaje de la plataforma de intubación. La plataforma consta de una base, un elevador, un clip, dos bandas de goma y algunas cuerdas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Kit de intubación. Esta figura muestra el kit de intubación y su montaje. Esto incluye una lámpara de lápiz, una fibra óptica y una cánula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Fijación del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Localización de la tráquea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Verificación de la bomba de pipeta Pasteur. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Imagen de antes y después del tórax que muestra una intubación exitosa. (A) Tórax antes de la intubación. (B) Tórax después de la intubación; El área que muestra el abultamiento del pecho está marcada con un círculo rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Micromuestreador de cabeza plana para la entrega de LPS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Evaluación de la validez de la instilación no invasiva de LPS . (A) Expresión de TNF-α en el suero de ratones C57BL/6 12 h después de una inyección endotraqueal de LPS. (B) Análisis de datos de la relación tejido pulmonar en peso seco-húmedo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.