Aquí, describimos una mejora del método semi-in vitro (SIV) para observar la guía y recepción del tubo polínico en Arabidopsis thaliana, lo que aumenta la receptividad de los óvulos. El método SIV cum septum de alto rendimiento puede combinarse con líneas marcadoras de gametofitos y biosensores codificados genéticamente para monitorear el proceso dinámico de fertilización.
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Artículo de método
Imágenes en vivo de la recepción del tubo polínico de Arabidopsis y la doble fertilización utilizando el método semi-in vitro cum septum
En este artículo
Resumen
Resumen
En las plantas con flores, el crecimiento y la guía del tubo polínico (gametofito masculino) dentro del pistilo y la recepción del tubo polínico por el gametofito hembra son esenciales para la doble fertilización y el posterior desarrollo de la semilla. Las interacciones entre los gametofitos masculinos y femeninos durante la recepción del tubo polínico culminan en la ruptura del tubo polínico y la liberación de dos espermatozoides para efectuar una doble fertilización. Como el crecimiento del tubo polínico y la doble fertilización están profundamente ocultos dentro de los tejidos de la flor, este proceso es difícil de observar in vivo.
En varias investigaciones se ha desarrollado e implementado un método semi-in vitro (SIV) para la obtención de imágenes de células vivas de fertilización en la planta modelo Arabidopsis thaliana . Estos estudios han ayudado a dilucidar las características fundamentales de cómo se produce el proceso de fertilización en las plantas con flores y qué cambios celulares y moleculares se producen durante la interacción de los gametofitos masculinos y femeninos. Sin embargo, debido a que estos experimentos de imágenes de células vivas implican la escisión de óvulos individuales, están limitados a un bajo número de observaciones por sesión de imágenes, lo que hace que este enfoque sea tedioso y lleve mucho tiempo. Entre otras dificultades técnicas, a menudo se informa de un fallo de los tubos polínicos para fertilizar los óvulos in vitro , lo que confunde gravemente tales análisis.
Aquí, se proporciona un protocolo de video detallado para la obtención de imágenes de la recepción y fertilización del tubo polínico de manera automatizada y de alto rendimiento, lo que permite hasta 40 observaciones de la recepción y ruptura del tubo polínico por sesión de imágenes. Junto con el uso de biosensores codificados genéticamente y líneas marcadoras, este método permite la generación de grandes tamaños de muestra con una inversión de tiempo reducida. Los matices y puntos críticos de la técnica, incluida la estadificación floral, la disección, la preparación del medio y las imágenes, se detallan claramente en formato de video para facilitar futuras investigaciones sobre la dinámica de la guía, recepción y doble fertilización del tubo polínico.
Introducción
La generación de descendencia genéticamente única en organismos que se reproducen sexualmente depende de la fusión exitosa de gametos masculinos y femeninos. En las plantas con flores, la interacción de dos gametos masculinos (espermatozoides) con dos gametos femeninos (óvulo y célula central) durante la doble fertilización depende de la liberación de espermatozoides del tubo polínico (el gametofito masculino). Este proceso, llamado recepción del tubo polínico, está controlado en gran medida por las células sinérgicas que residen dentro del saco embrionario (el gametofito femenino)1,2. Como la recepción del tu....
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Protocolo
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de los materiales y equipos utilizados en este protocolo.
1. Consideraciones para diseñar el experimento de imágenes
- Predetermine la duración de la imagen y la frecuencia de muestreo requerida para capturar el fenómeno deseado a observar. Por ejemplo, siguiendo el teorema de muestreo de Nyquist, la frecuencia de muestreo debe ser mayor que el doble de la frecuencia más alta de la muestra de entrada. Por lo tanto, para capturar con precisión las oscilaciones sinérgicas [Ca2+]cyt , realice imágenes aproximadamente cad....
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Resultados
Para evaluar el momento de la degeneración nuclear en el sinérgico receptivo con respecto a la ruptura del tubo polínico en Arabidopsis , así como para observar si el sinérgico izquierdo o derecho está predestinado a convertirse en el sinérgico receptivo, se empleó el método SIV cum septum descrito aquí utilizando un marcador nuclear gametofito hembra apilado con un marcador citosólico sinérgico (pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) como donante de tabique y marcador de gametofito masculin.......
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Discusión
Este manuscrito introduce un protocolo eficiente para la obtención de imágenes de la recepción del tubo polínico y la doble fertilización en Arabidopsis. El método mejorado, SIV cum septum, aumenta en gran medida el porcentaje y el número total de eventos exitosos de recepción del tubo polínico que son observables por sesión de imagen. Los resultados representativos que se muestran aquí demuestran una sesión de imagen con 41 eventos exitosos de recepción del tubo polínico y 10 óvulos que muestran defect.......
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Divulgaciones
Los autores no informan conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a Sara Simonini y Stefano Bencivenga por donar la construcción pFG:roGFP2-ORP1-NLS y a Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter y Celia Baroux por sus consejos sobre microscopía. Agradecemos amablemente el consejo de Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima y todos los demás en la Conferencia Internacional sobre Reproducción Sexual de Plantas 2022 que mostraron interés en un protocolo sobre SIV cum septum. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Zurich y subvenciones de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias a la U.G.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Corredera de vidrio de 1 mm | Epredia | ||
| plato con fondo de vidrio de 35 mm (pozo de 14 mm) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Cloruro de calcio | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | donante de estigma | |
| Alcance de disección | Olimpo | SZX2-ILLT | |
| Aguja de insulina (0,3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | donante de septum | |
| Sulfato de magnesio | Merck | 5886 | |
| Cloruro de potasio | Roth | 6781.1 | |
| Hoja de afeitar | Beldura | 7026797 | |
| Cinta adhesiva de doble cara escocesa | Scotch | 768720 | Menos espeso y bueno para la disección del estigma |
| Cloruro de sodio | Roth | 3957.1 | |
| Reactivos de sacarosa | ITW | A2211,1000 | |
| Tesa cinta de doble cara | Tesa | 05681-00018 | Muy pegajoso y bueno para la disección del tabique |
| Agarosa a temperatura de gelificación ultra baja | FMC SeaPrep | 50302 |
Referencias
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control ....
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Reimpresiones y permisos
