El presente protocolo prepara y evalúa las propiedades físicas, la respuesta inmune y el efecto protector in vivo de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión.
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Artículo de método
Evaluación de la respuesta inmune de una vacuna adyuvante de nanoemulsión contra la infección por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM)
En este artículo
Resumen
Resumen
Las vacunas adyuvantes de nanoemulsión han atraído una gran atención debido a su pequeño tamaño de partícula, alta estabilidad térmica y capacidad para inducir respuestas inmunes válidas. Sin embargo, establecer una serie de protocolos integrales para evaluar la respuesta inmune de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión es vital. Por lo tanto, este artículo presenta un procedimiento riguroso para determinar las características fisicoquímicas de una vacuna (por microscopía electrónica de transmisión [TEM], microscopía de fuerza atómica [AFM] y dispersión dinámica de luz [DLS]), la estabilidad del antígeno y el sistema de la vacuna (mediante una prueba de centrífuga de alta velocidad, una prueba de estabilidad termodinámica, SDS-PAGE y western blot), y la respuesta inmune específica (IgG1, IgG2a e IgG2b). Usando este enfoque, los investigadores pueden evaluar con precisión el efecto protector de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión en un modelo letal MRSA252 ratón. Con estos protocolos, se puede identificar el adyuvante de vacuna de nanoemulsión más prometedor en términos de potencial adyuvante efectivo. Además, los métodos pueden ayudar a optimizar nuevas vacunas para el desarrollo futuro.
Introducción
El Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) es un patógeno oportunista con una de las tasas de infección más altas en una unidad de cuidados intensivos (UCI) salas1, departamentos de cardiología y departamentos de quemaduras en todo el mundo. El SARM exhibe altas tasas de infección, mortalidad y amplia resistencia a los medicamentos, presentando grandes dificultades en el tratamiento clínico2. En la Lista de prioridad mundial de bacterias resistentes a los antibióticos publicada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 2017, MRSA se incluyó en la categoría3 más crít....
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Protocolo
Los experimentos con animales se realizaron con base en el manual sobre el uso y cuidado de animales de experimentación y fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de los Animales de Laboratorio de la Tercera Universidad Médica Militar. Para el presente estudio se utilizaron ratones Balb/c hembra, de 6 a 8 semanas de edad. Los animales fueron obtenidos de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación de la proteína antígeno MRSA HI
- Obtener clones de IsdB y Hla de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales), realizar amplificación de la reacción en cadena de la polimeras....
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Resultados
Se evaluó el protocolo para la preparación de la vacuna adyuvante de nanoemulsión y las pruebas in vitro e in vivo de esta vacuna. Se utilizaron TEM, AFM y DLS para determinar las características importantes del potencial zeta y el tamaño de partícula en la superficie de esta muestra (Figura 1). SDS-PAGE y western blotting mostraron que la cantidad de antígeno en el precipitado y sobrenadante no se degradó significativamente después de la centrifugación, lo que indicó que l.......
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Discusión
IsdB, una proteína de superficie bacteriana anclada a la pared celular y regulada por hierro, juega un papel importante en el proceso de obtención de hierro hemo15. Hla, toxina alfa, es una de las toxinas bacterianas más efectivas conocidas en MRSA, y puede formar poros en células eucariotas e interferir con la adhesión y las células epiteliales16. En nuestro estudio, se construyó una nueva proteína de antígeno MRSA (HI) de recombinación y se expresó con t.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses en este trabajo.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por el No. 2021YFC2302603 del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China, el No. 32070924 y 32000651 del NSFC, y el No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Programa de Proyectos de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5424-Centrífuga pequeña de alta velocidadFA-45-24-11 | Eppendorf, Alemania | ||
| placas de 96 pocillos | Corning Incorporated, EE. UU. | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Alemania | ||
| Lámpara de alcohol | Shenzhen Yibaxun Technology Co., China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c ratones | Beijing HFK Bioscience Co., Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 Lector de microplacas | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, EE. UU | ||
| BL21 Célula competente | Merck millipore, Alemania | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, EE. UU. | B2064-100G | |
| Centrífuga 5810 R | Eppendorf, Alemania | ||
| Coomassie azul brillante G-250 solución de tinción | MIKX, China | DB236 | |
| Solución de decoloración | BOSTER, China | AR0163-2 | |
| Cultivador de temperatura estacionaria de electrocalentamiento HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Fábrica de dispositivos médicos, China | null | |
| Aparato de electroforesis | Fábrica de instrumentos Beijing Liuyi, China | DYCZ-25D Imagen | |
| gel | Tanon, EE. UU | nula | |
| de glutatión-sepharose GST | Mei5bio, China | cromatografía de afinidad | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| Proteína recombinante HI | Tercera Universidad Médica Militar,China | 110-27-0 | |
| HRP -Cabra anti-ratón IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Cabra anti-ratón IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Cabra anti-ratón IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Cabra anti-ratón IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Bucle de inoculación | Haimen Feiyue Co., LTD, China | YR-JZH-1UL | |
| Clones de IsdB y Hla | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | ||
| nulo Nuez moscada de isopropilo (adyuvante farmacéutico) | SEPPIC, Francia | nulo | |
| isopropil- β-D-1-mercaptogalactopiranósido | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB caldo medio de cultivo | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lámpara de fisioterapia Lnfrared | Guangzhou Runman Medical Equipment Co., China | 7600 | |
| Centrífuga refrigerada de baja temperatura | Eppendorf, Alemania | ||
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., Reino Unido | null | |
| MH (A) medio | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD, China | 02-051 | |
| MH (B) medio | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD, China | 02-052 | |
| Micro lavadora de placas 405 LSRS | Bio Tek Instruments, Inc Highland Parque, EE | ||
| null Mini-TBC Instrumento de transferencia de película compacta | BeiJingDongFangRuiLi Co., LTD, China | 1658030 | |
| Embalaje MMC | TOSOH (SHANGHAI) CO., LTD | ||
| MRSA252 | EE. UU., ATCC | nulo | |
| Espectrofotómetro ultravioleta Nanodrop | Thermo Scientific, EE | ||
| null Nueva proteína FlashTM cualquier KD PÁGINA Kit de gel de electroforesis de proteínas | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, PCR | nulo | |
| , | termociclador amplificador, | nulo | |
| Shanghai Jereh Biotechnology Co, China | B3528G | ||
| Ácido fosfotúngstico | G-CLONE, China | Pipeta CS1231-25g | |
| Eppendorf, Alemania | |||
| aceite de ricino polioxietilado (adyuvante farmacéutico) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Laboratorio de anticuerpos primarios | Hecho en casa:De ratones inmunizados con sueros positivos | nulos | Consulte la Referencia 11 para obtener más detalles |
| Propilenglicol (adyuvante farmacéutico) | Sigma-Aldrich, EE. UU. | P4347-500ML | |
| Marcador de proteínas | Thermo Scientufuc, EE. UU. | 26616 | |
| MEMBRANA DE TRANSFERENCIA DE PVDF | Invitrogen, EE. UU. | 88518 | |
| Microscopio electrónico de barrido | JEOL, Japón | JSM-IT800 | |
| Pentobarbital sódico | Merck, Alemania | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, EE. UU | nula | |
| solución de color TMB | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Kits de tortuga | Xiamen Bioendo Technology Co., LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
Referencias
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epide....
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Reimpresiones y permisos
