Imágenes de calcio en el colículo superior de ratón

Resumen

Este protocolo detalla el procedimiento para obtener imágenes de las respuestas de calcio en el colículo superior (SC) de ratones despiertos, incluida la obtención de imágenes de la actividad de una sola neurona con microscopía de dos fotones mientras se deja la corteza intacta en ratones de tipo salvaje, y la obtención de imágenes de todo el SC con microscopía de campo amplio en ratones mutantes de corteza parcial.

Resumen

El colículo superior (SC), una estructura evolutivamente conservada del mesencéfalo en todos los vertebrados, es el centro visual más sofisticado antes de la aparición de la corteza cerebral. Recibe entradas directas de ~ 30 tipos de células ganglionares de la retina (RGC), cada una de las cuales codifica una característica visual específica. Sigue siendo difícil de entender si el SC simplemente hereda las características de la retina o si se produce un procesamiento adicional y potencialmente de novo en el SC. Para revelar la codificación neuronal de la información visual en el SC, proporcionamos aquí un protocolo detallado para registrar ópticamente las respuestas visuales con dos métodos complementarios en ratones despiertos. Un método utiliza la microscopía de dos fotones para obtener imágenes de la actividad del calcio con una resolución de una sola célula sin ablacionar la corteza superpuesta, mientras que el otro utiliza la microscopía de campo amplio para obtener imágenes de todo el SC de un ratón mutante cuya corteza está en gran parte subdesarrollada. Este protocolo detalla estos dos métodos, incluida la preparación de animales, la inyección viral, la implantación de la placa de cabeza, la implantación del tapón, la adquisición de datos y el análisis de datos. Los resultados representativos muestran que las imágenes de calcio de dos fotones revelan respuestas neuronales evocadas visualmente a una resolución de una sola célula, y las imágenes de calcio de campo amplio revelan actividad neuronal en todo el SC. Al combinar estos dos métodos, se puede revelar la codificación neuronal en el SC a diferentes escalas, y dicha combinación también se puede aplicar a otras regiones del cerebro.

Introducción

El colículo superior (SC) es un centro visual importante en todos los vertebrados. En los mamíferos, recibe información directa de la retina y la corteza visual¹. Si bien el registro óptico se ha aplicado ampliamente a la corteza 2,3,4,5, su aplicación en el SC se ve obstaculizada por accesos ópticos deficientes 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices de bienestar animal y fueron aprobados por la IACUC en el Instituto Chino de Investigación del Cerebro, Beijing.

NOTA: El cronograma para este protocolo es el siguiente: 1) hacer la ventosa; 2) inyectar el virus; 3) implantar la placa de la cabeza; 4) después de 3 semanas, implantar el tapón; 5) Después de una recuperación de ~ 3 días y habituación en la cinta de correr, realice imágenes de dos fotones / campo amplio.

1. Preparación de una ventosa (Figura 1A)

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Resultados

Las figuras 1A, B muestran cómo hacer la ventosa y los tapones, respectivamente. La figura 2 muestra cómo implantar el tapón con éxito. Después de implantar el tapón, el SC posterior-medial queda expuesto, como se muestra en la Figura 2D. La Figura 3 muestra las respuestas de calcio de las neuronas SC de un ejemplo de ratón de tipo salvaje fotografiado mediante microscopía de dos fotone.......

Discusión

Pasos críticos en el protocolo
El paso más crítico es la craneotomía en los pasos 5.2 y 5.3. En primer lugar, el hueso a 0,5 mm posterior a la lambda es grueso y tiene vasos sanguíneos en su interior, lo que puede causar sangrado durante el proceso de perforación. Se debe preparar una espuma de gel adecuada para detener el sangrado. En segundo lugar, existe una buena probabilidad de angiorrexis cuando se extirpa el hueso justo por encima del seno transverso. Para la resolución de problemas, un enfoque.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Objetivo 16x	Lente Nikon
de 50 mm	Computar	M5018-MP2
cubreobjetos de 5 mm	Warner instruments	CS-5R
filtro de paso de banda Chroma	Technology	HQ575/250 m-2p
cianoacrilato de butilo	Vetbond, cámara de World Precision Instruments
para la monitorización de la pupila	Cámara FLIR	BFS-U3-04S2M-CS
para imágenes de campo amplio	Basler	acA2000-165µ m
tratador de corona	Electro-Technic Products	BD-20AC
dicroico	Chroma Technology	T600/200dcrb
galvanómetros	Cambridge Technology
esterilizador de perlas de vidrio	RWD	RS1502
microtaladro	RWD	78001
micromanipulador	Sutter Instruments	QUAD
tubo fotomultiplicador	Hamamatsu	R3896
codificador rotorial	USdigital	MA3-A10-125-N
cemento de resina adhesivo dental autopolimerizable	SuperBond C& B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japón
almohadilla térmica termostática	RWD	69020
Ti:Láser de zafiro	Spectra-Physics	Mai Tai HP DeepSee
adhesivo de silicona translúcida	Kwik-Sil, World Precision Instruments
cinta de correr	Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m	Vector Core en el Instituto Chino de Investigación del Cerebro, Beijing
Animals
C57BL/6J tipo salvaje	Centro de Recursos para Animales de Laboratorio en el Instituto Chino de Investigación del Cerebro, Beijing
Emx1-Cre	El Laboratorio Jackson	5628
Pals1flox/wt	Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ	NIH Image
Labview	National Instruments
MATLAB	Mathworks